一种玉米籽粒体积突变体ks及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程和分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种玉米己糖转运蛋白基因(zmsweet4)缺失的玉米籽粒体积突变体ks及其应用。
背景技术：
：玉米是我国重要的粮食作物和典型的c4类模式植物，在粮食生产和单子叶植物功能基因组学研究中具有重要地位。随着全球玉米需求的快速增长，玉米在国民经济中的地位日益凸显。世界各国对玉米的需求量逐年增加，玉米消费结构发生了根本性变化，即由解决温饱的主要粮食作物，逐渐发展成为禽畜饲料、工业原料、餐桌副食、能源作物的多样化格局。特别是近年来再生能源与精深加工领域赋予了玉米新的内涵，使得玉米的工业加工比例迅速增长，多元需求使玉米成为21世纪举足轻重的战略资源。因此，玉米产量将直接影响到畜牧、轻工、能源及其相关行业的发展，关系到国家粮食安全以及人民生活水平的提高，在经济发展中具有特别重要的地位。如何提高玉米的产量，是我国目前迫切需要解决的重大课题。除了优化种植环境和条件外，从作物自身的遗传因素入手，解析影响产量的遗传因子及其作用分子机理，也是进行农作物产量遗传改良的重要基础。高产是玉米遗传改良研究的一个永恒主题，而籽粒(种子)大小是与玉米产量指标相关的一个重要性状。因此，研究调控籽粒大小的分子机理和寻找控制籽粒大小的基因，对提高玉米产量具有非同寻常的意义。近年来，随着分子生物学和基因组学研究技术的迅速发展，通过图位克隆、转座子标签等方法，已经鉴定并克隆了一些控制玉米籽粒发育的基因。1996年，cheng等报道miniature1编码一个细胞壁转化酶的同工酶，该酶在胚乳的发育中活性增加，该基因突变体的籽粒重量与野生型相比，减少了30％以上(chengetal.,1996)。另一个影响种子大小的基因rgf1，其突变将会影响籽粒的填充，使籽粒基部连接母体的部分发育异常，转移层细胞中基因表达减少，最终胚乳变小，产生小种子(maitzetal.,2000)。另有ppr2263基因编码一个含有dyw结构域的ppr蛋白，此蛋白在nad5和cob转录后的rna编辑中起作用，该基因突变也会导致小籽粒的产生(sossoetal.,2012)。li等也发现玉米smk1基因编码定位于线粒体中的e类ppr蛋白，该基因的突变会阻遏胚及胚乳的发育，从而导致种子变小(lietal.,2014)。此外，番茄的fw2.2基因在玉米中的同源基因家族cnrs(cellnumberregulation)也会影响种子的发育，该家族基因含有一个富含半胱氨酸的保守基序，通过影响细胞的数目从而影响种子器官的大小。过表达该家族的cnr1基因会导致籽粒变小，而抑制或者敲除该基因能够使籽粒显著增大(guoetal.,2010)。在模式植物拟南芥和水稻中，对控制种子大小的基因也有一些研究。拟南芥的ant和argos是两个研究的相对较为清楚的基因，它们通过改变细胞数目来影响种子器官的大小。其中，ant是一个含有ap2结构域的转录因子，而agros基因则通过作用于位于其上游的ant基因来影响种子器官的大小。过表达ant和argos都会导致种子器官的增大(elliottetal.,1996；krizeketal.,1999)。另外，与argos不同的是argos-like基因主要通过改变细胞的大小来影响种子的大小(huetal.,2006)。近年来，在水稻中也克隆到了控制种子大小的基因，例如：gs3(fanetal.,2006,2009；lietal.,2004)、gw2(songetal.,2007)、qsw5/gw5(wanetal.,2008；wengetal.,2008；shomuraetal.,2008)、gl3.1(qietal.,2012)等，这些基因均可以通过不同作用机理调控水稻种子器官的大小，但其中大部分是负调控因子。gs3和gw2在玉米中的同源基因zmgs3和zmgw2也被证实与玉米产量决定因素有关联(lietal.,2010a；lietal.,2010b)。最近由张启发院士实验室克隆的gs5基因在调控水稻种子的大小和产量方面起着重要的作用，且实验证明该因子是一个正调控因子，并编码一个预测的丝氨酸羧肽酶，该基因过表达株系的种子与对照相比明显增大(lietal.,2011)。sweet(sugarswilleventuallybeexportedtransporters)蛋白是一个结构保守、不依赖能量的糖转运蛋白，具有蔗糖、果糖转运体的作用(yuan等2010)。有数据表明sweet基因参与多种生理过程，包括韧皮部装载、调控生殖发育、参与宿主-病原体互作的抗病反应和胁迫反应、离子转运等。目前模式植物中,拟南芥有17个sweet家族成员，水稻有21个家族成员(chen等2010；xuan等2013)。sweet基因编码的糖转运蛋白，负责将韧皮部运输的糖类转运至周边的库器官，因此参与调控种子的灌浆过程。可溶性糖向发育中种子的转运能力决定了细胞的大小和数目，并最终影响种子的大小。sosso等人报道的zmsweet4c基因的mu转座子插入突变导致籽粒皱缩、果皮空瘪、育性降低，而ks突变体仅表现为籽粒体积变小且育性正常，说明zmsweet4c基因突变与zmsweet4基因簇突变存在差异。通过研究该突变基因的功能并对基因的表达规律进行分析，可以为玉米产量的遗传改良提供新的思路，为分子育种提供基因元件。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种玉米籽粒体积突变体ks及其应用。为解决上述技术问题，本发明所述的一种玉米籽粒体积突变体ks，其为玉米己糖转运蛋白基因zmsweet4家族成员zmsweet4c起始密码子atg下游(不含atg)第913个碱基起至zmsweet4b的起始密码子atg下游(不含atg)第481碱基之间的序列缺失，缺失片段为137,868个碱基。所述的玉米籽粒体积突变体ks，包含如seqidno.2所示的氨基酸序列。所述的玉米籽粒体积突变体ks，其氨基酸序列如seqidno.2所示。本发明还公开了一种编码所述的玉米籽粒体积突变体ks的突变基因，包含如seqidno.1所示的核苷酸序列。所述的编码所述的玉米籽粒体积突变体ks的突变基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明还公开了一种含有所述的突变基因的表达载体，所述表达载体为pbi121-ks。本发明还公开了一种含有所述的表达载体的重组菌。本发明还公开了一种构建所述的重组菌的方法，包括将所述的表达载体导入农杆菌宿主菌株，以使所述表达载体在所述宿主中有效表达的步骤。本发明还公开了所述的玉米籽粒体积突变体ks在培育大籽粒转基因经济作物领域中的应用。本发明还公开了所述的玉米籽粒体积突变体ks在经济作物育种改良领域中的应用。所述育种改良是指提高玉米籽粒的体积。本发明所述方案从玉米突变体ks中克隆了编码基因，并验证了该基因可以调控玉米籽粒灌浆过程从而影响籽粒大小，经试验，将该基因簇在普通玉米中进行超表达，在超表达转基因植株中，籽粒产量明显高于对照，可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物。本发明所获得基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源，在玉米种质资源的遗传改良育种中作用重大。附图说明为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，图1是突变体ks与相应野生型对照果穗；其中，wt为野生型对照，中间为f1代果穗，f2代表ks与wt杂交一代f1自交后的果穗；图2是玉米淀粉粒的扫描电镜观察结果；其中，a为野生型玉米籽粒胚乳致密部位淀粉粒结构；b为突变体ks玉米籽粒胚乳致密部位淀粉粒结构；c为野生型玉米籽粒胚乳疏松部位淀粉粒结构；d为突变体ks玉米籽粒胚乳疏松部位淀粉粒结构；图3为绘制的遗传连锁图谱；图4是转基因玉米与野生型对照籽粒照片；control为未转基因的对照材料，t为超表达pbi121-ks的转基因材料。具体实施方式本发明下述实施例中，生物材料、试剂及设备的来源包括：玉米b73购自美国maizegeneticscooperationstockcenter；大肠杆菌(e.coli)dh5α和bm25.8、质粒ptriplex2、pmd18-t均购自promega公司；载体pbi121购自clontech公司；amylose/amylopectin试剂盒购自megazyme公司；dna凝胶回收试剂盒、dna限制性内切酶、t4dna连接酶、extaq酶、dnabluntingkit、dnamarkerdl2000+15000购自宝生物大连有限公司(takara产品)；trizol试剂(no.15596-026)购自lifetechnologies公司；扫描电镜使用jsm-6610lv型，购自日本电子公司；全自动蛋白分析仪bnii型，购自德国西门子公司；pcr反应使用2720thermalcycler基因扩增仪，购自appliedbiosystems公司；琼脂糖凝胶电泳使用uvpgeldocumentation凝胶分析系统，购自gene公司；琼脂糖凝胶电泳使用dyy-8c型电泳仪，购自北京六一仪器公司。下述实施例中所采用的pcr、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法如无特殊说明均可按记载于《分子克隆实验指南第三版》中((美)j.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理与技术》中(王关林，方宏笃著，科学出版社，1998)记载的方法操作。实施例1突变体材料的获得2000年在大田常规育种过程中发现一个小籽粒自然突变体，命名为ks(kernelsmall)，将该突变自交后发现f1代全部为小籽粒，又将ks与其他不同玉米自交系(b73、昌7-2、郑958及齐319)杂交后f1代自交得到的f2代，籽粒出现两种表型，一种与正常亲本的一致，另一种体积与正常亲本相比明显变小，并且分离比例符合3：1。无论正反交结果一致，不同地点、年份性状稳定。在不同的遗传背景下，ks均表现为籽粒体积变小，所以ks基因突变直接导致籽粒体积变小。该突变体的性状经过多代自交已稳定遗传，在大田条件下观察和比较突变体与野生型整个生长周期植株形态，发现无明显差异，仅出现籽粒体积变小的性状。本发明所采用的野生型及突变体的遗传背景均为自有自交稳定材料98pc15。实施例2籽粒表型鉴定1、籽粒外形对照选择有代表性的野生型果穗和本发明突变体ks果穗，其外型对照见附图1所示。其中，左侧wt为野生型果穗，中间为f1代果穗，右侧ks为突变体ks果穗。2、内部结构扫描电镜观察选择有代表性的野生型籽粒和本发明突变体ks籽粒，籽粒经干燥后，在籽粒中部轻轻敲击，使其在自然状态下纵向断裂，去掉两端，制成约2mm左右的横断面，用双面胶带粘在样品台上，在离子溅射仪上喷金镀膜，用jsm-6610lv型扫描电镜，在15kv加速电压下观察籽粒断层结构，并选择在同一放大倍数下拍照，结果见图2所示。3、胚重比的测定将60粒饱满籽粒，用水浸泡(在室温下浸泡36h左右，至玉米吸水充分而不发芽为度)。把泡好的玉米籽粒的胚小心地剥离、分开(注意保留胚的完整)，自然风干至恒重。分别称重玉米籽粒的胚和非胚部分，得胚总重和非胚部分总重。经计算，可获得胚重比，野生型和突变体籽粒的胚重比结果见下表1。胚重比，指胚重占籽粒总重的百分率。计算方法：籽粒总重量＝胚总重量+去胚后余下部分总重量，胚重比＝总胚重/总籽粒重。图1胚重比结果胚干重(mg/kernel)籽粒干重(mg/kernel)胚在籽粒中比值(％)野生型wt21.26224.539.47突变体ks11.82173.146.834、籽粒中淀粉、蛋白质、脂肪含量及千粒重的测定淀粉含量测定：采用amylose/amylopectin试剂盒(megazyme)，主要测量了直链淀粉/支链淀粉的比例，并计算出总淀粉含量，步骤详见说明书。新鲜材料使用0.1-0.2g材料，液氮冷冻研磨后测量。蛋白质含量测定：采用全自动蛋白分析仪法测定。称取0.39(精确至0.00019)己碎成80目的玉米粉于250ml消化管内，加入12ml浓硫酸，8g硫酸铜与硫酸钾(1:10)混合消化剂，置420℃消化炉上加热，至溶液呈蓝色澄清透明后，再继续加热30min，放冷，设定好程序，全自动蛋白分析仪测定。c：盐酸的浓度(mol/l)；v：样品滴定消耗盐酸体积(ml)；v：空白滴定时消耗盐酸的体积(ml)；6.25：换算系数；0.014：氮摩尔质量(g)；m：样品质量(g)。籽粒脂肪含量测定：玉米籽粒脂肪含量测定按照gb/t24902-2010标准测定。千粒重：按照常规方法分别测定野生型wt和突变体ks的千粒重。具体测定结果见下表2、3所示。表2籽粒中淀粉、蛋白质和脂肪含量测定结果样品名称wtks蛋白质含量12.9％15.17％总淀粉含量70.15％68.13％直链淀粉含量18.37％17.93％脂肪含量3.6％2.3％表3籽粒千粒重测定结果样品名称(g)wtks千粒重227346实施例3玉米籽粒体积突变体ks突变基因的获得1、分离群体的构建在籽粒大小突变基因遗传分析的同时，已经进行了分离群体的构建，进行基因标记时b73×ks的f2群体。每个群体各分别选取正常籽粒和小籽粒各60粒，萌发出苗。每株幼苗取一个幼嫩叶片，进行dna的制备。同时取亲本叶片，进行亲本dna的制备。2、玉米基因组总dna的提取纯化及dna池的创建dna的提取按mccouch等(1998)方法并加以改进，去除rna并用标准量λdna进行定量。在分离群体中各取30株正常粒、小粒的dna等量混合，组成dna分析的基因池(bulkn，bulks)。3、ssr标记分析ssr引物从玉米基因组数据库(http://www.maizegdb.org)选取，遵循染色体和bin位点均匀分布，同一bin位点短序列优先原则，总共选取214对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ssr反应基本按照bassam等(1991)报道的方法并加以改进，pcr扩增30个循环，延伸5min，4℃保存，ssr产物用6.0％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，80w恒功率下约2h，凝胶经银染后观察记载带型。所述pcr反应体系如下：4、遗传连锁分析根据所选择的ssr引物在正常和突变池间筛选的情况，对那些在两池之间表现多态性、稳定的ssr标记，在f2代群体中各单株进行pcr扩增，统计各单株的籽粒体积性状及对应的ssr多态性结果。用软件mapmaker3.0(landeretal.,1987)对f2群体各单株的ssr标记分离数据进行连锁分析，并使用kosambi作图函数(kosambi，1944)将重组值转换为遗传图距(cm)。根据刘仁虎和孟金陵(2003)编辑的软件绘制遗传连锁图谱，如图3所示。5、突变基因精细定位根据分子标记定位结果，将突变基因定位在5号染色体126858000至127642404之间。该区间有三个编码基因，分别为zmsweet4a，zmsweet4c和zmsweet4b，对三个基因进行克隆测序，发现在野生型和突变体中，zmsweet4a没有差别，而在突变体ks中zmsweet4c启动子序列完整，cdna序列扩增不出，下游的zmsweet4b启动子序列扩增不出，cdna序列可以部分扩增。6、chromium测序技术chromium测序技术委托北京博奥晶典生物技术有限公司完成。首先提取野生型和突变体ks叶片的dna，通过10xgenomics的barcode技术进行文库构建，之后利用illumina测序仪进行测序。从illumina测序得到的原始bcl文件利用格式转换软件转换成带有(barcode)条形码标记的fastq文件，之后对包含(barcode)条形码的fastq文件进行质控，通过lariat比对到参考基因组(http://ftp.maizegdb.org/maizegdb/ftp/b73_refgen_v3/)，利用比对的结果进行snv/indel的检测、分相以及sv的检测。根据测序结果，突变体ks与野生型相比存在一处大片段缺失，位于第5号染色体127502048至127639916区间，结合精细定位结果，确认突变基因ks为玉米己糖转运蛋白基因4(zmsweet4)家族成员zmsweet4c起始密码子atg下游(不含atg)第913个碱基起至zmsweet4b的起始密码子atg下游(不含atg)第481碱基之间的序列缺失，缺失片段为137,868个碱基，其氨基酸序列如seqidno.2所示。实施例3转基因玉米的获得及其检测1、重组表达载体的构建取2μl上述实施例2获得的玉米ks蛋白编码基因ks与pmd18-t载体进行连接，操作步骤按promega公司产品pmd18-tvectorsystem说明书进行。然后转化大肠杆菌dh5α菌株，转接于表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷和x-gal的含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb平板上培养过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基中培养过夜并进行菌落pcr鉴定；同时碱法提取质粒dna进行序列测定，制得重组pmd18-t载体；用限制性内切酶xbai和限制性内切酶saci酶切重组pmd18-t载体，然后与经限制性内切酶xbai和限制性内切酶saci酶切的载体pbi121连接。连接产物转化dh5α细胞，然后在含卡那霉素(50μg/ml)的lb固体平板上培养，对菌落进行pcr鉴定和质粒dna的酶切分析；制得重组表达载体pbi121-ks。将重组表达载体pbi121-ks转化农杆菌lba4404的感受态细胞。2、转基因玉米的获得材料：采用玉米hi2杂种未成熟合子胚，即在授粉后8-12d取1.0-2.0mm大小的幼胚为实验材料。菌株培养：挑取转入重组表达载体pbi121-ks的农杆菌的单克隆接种于含50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，28℃培养至od600值约0.6左右，4℃，4000r/min离心收集菌体，用ms培养基重悬洗涤菌体，最后将农杆菌稀释为od600约0.3左右。侵染：幼肧预培养后，使用ms洗涤一次，然后浸入制备好的菌液，轻微振荡30s，静置5min，用灭菌滤纸吸干表面菌液，放到ms培养基上，28℃黑暗条件下共培养3d。筛选，愈伤诱导，分化培养及生根培养：将共培养3d后的幼肧转移至含有50mg/lkan(卡那霉素)筛选培养基上培养2周，更换100mg/lkan(卡那霉素)筛选培养基筛选及愈伤诱导8-12周，然后将抗性愈伤转移至分化培养基上，诱导愈伤分化，培养4-6周后，转移至生根培养基上，诱导生根。培养基配方：筛选培养基：n6盐+b5有机+2mg/l甘氨酸+2.5mg/l2,4-d+10mg/lagno3+30g/l蔗糖+8g/l琼脂，ph5.8；分化培养基：n6盐+b5有机+2mg/l甘氨酸+1.0mg/l6-ba+30g/l蔗糖+8g/l琼脂，ph5.8；生根培养基：1/2ms盐+b5有机+2mg/l甘氨酸+1.0mg/liba+15g/l蔗糖+6g/l琼脂，ph5.8。收获该当代转基因玉米植株所结的种子(t1代)，在含有50mg/lkan(卡那霉素)的ms培养基筛选萌发的种子。将萌发的t1代幼苗移到培养土中，收获种子(t2代)，然后经相同的筛选过程得到纯合的t3代转pbi121-ks的转基因玉米种子。对t1代转基因玉米进行转基因植株鉴定，包括：抗性培养基初步筛选、pcr扩增进一步筛选阳性植株、west-blotting鉴定阳性植株。所述pcr扩增进一步筛选阳性植株的pcr引物如下：上游引物：14_f:gaacagcatacgccgta；下游引物：15_r:cagatgccgttcacc。最终从通过west-blotting鉴定得到阳性植株中选出条带清晰的株系，收获其种子，制得转基因玉米种子，进行表型鉴定，转基因玉米与野生型对照籽粒如图4所示。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。序列表<110><120>一种玉米籽粒体积突变体ks及其应用<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1228<212>dna<213>zeamaysl.<400>1ccttgggcgccctgttttcttcctcccgcccgatacatttctcgtacatcgctctcgctc60tcgctctctctcctgctgtccacgaccgaccaaaggcgccgggcacagactcttcgtcgg120atccaagagaagctcgcgccctccccgaccatggtctcggcggataccatccgtacggct180atcggcgtcatcggcaatggcaccgcccttgtgctcttcctctccccggtgcccaccttc240gtgggcatctggaagaagcgtgcggtggagcagtactcgccgatcccgtacgtggcgacg300ctgctgaactgcatgatgtgggtgctgtacgggctgccgctggtgcacgtgttgtacggg360ctgccgctggtgcacccgcacagcatgctggtgatcaccatcaacggcaccggcatgctc420atccagctgacctacgtggcgctcttcctcgtctactccgcgggggcggcgcgccgcaag480gtgtccctcctgctggccgccgaggtcgccttcgtcggcgccgtcgccgcgctggtgctc540gccctggcgcacacccacgagcgcaggtccatggtggtcggcatcctctgcgtcctcttc600ggcaccggcatgtacgccgcgccgctctccgtcatgaaaatggtgatccagacgaagagc660gtggagtacatgccgctgttcctgtcactggcttccctggtgaacggcatctgctggacc720gcctacgcgctcatccgcttcgacctctacatcaccatccccaacgggctgggcgtgctg780ttcgcgctggcgcagctgctcctgtacgccatctactacaagaacacccagaagatcgtg840gaggcacgcaagcgcaaggcgggccaggtcgccatgacggaggtggtcgtcgacggcagc900agggcctccaacaacaacaacaacggcggcagcggcacctactgatgatgatgagtacga960cgtaatattgtgcatggtgaccacgccaacacaacaccaagcaacacggggggccaacgc1020caacgccgtgtgtatctagcactagcaagcgtccttcttcctgacgaagggatgatctat1080gcatcttaagcagccgtcgtcttcttcttcttcttctgttaatccctagcttttattttc1140tccatgcttcctagtaacgaagctttgcccactgattattagtacttatatgttgaatca1200taatattacgacctcggcagcccaaaca1228<210>2<211>271<212>prt<213>zeamaysl.<400>2metvalseralaaspthrileargthralaileglyvalileglyasn151015glythralaleuvalleupheleuserprovalprothrphevalgly202530iletrplyslysargalavalgluglntyrserproileprotyrval354045alathrleuleuasncysmetmettrpvalleutyrglyleuproleu505560valhisvalleutyrglyleuproleuvalhisprohissermetleu65707580valilethrileasnglythrglymetleuileglnleuthrtyrval859095alaleupheleuvaltyrseralaglyalaalaargarglysvalser100105110leuleuleualaalagluvalalaphevalglyalavalalaalaleu115120125valleualaleualahisthrhisgluargargsermetvalvalgly130135140ileleucysvalleupheglythrglymettyralaalaproleuser145150155160valmetlysmetvalileglnthrlysservalglutyrmetproleu165170175pheleuserleualaserleuvalasnglyilecystrpthralatyr180185190alaleuileargpheaspleutyrilethrileproasnglyleugly195200205valleuphealaleualaglnleuleuleutyralailetyrtyrlys210215220asnthrglnlysilevalglualaarglysarglysalaglyglnval225230235240alametthrgluvalvalvalaspglyserargalaserasnasnasn245250255asnasnglyglyserglythrtyrzzzzvalargarg260265270当前第1页12