一种多肽及其应用的制作方法

本申请属分案申请。

原申请申请日：2016年07月07日，申请号：201610528672.9，发明名称：一种多肽及其应用。

本发明涉及一种多肽及其应用。

背景技术：

在养猪生产中，所有猪出生后都需要断脐，大部分仔猪都会断尾，一半的猪需要去势，同时要面临合群争斗、咬尾，机械损伤，疝气、脱肛缝合手术等。若养猪生产中不及时对产生的伤口进行处理，将引起细菌、病毒等病原体的感染，可引发局部炎症、红肿以及并发病症，从而影响猪生长性能、胴体质量下降甚至造成死亡。尤其母猪产后伤口不及时处理，往往易引发母猪子宫炎、阴道炎等炎症，造成屡配不孕，孕后流产，发情时或配种前流脓等现象，直接危害种猪群的正常生产，增加种猪的淘汰率，降低种猪群的利用率。

目前，大多数猪场对于猪的小伤口不处理，有的猪场甚至阉猪、去势、缝肛、断尾、断脐时也不会对伤口进行处理，大部分猪场处理伤口也就是用碘酒、酒精甚至红花油消消毒。碘酒、酒精、红花油有消毒的作用，但同时对伤口有刺激作用，引起疼痛，并有阻碍伤口愈合的作用。还有的猪场在仔猪阉割后把抗生素撒在伤口上，能起到杀菌的作用，但并没有促进伤口快速愈合的作用，往往导致猪群疾病感染率高，抵抗力差，生长受阻。

控制母猪产后炎症是养猪生产中关键环节之一，其关系到整个猪场的生产效率和生产力。母猪产后子宫和产道都有不同程度的损伤，病原微生物极易入侵和繁殖，多数猪场采用注射抗生素或灌注抗生素类药物进行母猪产后伤口处理，但随着细菌耐药性的产生，该法难以取得十分显著的效果，而且抗生素类药物并不能快速促进伤口愈合，伤口愈合时间越长，其感染炎症的几率则越高，目前抗生素类药物已难以根本上解决母猪产后炎症等问题。

另一方面，仔猪腹泻作为养猪生产中高发病之一，是影响仔猪生长性能和仔猪成活率的重要因素之一。它具有病原种类繁多,病情复杂，高死亡率、发病持续时间长、治愈率低、反复发作等特点。从病理特征分析，不同病因引起的仔猪腹泻均伴有肠道上皮组织受损、肠绒毛脱落、小肠上皮吸收障碍等病征，从而导致肠道内积聚大量水分和电解质，粪便呈松软或液状排出。目前针对仔猪腹泻的防治，主要是从收敛和抗菌两个方面入手，很难达到有效控制和完全治愈的效果，尤其使用抗生素易产生耐药性、降低猪群生长性能等。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供具有促进伤口快速愈合、预防伤口感染引起的炎症发生、快速恢复和治愈肠道损伤，防治仔猪腹泻的多肽及其应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，

本发明之多肽，含有序列为pro-gly-ala-asp或asp-ala-gly-pro的连续氨基酸残基片段。

所述多肽优选由7-15个氨基酸残基组成。

所述多肽，优选包括以下（1）~(10)表示的任意一种氨基酸序列：

（1）ala-met-his-thr-pro-gly-ala-asp

（2）met-lys-ser-his-pro-gly-ala-asp-lys

（3）lys-pro-gly-ala-asp-met-his-ser-asp

（4）met-ser-his-pro-gly-ala-asp-lys-lys

（5）lys-met-asp-met-his-pro-gly-ala-asp-ser

（6）leu-leu-asp-ala-gly-pro-ser-his-met-ala

（7）met-arg-ser-pro-gly-ala-asp-lys-leu-lys-lys

（8）val-ala-his-ser-pro-gly-ala-asp-ala-leu-glu-gly-lys-leu

（9）ala-val-met-his-ser-pro-gly-ala-asp-leu-ile

(10)asp-phe-leu-ala-met-his-ser-pro-gly-ala-asp-leu-tyr-trp-ala。

本发明所述多肽可按照其序列结构采用多肽合成仪合成。

所述多肽可从天然植物三七、槐花、芦荟和\或白芨中提取获得。从天然植物三七、槐花、芦荟和\或白芨中提取所述多肽的方法，包括以下步骤:

（1）将植物原料三七根、或植物槐的花蕾或花朵、或芦荟叶、或白芨根茎、或其组合，切碎，匀浆，加入相当于植物原料体积5-10倍的0.04-0.06mol/l的ph为7.5-8.5的tris-hcl缓冲溶液，超声处理3~5min，离心去渣，取上清液，即植物蛋白粗提液；

（2）将步骤（1）所得植物蛋白粗提液用硫酸铵沉淀，1-4℃下放置过夜，然后离心，取沉淀，冷冻干燥，获得植物蛋白粗粉；

（3）取植物蛋白粗粉，用蒸馏水溶解，用4-5mol/l的naoh溶液调节ph为7.5-8.0，加入相当于植物蛋白粗粉重量0.5-1‰的复合酶组合物，所述复合酶组合物为碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比1:1-1:3混合；置于50-55℃恒温水浴锅中，酶解2.5-4h，酶解结束,将酶解液煮沸3~5min进行灭酶处理；然后冷却至室温，离心，取上清液，即得多肽粗提液；

（4）取多肽粗提液，用葡聚糖凝胶sephadexg25进行凝胶柱层析，用0.04-0.05mol/l的ph为7.5-8.0的tris-hcl缓冲溶液洗脱，分段收集洗脱液，并对各部分洗脱液的生物活性进行测定；

（5）收集具有活性的洗脱液部分，用反相高效液相色谱进一步纯化，获得高纯度的多肽。

所述多肽有效浓度极低，配制成水溶液，皮肤喷剂、口服液及子宫灌注剂中多肽的有效浓度为5-15μg/ml。

所述多肽制备成皮肤喷剂，具有促进伤口快速愈合的功效，有效降低伤口感染的风险；制备成口服液，能促进仔猪肠绒毛再生和修复，实现仔猪腹泻疾病的有效防治，能在3-5天内快速治愈仔猪腹泻且不再复发；制备成母猪子宫灌注剂，能促进母猪产后伤口快速愈合，有效防治母猪炎症。还可用于人皮肤外用，用于缓解皮肤炎症、真菌感染皮肤疾病及促进皮肤伤口快速愈合。

所述多肽作为饲料添加剂添加到饲料中应用，具有促进动物生长和有效预防腹泻的作用。在动物饲料中应用，动物用饲料中多肽有效含量为1~30μg/kg。

本发明经过对上千种植物进行筛选，发现三七、槐花、芦荟和白芨中含有的多种结构序列的多肽物质具有促进小鼠干细胞和血管祖细胞迁移并向血管内皮细胞定向分化的作用，从而促进血管内皮细胞的损伤修复，促进新生血管的形成。将其制备成皮肤喷剂，具有促进伤口愈合、防治炎症的作用，制备成仔猪口服液，具有促进仔猪肠绒毛再生和修复的作用，从根本上实现仔猪腹泻疾病的预防和根治。

本发明具有以下积极效果：一是所述多肽可人工合成，生产成本低，可广泛应用和开发；二是所述多肽作用机理明确，具有巨大的药用开发潜力；三是所述多肽皮肤喷剂用于猪群伤口治愈，效果十分显著，能减少猪群疾病感染风险，大大提高猪场生产水平；四是所述多肽子宫灌注剂能快速促进母猪产后子宫伤口愈合，有效减少母猪炎症的发生，提高种猪利用率，提高猪场的生产效率；五是所述多肽口服液，具有促进仔猪肠绒毛修复和再生的作用，能有效防治仔猪腹泻，提高仔猪成活率和生长性能，提升猪场经济效益；六是所述多肽有效浓度极低，使用成本低。而且该多肽为天然植物中发现，具有绿色安全、高效、无耐药性、无残留、无毒副作用的特点。

附图说明

图1和图2为实施例3中植物多肽促进小鼠血管祖细胞迁移试验中观察计算穿过0.8微米膜的迁移细胞数；*:p<0.05,**:<0.01；

图3和图4为实施例3中植物多肽促进vpc细胞向血管内皮细胞方向分化情况图；*:p<0.05,**:<0.01；

图5和图6为实施例4中血管内皮的完整性和新生内膜的形成情况图；图5为代表性图像，图6为每组六只损伤血管的血管壁内膜层＋基质层的平均相对厚度；*:p<0.05,**:<0.01；

图7和图8为实施例4中小鼠双侧后肢的血流状况图；图7为代表性图像，图8为每组六只小鼠的右侧（结扎）/左侧（对照）血流比例平均值的百分比；*:p<0.05,**:<0.01；

图9为实施例5中cd31免疫荧光染色结果；

图10为实施例5中每组三只小鼠，每只10个400x视野里毛细血管的平均值；*:p<0.05；

图11为实施例6中多肽对仔猪去势时伤口愈合的影响图（第1－7行分别为仔猪去势时、对照组24h、试验组24h、对照组48h、试验组48h、对照组72h、试验组72h的情况图）。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

（1）取天然植物三七根切碎，匀浆，加入相当于植物原料体积8倍的0.06mol/l的ph为8.0的tris-hcl缓冲溶液，超声处理4min，离心去渣，取上清液，即得三七根蛋白粗提液；

（2）将步骤（1）所得三七根蛋白粗提液用硫酸铵沉淀，4℃下放置过夜，然后离心，取沉淀，冷冻干燥，获得三七根蛋白粗粉；

（3）取三七根蛋白粗粉，用蒸馏水溶解，用5mol/l的naoh溶液调节ph为8.0，加入相当于植物蛋白粗粉重0.5‰的复合酶组合物，所述复合酶组合物为碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比1:2混合；置于50℃恒温水浴锅中，酶解3h，酶解结束,将酶解液煮沸3min进行灭酶处理；然后冷却至室温，离心，取上清液，即得多肽粗提液；

（4）取多肽粗提液，用葡聚糖凝胶sephadexg25进行凝胶柱层析，用0.05mol/l的ph为8.0的tris-hcl缓冲溶液洗脱，分段收集洗脱液，并对各部分洗脱液的生物活性进行测定；

（5）收集具有活性的洗脱液部分，用反相高效液相色谱进一步纯化，获得高纯度的多肽。经进一步活性筛选，测定其活性多肽序列，得到如下氨基酸序列结构的活性多肽：

（4）met-ser-his-pro-gly-ala-asp-lys-lys

（5）lys-met-asp-met-his-pro-gly-ala-asp-ser

（6）leu-leu-asp-ala-gly-pro-ser-his-met-ala

（7）met-arg-ser-pro-gly-ala-asp-lys-leu-lys-lys。

实施例2

（1）将植物原料芦荟叶切碎，匀浆，加入相当于植物原料体积6倍的0.06mol/l的ph为8.5的tris-hcl缓冲溶液，超声处理3.5min，离心去渣，取上清液，即芦荟叶蛋白粗提液；

（2）将步骤（1）所得芦荟叶蛋白粗提液用硫酸铵沉淀，4℃下放置过夜，然后离心，取沉淀，冷冻干燥，获得芦荟叶植物蛋白粗粉；

（3）取步骤（2）所得芦荟叶蛋白粗粉，用蒸馏水溶解，用4mol/l的naoh溶液调节ph为8.0，加入相当于芦荟叶蛋白粗粉重量0.6‰的复合酶组合物，所述复合酶组合物为碱性蛋白酶和中性蛋白酶按质量比1:2混合；置于50℃恒温水浴锅中，酶解3.5h，酶解结束,将酶解液煮沸3min进行灭酶处理；然后冷却至室温，离心，取上清液，即得芦荟多肽粗提液；

（4）取多肽粗提液，用葡聚糖凝胶sephadexg25进行凝胶柱层析，用0.05mol/l的ph为8.0的tris-hcl缓冲溶液洗脱，分段收集洗脱液，并对各部分洗脱液的生物活性进行测定；

（5）收集具有活性的洗脱液部分，用反相高效液相色谱进一步纯化，获得高纯度的多肽。进一步进行生物活性筛选，对活性多肽进行序列结构测定，最终获得芦荟活性多肽的序列结构如下：

（4）met-ser-his-pro-gly-ala-asp-lys-lys

（5）lys-met-asp-met-his-pro-gly-ala-asp-ser

（8）val-ala-his-ser-pro-gly-ala-asp-ala-leu-glu-gly-lys-leu

（9）ala-val-met-his-ser-pro-gly-ala-asp-leu-ile

(10)asp-phe-leu-ala-met-his-ser-pro-gly-ala-asp-leu-tyr-trp-ala。

用上述同样的提取方法，从白芨和槐花中分别获得以下序列结构的多肽片段：

从白芨中获得：

（1）ala-met-his-thr-pro-gly-ala-asp

（2）met-lys-ser-his-pro-gly-ala-asp-lys。

从槐花中获得：

（3）lys-pro-gly-ala-asp-met-his-ser-asp。

实施例3

植物多肽诱导血管祖细胞（vpc）迁移与定向分化成血管内皮细胞

将血管祖细胞（vpc）接种于孔径0.8微米的迁移小孔，底座分别加入含有1ng/ml的对照组普通多肽、1ng/ml本发明所述从天然植物白芨中获得的序列结构（1）和序列结构（2）（质量比为1:2）的植物多肽组合物、10ng/ml血管内皮细胞生长因子vegf的培养基，16小时后观察计算穿过0.8微米膜的迁移细胞数。结果见图1和图2。vegf是公认的具有促进血管内皮细胞分化，增殖和迁移从而促进新生血管形成的生长因子，图1和图2显示本发明所述序列结构（1）植物多肽在transwell迁移模型试验中促进小鼠血管祖细胞（vpc）的迁移，其效果明显优于vegf，而对照多肽没有促进vpc细胞迁移的作用。

将血管祖细胞（vpc）接种于孔径0.8微米的迁移小孔，底座分别加入含有0.1ng/ml对照组普通多肽、0.1ng/ml本发明所述序列结构（1）和序列结构（2）（质量比为1:2）的植物多肽组合物、10ng/mlvegf细胞分化培养基中培养7天后，分析具内皮细胞功能的血管形成情况，结果见图3和图4。在细胞分化培养基上形成管状结构是血管内皮细胞独有的特征，常常用于干细胞向血管内皮细胞分化研究中的功能性分析。图3和图4显示本发明所述序列结构（1）和序列结构（2）的植物多肽能显著地促进血管祖细胞形成管状结构，其效果显著优于vegf（p＜0.01），提示其促进血管内皮细胞的定向分化。

综合两个试验结果可知，在体外培养试验中，本发明所述序列结构（1）和序列结构（2）的植物多肽可以促进小鼠血管祖细胞迁移并向血管内皮细胞定向分化。

实施例4

植物多肽促进血管内皮损伤修复和小鼠后肢缺血模型血液的再灌注

用铂金丝环来回刮擦损伤小鼠右侧股动脉血管内皮建立小鼠血管内皮损伤模型，在被损伤血管外侧分别加入含有10ng/ml的对照组普通多肽、本发明所述从天然植物槐花中获得的序列结构（3）植物多肽、vegf，4周后取被损伤血管，切片，he染色观察血管内皮的完整性和新生内膜的形成情况，结果见图5和图6。

通过结扎并剪断小鼠右侧股动脉建立小鼠后肢缺血模型，在被损伤血管外侧分别加入含有10ng/ml的对照多肽、本发明所述序列结构（3）植物多肽、vegf，2周后利用彩色多普勒扫描仪检测小鼠双侧后肢的血流状况。结果见图7和图8。

如图5和图6所示，在小鼠体内试验中，本发明所述序列结构（3）植物多肽可以促进小鼠股动脉损伤模型血管的损伤修复并且抑制血管新生内膜和硬化斑块的形成。本发明所述序列结构（3）植物多肽促进血管内皮修复的完整性与vegf相当，同时，形成的血管新生内膜的厚度远低于对照组和vegf组。由图7和图8可知，本发明之植物多肽组小鼠缺血肢端血流比例平均值远高于对照组和vefg组，表明其促进小鼠后肢缺血模型中缺血组织内新生血管的形成从而促进缺血肢端血液的再灌注，而且比vegf更有效。

本组试验表明本发明所述植物多肽在体内具有促进血管内皮损伤修复和新生血管形成的作用。

实施例5

植物多肽促进心梗坏死组织中新生血管的形成。

通过结扎小鼠左心室冠状动脉建立小鼠心梗模型。在小鼠心梗区域分别注入10ng/ml的对照多肽、本发明实施例1和实施例2中从天然植物三七和芦荟中提取获得的序列结构（4）和序列结构（5）（质量比为1:3）的植物多肽组合物和vegf，30天后，对小鼠左心室心肌组织切片，并进行免疫荧光染色观察cd31阳性细胞（主要为血管内皮细胞）。结果见图9。

如图9所示cd31免疫荧光染色结果（原图绿色为cd31阳性细胞，蓝色为dapi染色的细胞核），植物多肽组cd31阳性细胞数量明显多于对照组和vegf组，表明本发明所述序列结构（4）和序列结构（5）（质量比为1:3）的植物多肽组合物具有促进心梗坏死组织中血管内皮细胞分化和新生血管的形成。

实施例6

多肽喷剂用于仔猪去势时的效果观察

仔猪去势后，在其伤口上喷含有10μg/ml的本发明所述结构序列（6）多肽的皮肤喷剂1ml，对伤口在24、48、72小时内的恢复情况进行观察。对照组喷不含多肽的空白生理盐水溶液。结果见图11。

试验组去势后在伤口喷上含有本发明所述由多肽合成仪合成结构序列（6）多肽的喷剂，对照组喷不含多肽的空白生理盐水溶液，分别在仔猪去势24、48、72小时对伤口进行拍照，从图11可知，与对照组相比，使用本发明所述多肽喷剂后24小时后，伤口部位红肿明显消退；48小时后，伤口愈合速度明显加快；使用72小时，伤口即完全愈合。其伤口愈合速度远远快于对照组，在2~3天内即可完全治愈伤口，表明本发明所述多肽具有快速促进伤口愈合的作用。

实施例7

多肽对母猪产后炎症及繁殖性能的影响

试验以108头生产母猪为试验对象，对本发明所述由多肽合成仪合成序列结构（7）和（8）（质量比1:1）多肽组合物子宫灌注剂对母猪炎症防控及生产性能的影响进行研究。选择距离预产期间隔10天以内的108头母猪作为试验对象，随机分为试验组和对照组两组，试验组母猪产后子宫灌注本发明所述多肽子宫灌注剂（多肽含量为8μg/ml），每次100ml，每天1次，连续使用3天。对照组采取常规保健方法，伤口处涂抹或灌注常规抗生素类子宫灌注剂连续使用3天。试验从母猪产后第1天开始，到母猪断奶7天后结束。

对试验期间母猪子宫炎、乳房炎发病情况及断奶发情情况进行统计，结果见表1。

母猪生殖过程中机械损伤易引起细菌感染，而引发炎症导致母猪子宫炎症，乳房炎等。母猪子宫炎症将影响母猪生产后发情断奶间隔时间、发情率以及发情配种率，严重时甚至造成母猪被提前淘汰。由表1可知，与对照组相比，试验组子宫炎和乳房炎发生率大幅降低，断奶发情间隔期缩短，断奶7天内发情率显著提高，表明本发明所述多肽能有效降低母猪产后炎症的发生率，进一步改善母猪的发情情况。

实施例8

多肽口服液对防治仔猪腹泻的作用

本发明所述由多肽合成仪合成序列结构（9）和（10）多肽（质量比为1:2）组合物制备而成的仔猪口服液，对断奶仔猪腹泻的治疗情况开展对比试验。仔猪腹泻样本为包括断奶应激、转群、换料、天气突变以及细菌感染等因素引起的仔猪腹泻，试验组患病仔猪灌服本发明所述多肽口服液（多肽含量为15μg/ml），每次2-3ml，每天1次，连续使用3-5天，对照组采用常规抗生素治疗，试验数据统计结果见表2。

断奶仔猪换料、转群、天气变化及细菌病毒感染均易引起仔猪腹泻，仔猪腹泻具有传染性和难以根治性，而且严重影响仔猪生长性能，若不及时治疗，很容易导致仔猪死亡，给猪场和养殖户带来巨大的经济损失。由表2可知，应用本发明所述多肽口服液，能快速控制和治愈仔猪腹泻，使用3天内能实现治愈率97%以上，而且复发率为0，其治愈速度和完全治愈率远远高于普通抗生素治疗，而且病情不复发，仔猪腹泻得到彻底根治。

实施例9多肽饲料添加剂促生长和抗腹泻的作用

选择1100头断奶转群体重相近的保育猪随机平均分为试验组和对照组。试验期为从仔猪转入保育舍开始到转出保育舍结束，共70天。试验组全程每吨饲料添加含有实施例1所述多肽的饲料添加剂，添加浓度为每吨饲料中多肽含量为10mg。其他饲养条件与对照组一致。多肽饲料添加剂对保育猪生长性能影响见表3。

由表3可知，试验组保育猪日增重、成活率、合格率都得到明显提高，保育猪保育阶段料肉比、腹泻率显著降低，试验组550头仔猪保育阶段仅有2头发生腹泻，保育猪健康度明显改善，试验表明，实施例1所述多肽具有促进仔猪生长，预防仔猪腹泻的作用。

序列表

<110>胡国田，曾灵芳

<120>一种多肽及其应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列()

<400>1

alamethisthrproglyalaala

15

<210>2

<211>9

<212>prt

<213>人工序列()

<400>2

metleuserhisproglyalaalaleu

15

<210>3

<211>9

<212>prt

<213>人工序列()

<400>3

leuproglyalaalamethisserala

15

<210>4

<211>9

<212>prt

<213>人工序列()

<400>4

metserhisproglyalaalaleuleu

15

<210>5

<211>10

<212>prt

<213>人工序列()

<400>5

leumetalamethisproglyalaalaser

1510

<210>6

<211>10

<212>prt

<213>人工序列()

<400>6

leuleualaalaglyproserhismetala

1510

<210>7

<211>11

<212>prt

<213>人工序列()

<400>7

metalaserproglyalaalaleuleuleuleu

1510

<210>8

<211>14

<212>prt

<213>人工序列()

<400>8

valalahisserproglyalaalaalaleuglyglyleuleu

1510

<210>9

<211>11

<212>prt

<213>人工序列()

<400>9

alavalmethisserproglyalaalaleuile

1510

<210>10

<211>15

<212>prt

<213>人工序列()

<400>10

alaproleualamethisserproglyalaalaleuthrthrala

151015