水稻粒宽基因GW5L及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及水稻粒宽基因gw5l编码区的分离及其应用。
背景技术：
：水稻（oryzasatival.）是世界上重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以稻米为主食，也是我国第一大粮食作物。长期以来，为解决13亿的口粮问题，我国的水稻育种一直以高产作为主要目标而忽视了品质改良，导致目前我国水稻品种普遍存在“高产而不优质”的现状。近年来，随着市场经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，市场对优质稻米的需求越来越强烈，人们对稻谷外观和蒸煮食味品质的要求也日益提高，尤其是在国际市场上这一问题尤为突出。加强稻米品质改良，选育优质高产水稻品种已成为当前我国水稻育种的当务之急。水稻粒型，包括粒长、粒宽和粒厚，是衡量稻米外观品质的重要指标，也是影响稻米市场价值的直接因素。不同地域，不同阶层，不同生活习惯的人群对稻米粒型的偏好不同，如在美国、东南亚以及我国南方的消费者偏好于长粒稻米，而我国北方以及日韩的消费者更喜欢短而圆的稻米。粒型也是育种家选育优质稻米品种的重要指标之一。鉴定和克隆水稻粒型的关键调控基因，解析其分子作用机理对于水稻高产优质育种具有重要的理论和应用价值。目前通过分子生物学手段鉴定和定位了200多个水稻粒型相关qtl（数量性状位点），其中103个与粒长有关，95个与粒宽有关，少数与长宽比及粒厚相关。仅有个别调控水稻粒型的基因被克隆，包括粒宽基因gw2、gw8、gw7、gw5及粒长基因gl3.1、gs2、gs3、gw5等。gw2（grainwidth2）位于第2染色体，编码一个e3泛素连接酶，通过泛素化降解细胞分裂相关蛋白影响水稻籽粒相关细胞的分裂，进而调控籽粒大小。gw2功能缺失引起颖壳外围细胞数目增多，导致籽粒变宽，并引起胚乳细胞变大，但不影响胚乳细胞数目，这表明gw2通过不同的机制控制颖壳和胚乳的发育过程。另外，gw2能显著提高灌浆速率和干物质积累。gl3.1/qgl3位于第3染色体，编码丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，属于ppkl家族，是同时控制粒长、粒宽、粒厚与籽粒饱满度的qtl。gl3.1通过调控水稻细胞周期蛋白控制籽粒大小。gl3包含有两个kelch结构域，其第二kelch上avldt区域的第364位天冬氨酸发生突变会导致籽粒变长。gl3.1/qgl3蛋白对其底物cyclin-t1的磷酸酶活性会影响细胞分裂周期，进而影响颖壳细胞数目及籽粒大小。gs2位于第2染色体，编码osgrf4蛋白，是转录调控因子grf家族的一员，包含qlq结构域和wrc结构域。gl2/gs2表达量的增加导致细胞体积变大及细胞数目增多，进而增加籽粒重量。gs2与转录共激活子osgrfs互作，调控细胞伸长和细胞分裂，影响水稻粒型和粒重。gs2是一个半显性的位点，品种zh11和bdl的gs2存在两个碱基差异（第3外显子1187tc→aa），该二碱基的替换影响gs2与osmir396c的结合位点，当gs2突变为gs2aa后，影响osmir396对其的剪切，产生大粒表型。gs3是一个调控粒长和粒重的主效qtl，位于第3染色体，通过控制颖壳的细胞数目调节籽粒大小。gs3编码一个由232个氨基酸组成的跨膜蛋白。该蛋白包含4个结构域：一个调控器官大小的结构域osr、一个跨膜结构域m、一个肿瘤坏死因子受体家族中富含半胱氨酸同源区域t和一个c型血管性血友病因子vwfc。结构域osr负调控籽粒长度，而胞内的富含半胱氨酸区域和vwfc结构域抑制osr结构域的功能。不同品种中gs3结构域的类型不尽相同，其特定结构域组合决定品种籽粒的大小。gw8又名osspl16，位于第8染色体，编码一个包含sbp结构域的转录因子，调控水稻粒宽。gw8参与调控细胞分裂的g1期到s期的转化过程，能正向调控细胞分裂相关基因的表达，导致细胞增殖。过表达gw8能促进细胞分裂和灌浆，从而增加粒宽和产量，而gw8基因被干扰导致水稻谷粒变细长。gw7/gl7是的一个控制粒长和粒宽的主效qtl，位于第7染色体。该基因编码一个tonneau1募集基序蛋白。上调gw7表达量能增加谷粒的纵向细胞分裂，并减少横向细胞分裂，导致谷粒变细长。携带gl7的近等基因系与其受体品种相比，其内颖和外颖表皮细胞的长度增加、宽度减少，淀粉颗粒变大而致密，稻米垩白度和垩白率降低。gw5是一个决定粒宽和粒重的主效qtl，位于第5染色体，主要存在于粳稻品种中，对粒宽和粒重的贡献较大。gw5编码一个功能未知的钙调蛋白，在籼稻与粳稻间该基因上游约5kb处存在1,212bp片段缺失差异，该片段直接影响了gw5在籼、粳稻中表达量，引起粒型变化。gw5蛋白位于细胞质膜上，能与水稻gsk2（拟南芥bin2激酶的同源蛋白）互作，抑制水稻gsk2激酶的活性，导致下游bzr1和dlt转录因子磷酸化程度降低和非磷酸化蛋白积累增加，从而调控油菜素内酯的下游基因表达，引起籽粒改变。目前，对水稻粒型基因的分子调控机制及遗传网络的研究非常有限。克隆水稻中关键的粒型基因，解析粒型相关基因的遗传调控机理具有重要理论意义和应用价值。gw5l是粒宽基因gw5的一个同源基因（蛋白一致性73.4%），位于第1染色体，编码一个膜定位的功能未知的钙调蛋白。在水稻中过表达该基因能引起籽粒明显变窄变长、叶夹角增大。gw5l的克隆与功能分析，有助于水稻谷粒外观品质的改善及大米市场价值的提高。技术实现要素：本发明的首要目的是提供一种水稻粒宽基因，及其核苷酸序列与包含该基因的重组载体。发明人通过同源克隆的方式克隆了水稻粒型相关基因gw5l，进一步在水稻植株中过表达gw5l基因，发现转基因植株水稻粒宽显著减少，粒长显著增加，即成功改变了目的植株的粒型。本发明的一个目的是提供一种多肽，即蛋白gw5l，其氨基酸序列如seqidno:2所示。将蛋白gw5l的编码基因导入目的植物，使目的植物过表达该多肽，即可使该植物的种子籽粒变窄变长。本发明的另一目的是提供编码前述多肽的寡核苷酸，即为gw5l基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。将该基因导入目的植物，使目的植物过表达该多肽，即可使该植物的粒宽显著减少，粒长显著增加。本发明的又一目的是提供一种包含前面所述的寡核苷酸重组载体，其结构如图1所示。本发明的重组载体为在pcambia1390载体的bamhⅰ、spei酶切位点间插入seqidno:1所示的gw5l基因得到的载体。利用该重组载体将gw5l基因导入目的植物，使目的植物过表达该多肽，即可使该植物的粒宽显著减少，粒长显著增加。在本发明的再一目的是提供一种通过转基因获得的包含前述寡核苷酸转基因细胞系。利用该转基因细胞系培养获得的转基因植株也能够过表达该多肽，从而使转基因植株的籽粒变长变窄。本发明提供了如下1）-3）中任一种物质在调控植物粒型及培育粒型改变植物中的应用：1）蛋白gw5l；2）编码蛋白gw5l的dna分子；3）含有编码蛋白gw5l的dna分子的重组载体；所述蛋白gw5l为如下（1）或（2）：（1）由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）将seqidno:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由（1）衍生的蛋白质。上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述应用中，所述编码蛋白gw5l的dna分子是如下1）至4）中任一所述的dna分子：1）seqidno:1所示的dna分子；2）seqidno:3所示的dna分子；3）在严格条件下与1）或2）所限定的dna分子杂交且编码由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子；4）与1）或2所限定的dna分子至少具有70%同源性且编码由seqidno:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子。上述严格条件可为在6×ssc，0.5%sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1%sds和1×ssc，0.1%sds各洗膜一次。上述应用中，所述调控植物粒型或所述粒型改变均为籽粒宽度、籽粒厚度和千粒重及颖壳细胞数目的改变。上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。本发明通过实验证明，将gw5l基因转入野生型水稻，可获得粒型改变的转基因水稻。与受体水稻相比，在转基因水稻中gw5l基因过量表达，粒宽显著减少，粒长显著增加，叶夹角增大，颖壳横向细胞数目显著减少。因此，gw5l基因与粒型相关，为培育粒型改变的转基因植物奠定基础。本发明对进一步阐明植物籽粒发育分子机理并通过基因工程手段培育优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。附图说明图1为pcambia1390载体图谱。图2为野生型水稻kitaake与gw5l基因过量表达水稻的表型。图3为野生型水稻kitaake与gw5l基因过量表达水稻的粒长、粒宽、粒厚以及千粒重统计数据。图4为野生型水稻kitaake与gw5l基因过量表达水稻的表达检测。图5为野生型水稻kitaake和gw5l基因过量表达水稻的颖壳横向细胞数目情况。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。n6培养基购自美国phytotechnologylaboratories，货号为c167。水稻品种kitaake（oryzasativa）在文献“liz,wanj,xiaj,etal.mappingofquantitativetraitlocicontrollingphysico-chemicalpropertiesofricegrains(oryzasatival.).breedingscience,2003,53(3):209-215”中公开过，公众可从相关机构及中国农业科学院作物科学研究所获得。根癌农杆菌eha105（agrobacteriumtumefacienseha105）在文献“hood,elizabethe;gelvin,stantonb;melchers,leos;hoekema,andre.1993.newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.transgenicresearch,2(4):p.208-218-218”中公开过，公众可从相关机构及中国农业科学院作物科学研究所获得。pcambia1390载体为商业化载体，公众可通过商业渠道或相关机构获得，也可从中国农业科学院作物科学研究所获得。本发明在研究水稻其他农艺性状过程中，在转基因后代中发现一个具有特殊表型的家系，该家系的粒宽显著减少，粒长显著增加，叶片变细变长，叶夹角增大。该家系的表型是由于过表达gw5l引起的，说明gw5l在调控水稻粒型及叶夹角中发挥着重要作用。下面提供gw5l基因在培育粒型改变的转基因植物中的应用实例。一、过表达载体pcambia1390-gw5l的构建1、gw5l基因的获得提取野生型kitaake总rna并反转录为cdna，以cdna为模板，以gw5l-cds-f和gw5l-cds-r为引物进行pcr扩增，得到1442bp的gw5l基因（具有seqidno:1所示的核苷酸,其第89-1487位核苷酸为gw5l基因的开放阅读框序列，第1-16及第1609-1624位核苷酸为连载体用载体接头序列）。gw5l基因的基因组序列如seqidno:3所示，gw5l基因的cdna为序列seqidno:1，其编码蛋白gw5l，蛋白gw5l的氨基酸序列为seqidno:2。引物如下：gw5l-cds-f:5’-gcaggtcgacggatccttgctcaagtgttcgacctg-3’（下划线序列为载体接头序列）gw5l-cds-r:5’-tagcgttaacactagtcattgccatcgatcaaacat-3’（下划线序列为载体接头序列）2、gw5l过表达载体的构建用限制性内切酶bamhⅰ和spei双酶切pcambia1390载体，回收约10820bp的线性质粒，得到载体大片段，pcambia1390载体环状载体图谱如图1所示。利用clontech公司的in-fusion酶（www.clontech.com，货号：st0344）将10820bp的线性质粒与上述步骤1获得的gw5l基因in-fusion连接，得到重组质粒，命名为pcambia1390–gw5l。经测序确认，重组质粒pcambia1390–gw5l为在pcambia1390载体bamhⅰ与spei酶切位点间插入gw5l基因（seqidno:1第17-1582位）而得到的载体。二、转gw5l水稻的获得1、重组菌的构建将重组质粒pcambia1390–gw5l导入根癌农杆菌eha105，得到重组农杆菌eha105/pcambia1390–gw5l。2、gw5l基因过量表达水稻的获得将eha105/pcambia1390–gw5l转入水稻kitaake（oryzasativa）（以下简称受体水稻）成熟胚的愈伤组织中，具体步骤如下：（一）用含50μmol/l卡那霉素的液体lb培养基悬浮培养重组农杆菌eha105/pcambia1390–gw5l，得到od600nm≈0.5的菌悬液。（二）取受体水稻的成熟胚愈伤组织与步骤（一）得到的菌悬液混合，侵染30min，用滤纸吸干菌液后将愈伤组织放置于共培养培养基（含0.03924mg/l乙酰丁香酮的固体n6培养基）上，24℃下培养3天。（三）将步骤（二）得到的愈伤组织接种至含150mg/lg418的固体n6培养基上，24℃下培养16天。（四）取步骤（三）得到的健康愈伤组织，接种至含200mg/lg418的固体n6培养基上，24℃下培养，每15天继代一次。（五）取步骤（四）得到的健康愈伤组织，接种至分化培养基（含150mg/lg418、2mg/l激动素、0.05mg/l萘乙酸的固体n6培养基）上，24℃下培养45天（此时植株地上部分高度约为15cm），打开瓶口炼苗3天，然后移至温室栽培，即为t0代植株。（六）将t0代植株自交，收获种子并培育为植株，即为t1代植株。3、转gw5l水稻的pcr鉴定分别提取t0代和t1代转gw5l水稻植株的基因组dna作为模板，以1390-f和gw5l-r为引物进行pcr扩增。引物如下：1390-f：5'-tgccttcatacgctatttatttgc-3'；gw5l-1r：5'-ccacgccatgctcgctcctc-3'。1390-f对应于图1载体上的10707-10730bp，gw5l-r引物对应于序列1中的第781-800bp。如果一个转基因植株能用上述引物pcr扩增出能得到1006bp的dna片段，则证明该植株为阳性转基因植株。对于某一t0代植株，如果该植株及其t1代植株pcr鉴定均为阳性，则证明该植株为纯合的gw5l基因过量表达植株，该植株的自交后代为一个gw5l基因过量表达株系，包含18个t1代转gw5l单株。4、植株的mrna表达量的检测为检测转基因后代的gw5l基因表达程度，利用实时定量pcr来检测受体水稻及t0代转gw5l水稻体内gw5l基因的表达情况。实时定量pcr在定量pcr仪（7900real-time，appliedbiosystems）上按照appliedbiosystems提供的操作步骤进行，以水稻ubiqutin基因作为内参。引物在60℃退火，反应40个循环，每个样品设置3个重复。反应体系为25μl，其中包括2μl反转录产物、0.25μm的正反向引物和12.5μlsybrgreen混合物（购自takara）。实时定量pcr鉴定所使用的引物如下：qrt-f：5'-acacgaggagcgagcatgg-3'；qrt-r：5'-ccggtgtccatctccacgat-3'。部分检测结果如图4所示。与野生型水稻相比，转gw5l水稻t0代株系go-1和go-2中gw5l基因的表达量显著提高。采用同样的方法将pcambia1390载体导入受体水稻，得到转空载体t2代水稻。三、转gw5l水稻的表型及农艺性状调查1、表型观察将转gw5lt2代水稻和受体水稻种植于大田，待抽穗灌浆后，观察株型和粒型并拍照。观察的结果如图2所示，其中，wt代表野生型水稻；gw5l-ox代表t2代转gw5l水稻。图2a为水稻的株型，图2b为水稻的粒宽，2c为水稻的粒长。与野生型水稻相比，转gw5l基因t2代水稻的叶片变细长，叶夹角变大，籽粒显著变窄变长。2、农艺性状的调查在转gw5lt2代水稻、转空载体t2代水稻和受体水稻籽粒成熟后收获，在室温下保存3个月碾成糙米，用于测定粒长。参照《中华人民共和国国家标准》gb/t17981-1999测定稻糙米和稻谷的粒型，重复3次，取平均值作为性状表型值。随机挑选各水稻1000粒饱满籽粒，用千分之一电子天平称重，重复3次，取平均值作为千粒重表型值。调查结果如图3，其中wt代表野生型水稻；gw5l-ox代表t2代转gw5l水稻。图3a为粒宽，图3b为粒长，图3c为粒厚，图3d为千粒重。与野生型水稻相比，转gw5l基因t2代水稻的粒宽显著减少，粒长显著增加；而转空载体t2代水稻和受体水稻的粒型均无显著差异。3、具体株系农艺性状的统计采用上述2的方法，检测转gw5l基因t2代株系go-1、go-2和转空载体t2代水稻和受体水稻粒型相关性状。结果如图4和表1所示。与野生型水稻相比，转gw5l基因t2代水稻的粒宽显著减少，粒长显著增加，叶夹角变大；而转空载体t2代水稻和受体水稻均无显著差异。表1野生型及转基因植株后代粒型相关性状的统计性状wtgo-1go-2粒宽(mm)3.49±0.172.63±0.142.67±0.17粒长(mm)6.84±0.247.94±0.218.22±0.15粒厚(mm)2.36±0.062.01±0.052.06±0.05千粒重(g)26.98±3.720.68±0.7522.59±1.14、颖壳横向细胞增殖情况将野生型水稻kitaake和转gw5l基因t2代水稻株系的抽穗前15天的颖壳浸入faa固定液中，真空抽气后固定24h以上。经梯度酒精脱水及二甲苯透明后，用石蜡（paraplastplus,购自sigma）完全置换二甲苯，利用包埋机（leicaeg1150）包埋样品于蜡块中。根据材料幼嫩的程度，用切片机（leicarm2265）将组织切成8-10μm的薄片，用0.025%的甲苯胺蓝溶液染色切片30min左右，用灭菌水漂洗两次后镜检、拍照。利用imagj软件统计颖壳最外层细胞的数目及周长。统计结果如图5所示，其中wt代表野生型水稻；gw5l-ox代表t2代转gw5l水稻。图5a和5b分别为野生型水稻和t2代转gw5l水稻的颖壳横切面。图5c和图5d分别为野生型水稻和t2代转gw5l水稻的颖壳横切面对应的局部放大图。图5表明，与野生型水稻相比，t2代转gw5l水稻的颖壳细胞数目明显变少。<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>水稻粒宽基因gw5l及其应用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>1624<212>dna<213>水稻（oryzasativa）<400>11gcaggtcgacggatccttgctcaagtgttcgacctggtcttggagcgcggcgtgtctctc61tcgccggccggagtcgcgaattccggccatgggcaaggcggcgaggtggttccgcagcct121gtggggcggcggcggcgggaagaaggagcaggggagagaacatgggaggacggccgcggc181gccgcccccgccggacaggaagcggtggagcttcgccaagtcgtcgagggactcgacgga241gggggaggcggcggcggcggtgggagggaatgcggcgatcgcgaaggcggccgaggcggc301gtggctcaagtcgatgtacagcgacaccgagagggagcagagcaagcacgccatcgcggt361cgccgcggcgaccgcggctgcggcggacgcggccgtggcggcggcacaggcggccgtcga421ggtcgtccgcctcaccagccaggggccacccacctcgtcggtgttcgtctgcggcggcgt481cttggatccccgtggccgcgccgccgcggtcaagatccagacagccttccgaggattctt541ggcgaagaaggcgctgcgagcgctcaaggcgctggtgaagctgcaggcgctggtgcgcgg601ctacctggtgaggcggcaggcggcggcgacgctgcagagcatgcaggcgctcgtccgcgc661gcaggccgccgtccgcgccgcgcgctcgtcgcgcggcgccgcgctgccgccgctgcacct721ccaccaccaccctcccgtccggccgcgctattccctgcaagagcggtatatggacgacac781gaggagcgagcatggcgtggcggcgtacagccgccgcctgtcggcgagcatcgagtcgtc841gtcgtacgggtacgaccggagccccaagatcgtggagatggacaccgggcggcccaagtc901gaggtcgtcgtcggtcaggacgagccctcccgtggtcgacgccggcgccgccgaggagtg961gtacgccaactcggtgtcgtcgccgctcctcccgttccaccagctccccggcgcgccgcc1021gcggatatcggcgccgagcgcacgccacttcccggagtacgactggtgcccgctcgagaa1081gcccaggccggcgacggcgcagagcacgccgcggcttgcgcacatgccggtgacgccgac1141gaagagcgtctgcggcggcggcggctacggcgcgtcgcccaactgccgcggctacatgtc1201gagcacgcaatcgtcggaggcgaaggtgcggtcccagagcgcgccgaagcagcggccgga1261gccgggcgtcgccggcggcaccggcggcggcgcgcggaagagggtgccgctgagcgaggt1321gaccctggaggcgagggcgagcctgagcggcgtgggcatgcagcgctcgtgcaaccgtgt1381ccaggaggcgttcaacttcaagaccgccgtgctcagccgcttcgaccgctcgtcggagcc1441ggccgccgagagggaccgcgacctcttcttgcagaggaggtggtgatctgaacagcgttc1501gccattgcaagaaggaagaggactacaagaactagttcttcttcttcttcttagtctctg1561tttctatgcgacatagtagcgatcgatcatgtttgatcgatggcaatgactagtgttaac1621gcta<210>2<211>469<212>prt<213>水稻（oryzasativa）<400>21metglylysalaalaargtrppheargserleutrpglyglyglyglyglylyslysglu21glnglyarggluhisglyargthralaalaalaproproproproasparglysargtrp41serphealalysserserargaspserthrgluglyglualaalaalaalavalglygly61asnalaalailealalysalaalaglualaalatrpleulyssermettyrseraspthr81gluarggluglnserlyshisalailealavalalaalaalathralaalaalaalaasp101alaalavalalaalaalaglnalaalavalgluvalvalargleuthrserglnglypro121prothrserservalphevalcysglyglyvalleuaspproargglyargalaalaala141vallysileglnthralapheargglypheleualalyslysalaleuargalaleulys161alaleuvallysleuglnalaleuvalargglytyrleuvalargargglnalaalaala181thrleuglnsermetglnalaleuvalargalaglnalaalavalargalaalaargser201serargglyalaalaleuproproleuhisleuhishishisproprovalargproarg221tyrserleuglngluargtyrmetaspaspthrargsergluhisglyvalalaalatyr241serargargleuseralaserileglusersersertyrglytyraspargserprolys261ilevalglumetaspthrglyargprolysserargserserservalargthrserpro281provalvalaspalaglyalaalagluglutrptyralaasnservalserserproleu301leuprophehisglnleuproglyalaproproargileseralaproseralaarghis321pheproglutyrasptrpcysproleuglulysproargproalathralaglnserthr341proargleualahismetprovalthrprothrlysservalcysglyglyglyglytyr361glyalaserproasncysargglytyrmetserserthrglnserserglualalysval381argserglnseralaprolysglnargprogluproglyvalalaglyglythrglygly401glyalaarglysargvalproleusergluvalthrleuglualaargalaserleuser421glyvalglymetglnargsercysasnargvalglnglualapheasnphelysthrala441valleuserargpheaspargsersergluproalaalagluargaspargaspleuphe461leuglnargargtrp***<210>3<211>2172<212>dna<213>水稻（oryzasativa）<400>31gcgtttccctctcttattcaaacttgacccgtttcgccttcttgctcaagtgttcgacct61ggtcttggagcgcggcgtgtctctctcgccggccggagtcgcgaattccggccatgggca121aggcggcgaggtggttccgcagcctgtggggcggcggcggcgggaagaaggagcagggga181gagaacatgggaggacggccgcggcgccgcccccgccggacaggaagcggtggagcttcg241ccaagtcgtcgagggactcgacggagggggaggcggcggcggcggtgggagggaatgcgg301cgatcgcgaaggcggccgaggcggcgtggctcaagtcgatgtacagcgacaccgagaggg361agcagagcaagcacgccatcgcggtcgccgcggcgaccgcggctgcggcggacgcggccg421tggcggcggcacaggcggccgtcgaggtcgtccgcctcaccagccaggggccacccacct481cgtcggtgttcgtctgcggcggcgtcttggatccccgtggccgcgccgccgcggtcaaga541tccagacagccttccgaggattcttggtgagtgagccccaacaacttcctcacttcttcc601aagaacaacagtgtctgcttctgttcttgatctgttcgtcttctttggcgacgtgctcat661ttcgatttcatccactgttccagtagatttccttttccaaaaaaagctcatagattaaga721catgattagatttttatttttgttcttggttcaggcgaagaaggcgctgcgagcgctcaa781ggcgctggtgaagctgcaggcgctggtgcgcggctacctggtgaggcggcaggcggcggc841gacgctgcagagcatgcaggcgctcgtccgcgcgcaggccgccgtccgcgccgcgcgctc901gtcgcgcggcgccgcgctgccgccgctgcacctccaccaccaccctcccgtccggccgcg961ctattccctggtacgagtacgaccacgatcgcttgcgtgcgaagcgggcgagcttttttt1021ttaaaggtgttcgtccgaggcatgttggttgctgtgacacaattcttacctcgggggttt1081cttgtgtttgcagcaagagcggtatatggacgacacgaggagcgagcatggcgtggcggc1141gtacagccgccgcctgtcggcgagcatcgagtcgtcgtcgtacgggtacgaccggagccc1201caagatcgtggagatggacaccgggcggcccaagtcgaggtcgtcgtcggtcaggacgag1261ccctcccgtggtcgacgccggcgccgccgaggagtggtacgccaactcggtgtcgtcgcc1321gctcctcccgttccaccagctccccggcgcgccgccgcggatatcggcgccgagcgcacg1381ccacttcccggagtacgactggtgcccgctcgagaagcccaggccggcgacggcgcagag1441cacgccgcggcttgcgcacatgccggtgacgccgacgaagagcgtctgcggcggcggcgg1501ctacggcgcgtcgcccaactgccgcggctacatgtcgagcacgcaatcgtcggaggcgaa1561ggtgcggtcccagagcgcgccgaagcagcggccggagccgggcgtcgccggcggcaccgg1621cggcggcgcgcggaagagggtgccgctgagcgaggtgaccctggaggcgagggcgagcct1681gagcggcgtgggcatgcagcgctcgtgcaaccgtgtccaggaggcgttcaacttcaagac1741cgccgtgctcagccgcttcgaccgctcgtcggagccggccgccgagagggaccgcgacct1801cttcttgcagaggaggtggtgatctgaacagcgttcgccattgcaagaaggaagaggact1861acaagaactagttcttcttcttcttcttagtctctgtttctatgcgacatagtagcgatc1921gatcatgtttgatcgatggcaatggcgatcgtgtgctccgccattgccgtcgtctccgag1981cttgttactgacaagtgacaggcaaagtgtacgttgagctagctggaggggagattacaa2041aaaaaaaaaatcccacttctttcccctctgatttaacagtgcacttggatgtacattccc2101ctatcaattcaaggccagcaaatcaaatcccgttgtttttttttaa当前第1页12