本发明是一种蛹虫草发酵转化女贞子中橄榄苦苷生成橄榄苦苷苷元的方法。
背景技术：
蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草等，为麦角菌科虫草属真菌，是由子座(草部分)和菌核(虫的尸体部分)两部分组成的复合体。蛹虫草中含有大量的核苷类化合物、多糖类、虫草酸、蛋白质、甾醇类化合物以及过氧化歧化酶等成分，其中，所含有的虫草素是其最具有特色的成分，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，具有明显的抗肿瘤、抗衰老、提高免疫力、抑菌抗炎等功效。
橄榄苦苷是一种裂环烯醚萜苷类多酚化合物，广泛存在于各种木犀科的木犀榄属、女贞属、丁香属等植物中。近年来，橄榄苦苷的药理活性如抗氧化、抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和降血糖等逐渐被研究人员所发现，并逐渐应用于医药、保健食品、化妆品等行业，且应用前景广阔。
橄榄苦苷苷元是由橄榄苦苷去糖基化后得到的，经研究发现，橄榄苦苷苷元具有良好的抗老年痴呆、抗乳腺癌、抗炎、治疗糖尿病、抗氧化及降血脂的功效。一般情况下，苷元主要是通过酶水解、酸水解等方式得到，但具有酶制品成本高，酸水解后会使产品色泽、口感变差等不足之处，而利用微生物发酵的方法转化制备橄榄苦苷苷元可避免上述缺点。
因此，有必要探究一种新的转化橄榄苦苷生成橄榄苦苷苷元的方法，以满足需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蛹虫草发酵转化女贞子中橄榄苦苷生成苷元的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种蛹虫草发酵转化女贞子中橄榄苦苷生成苷元的方法，包括以下步骤：
s1，蛹虫草种子液的制备
取蛹虫草菌丝块接种于pda培养基中，放置在恒温培养箱中，进行蛹虫草菌种活化；
将活化后的蛹虫草菌种接种于种子液培养基中，得到蛹虫草种子液；
s2，蛹虫草种子液的发酵转化
取干燥好的女贞子，将其粉碎后过60目筛，将筛选后的女贞子加入配料制成发酵培养基；
将蛹虫草种子液接种于灭菌后的发酵培养基中，静置培养，经过发酵后将橄榄苦苷转化为橄榄苦苷苷元。
作为本发明再进一步的方案：步骤s1中，活化后的蛹虫草菌种接种在种子液培养基后，在25℃的温度条件下，以130r·min-1的转速在回旋式振荡器上恒温培养5天，即可得到蛹虫草种子液。
作为本发明再进一步的方案：步骤s1中，恒温培养箱的温度为25℃，培养时间为6天。
作为本发明再进一步的方案：步骤s1中，pda培养基的组成成分为：马铃薯200g·l-1，葡萄糖25g·l-1，琼脂15g·l-1，ph状态为自然。
作为本发明再进一步的方案：步骤s1中，种子液培养基的组成成分为：葡萄糖25g·l-1，酵母膏15g·l-1、kh2po41g·l-1、mgso41g·l-1和vb10.05g·l-1，ph状态为自然。
作为本发明再进一步的方案：步骤s2中发酵培养基的制作方法是：称取粉碎后的女贞子置于三角瓶中，加入水、kh2po4、mgso4和vb1，密封后于121℃下高压蒸汽灭菌30min，作为发酵培养基。
作为本发明再进一步的方案：女贞子、水、kh2po4、mgso4和vb1的用量为女贞子20g、水100g、kh2po40.5g、mgso40.5g、vb10.01g。
作为本发明再进一步的方案：步骤s2中，静置培养的温度为25℃，时间为15天。
一种橄榄苦苷及其苷元含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)橄榄苦苷对照品溶液的制备：精密称取橄榄苦苷对照品，加入适量甲醇使其溶解，配制成浓度0.2、0.35、0.4、0.8、1mg·ml-1的对照品溶液；
(2)橄榄苦苷苷元对照品溶液的制备：精密称取橄榄苦苷苷元对照品，加入适量甲醇使其溶解，配制成浓度0.2、0.35、0.4、0.8、1mg·ml-1的对照品溶液；
(3)供试品溶液的制备：分别称取干燥后的女贞子粉和发酵后菌质各5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100ml，75℃水浴回流90min，过滤，蒸干溶剂，加入适量甲醇使其溶解，定容，即得；
(4)将得到的对照品溶液和供试品溶液进行高效液相色谱测定，即可得到发酵前后橄榄苦苷及其苷元的含量。
作为本发明再进一步的方案：高效液相色谱测定的条件为：使用c18色谱柱，洗脱系统为乙腈∶水＝20∶80，柱温为25℃，流速为1.0ml·min-1，进样量为20μl。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过蛹虫草发酵转化橄榄苦苷制备橄榄苦苷苷元，产物转化率高，为新型功能物质的开发及工业化生产奠定基础；
(2)蛹虫草发酵具有繁殖迅速，生长周期短等优点，可以降低成本，易于工业化生产；
(3)采用蛹虫草发酵转化橄榄苦苷，具有反应条件温和，工艺简单、操作性强、无有机溶剂残留、无环境污染等特点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种蛹虫草发酵转化女贞子中橄榄苦苷生成其苷元的方法，包括以下步骤。
1、蛹虫草种子液的制备
蛹虫草菌株保存于斜面培养基中，取4-5块1cm2菌丝块接种于pda培养基中，放置于25℃恒温培养箱中，培养6天进行菌种活化。将活化后的菌种接种于种子液培养基中，于25℃、130r·min-1下在回旋式振荡器上恒温培养5天。
pda培养基：马铃薯200g·l-1，葡萄糖25g·l-1，琼脂15g·l-1，ph：自然；
种子液培养基：葡萄糖25g·l-1，酵母膏15g·l-1，kh2po41g·l-1，mgso41g·l-1，vb10.05g·l-1，ph：自然；
2、蛹虫草转化橄榄苦苷为其苷元
取干燥好的女贞子，粉碎，过60目筛。称取粉碎后的女贞子20g，置于三角瓶中，按照1∶5的料液比加水，加入kh2po40.5g，mgso40.5g，vb10.01g密封后于121℃下高压蒸汽灭菌30min，作为发酵培养基。
将蛹虫草种子液接种于灭菌后的发酵培养基中，置于25℃下静止培养15天，取出干燥后得药性菌质。
3、提取完成后，使用hplc高效液相色谱法检测橄榄苦苷苷元的含量
高效液相色谱条件：c18色谱柱，洗脱系统为乙腈∶水＝20∶80，柱温为25℃，流速为1.0ml·min-1，进样量为20μl；
橄榄苦苷对照品溶液的制备：精密称取橄榄苦苷对照品，加入适量甲醇使其溶解，配制成浓度0.2、0.35、0.4、0.8、1mg·ml-1的对照品溶液；
橄榄苦苷苷元对照品溶液的制备：精密称取橄榄苦苷苷元对照品，加入适量甲醇使其溶解，配制成浓度0.2、0.35、0.4、0.8、1mg·ml-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：分别称取干燥后的女贞子粉、发酵后菌质约5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100ml，75℃水浴回流90min，过滤，蒸干溶剂，加入适量甲醇使其溶解，定容，即得。
将得到的对照品溶液和供试品溶液在上述高效液相条件下测定，即可得到发酵前后橄榄苦苷及其苷元的含量。
实施例2
一种蛹虫草发酵转化女贞子中橄榄苦苷生成其苷元的方法，包括以下步骤。
1、蛹虫草种子液的制备
蛹虫草菌株保存于斜面培养基中，取4-5块1cm2菌丝块接种于pda培养基中，放置于25℃恒温培养箱中，培养6天进行菌种活化。将活化后的菌种接种于种子液培养基中，于25℃、130r·min-1下在回旋式振荡器上恒温培养5天。
pda培养基：马铃薯200g·l-1，葡萄糖25g·l-1，琼脂15g·l-1，ph：自然；
种子液培养基：葡萄糖25g·l-1，酵母膏15g·l-1，kh2po41g·l-1，mgso41g·l-1，vb10.05g·l-1，ph：自然；
2、蛹虫草转化特女贞苷为苷元
取干燥好的女贞子，粉碎，过60目筛。称取粉碎后的女贞子50g，置于烧瓶中，加入70％乙醇450ml，在75℃下水浴回流90min，过滤，蒸干溶剂后得到醇提物粉末。按照1∶5的料液比加水，加入kh2po40.5g，mgso40.5g，vb10.01g密封后于121℃下高压蒸汽灭菌30min，作为发酵培养基。
将蛹虫草种子液接种于灭菌后的培养基中，置于25℃下静止培养15天，取出干燥后得药性菌质。
3、提取完成后，使用hplc高效液相色谱法检测橄榄苦苷苷元的含量
高效液相色谱条件：c18色谱柱，洗脱系统为乙腈∶水＝20∶80，柱温为25℃，流速为1.0ml·min-1，进样量为20μl；
橄榄苦苷对照品溶液的制备：精密称取橄榄苦苷对照品，加入适量甲醇使其溶解，配制成浓度0.2、0.35、0.4、0.8、1mg·ml-1的对照品溶液；
橄榄苦苷苷元对照品溶液的制备：精密称取橄榄苦苷苷元对照品，加入适量甲醇使其溶解，配制成浓度0.2、0.35、0.4、0.8、1mg·ml-1的对照品溶液；
供试品溶液的制备：分别称取干燥后的女贞子粉、发酵后菌质约5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％乙醇100ml，75℃水浴回流90min，过滤，蒸干溶剂，加入适量甲醇使其溶解，定容，即得。
将得到的对照品溶液和供试品溶液在上述高效液相条件下测定，即可得到发酵前后橄榄苦苷及其苷元的含量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。