本发明涉及寡肽粉的制备方法，尤其涉及一种利用南极磷虾壳制备寡肽粉的方法。
背景技术：
虽然我国的虾类资源非常丰富，但是虾在加工、食用过程中，占虾重将近40％的头、壳等却成为固体废弃物，其中大部分被丢弃或用于生产饲料，造成环境严重的污染，降低了虾头、壳的利用价值。寡肽的分子量一般在1000道尔顿以下，在人体不需消化，即可直接吸收，而南极磷虾虾壳中粗蛋白的含量超过50％，是制备寡肽粉的良好材料。
现有的对南极磷虾的利用只有制备多肽，申请号为201710201402.1的中国专利公开了一种具有降血脂能力的南极磷虾多肽制剂及其制备方法，得到分子量在7000Da以下的多肽，但是其制备方法复杂，而且利用的是整虾，而不是虾壳。
近年来，随着寡肽的应用价值越来越受到人们的重视，利用动物废弃物制备寡肽的研究也多有报道。如申请号为201310338921.4的中国专利公开了一种鱼皮胶原寡肽的制备工艺，得到纯度大于90％，分子量小于1000Da的胶原寡肽粉，但是其预处理步骤复杂，需要酸碱溶液分别浸泡，而且生产后期需要膜纯化的步骤。申请号为201510903014.9的中国专利公开了一种牦牛骨胶原寡肽的制备工艺，得到纯度大于90％，分子量小于1000Da的牦牛骨胶原寡肽，无需膜纯化的步骤，但是此工艺仍然需要酸碱溶液前处理。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用南极磷虾壳制备寡肽粉的方法，针对性的选择双酶酶解，调节合适的酶解条件，回收率高，并且简化了制备工艺，降低了制备成本，适于实际生产应用。
本发明的具体技术方案为：该方法包含以下步骤：
1)粉碎：南极磷虾壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎得虾壳粉；
2)第一次酶解：将虾壳粉与水混合后，在40-50℃保温10-20min，加入为虾壳粉质量0.1-0.3％的复合蛋白酶，保温酶解6-8h，然后灭酶冷却；
3)第二次酶解：调节pH至2.5-3.5，加入为虾壳粉质量0.1-0.3％的酸性蛋白酶，于35-40℃保温酶解4-6h，灭酶，得酶解液；
4)干燥：将酶解液pH调至中性，静置8-20h后收集上层清液，喷雾干燥后得寡肽粉。
一般情况下，制备寡肽所用的蛋白酶的用量一般为原料质量的1-30％，但是本发明通过选择合适的蛋白酶组合和适宜的反应条件，实现了蛋白酶的用量仅为原料质量的0.1-0.3％，极大的降低了成本；另外本发明无需特殊的前处理步骤，仅需将虾壳粉碎，不需要用酸溶液或碱溶液浸泡制备蛋白液，酶解结束后，寡肽的分子量较小而且分布均匀，也无需采用膜过滤步骤，因此工艺简单，再次降低了成本；所得分子量为1000Da以下的寡肽超过85％。
作为优选，所述步骤2)中的复合蛋白酶为由枯草杆菌深层液体发酵，经浓缩提取复合而成，酶活力为≥200000U/g。
作为优选，所述步骤3)中酸性蛋白酶为由黑曲霉培养发酵后制备而成，其平均分子量为35kDa，酶活力为20000-50000U/g。
复合蛋白酶是由枯草杆菌(Bsubtilis)深层液体发酵产生，经浓缩提取精制复合而成，是为水解蛋白质而研制的杆菌蛋白酶复合体。主要成分为碱性蛋白酶。与许多其它内切蛋白酶不同，复合蛋白酶即使在低水解度的情况下也能产出没有苦味的蛋白水解液，适用动物蛋白的水解，但是复合蛋白酶对蛋白质的水解位点无特异性，仅采用一种酶无法得到分子量较小，分子量分布较窄的寡肽，因此本发明中又采用了酸性蛋白酶，黑曲霉培养发酵制得的酸性蛋白酶主要成分为天冬氨酸蛋白酶，具有一定的位点特异性。两种酶在性质上差异较大，通过两种酶的双酶分步酶解，可将蛋白质水解为小分子量的寡肽，有利于蛋白质的水解。
作为优选，所述步骤2)中酶解的pH值为7.0-8.0。
作为优选，所述步骤2)中灭酶温度为85-95℃，灭酶时间为15-20min，冷却温度为50-60℃。
作为优选，所述虾壳粉与水的质量比为1∶(5-10)。
作为优选，所述步骤3)中灭酶温度为85-95℃，灭酶时间为10-20min。
作为优选，所述步骤4)中静置的温度为5-20℃。
作为优选，所述步骤4)中喷雾干燥的出风温度为30-40℃，进风温度为160-180℃。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明的制备方法工艺非常简单，无需酸碱溶液前处理，无需膜过滤后处理，仅采用复合蛋白酶和酸性蛋白酶两次水解即得所需产品，同时蛋白酶的用量小，极大的降低了生产成本，所得寡肽产率高，分子量小，寡肽粉的产量为240-300mg/g原料，其中分子量＜1000Da的肽段在85-90wt％之间，因此本发明的制备方法非常适用于工业生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
南极磷虾壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎得虾壳粉；将虾壳粉与水按质量比1∶5混合后，调节pH为7.0，在50℃保温10min，加入为虾壳粉质量0.3％的复合蛋白酶，保温酶解6h，升至95℃灭酶15min，冷却至50℃；调节pH至3.5，加入为虾壳粉质量0.1％的酸性蛋白酶，于35℃保温酶解6h，升温至85℃灭酶20min，得酶解液；将酶解液pH调至中性，20℃静置8h后收集上层清液；出风温度为30℃，进风温度为180℃喷雾干燥后得寡肽粉。
测定所得寡肽粉的蛋白回收率、肽含量、分子量＜1000Da的肽段含量、DPPH清除率(IC50)及抑菌效果，结果如表1所示。
本发明采用的DPPH清除率测定方法具体步骤为：
取1.5mL适当稀释的寡肽溶液，加入3.0mL 0.3mg/mL DPPH(95％乙醇溶液)，混合均匀室温避光放置5min，以95％乙醇为调零管，测定样品在517nm处吸光值。其中空白对照用95％乙醇溶液替代样品，标准品为抗坏血酸溶液，浓度分别为0.04、0.08、0.12、0.16mg/mL。抗坏血酸的IC50为0.13mg/mL。
本发明采用琼脂扩散法测定寡肽粉对大肠杆菌的抑菌效力，具体步骤为：
培养皿中加入15mL营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，加入100μL活化好的大肠杆菌菌悬液(菌龄为18-24h，106-107CFU/mL)均匀涂布，将寡肽溶液(过滤除菌)的6mm灭菌滤纸片轻放在平板表面，37℃培养24h，测定抑菌圈直径。以氨苄青霉素作为寡肽抗菌效果的对照药物，首先配制氨苄青霉素浓度为20μg/mL，然后采用2倍稀释法将氨苄青霉素溶液用灭菌去离子水稀释，根据上述实验方法测定不同浓度氨苄青霉素对大肠杆菌的抑菌圈直径，将寡肽溶液的抑菌圈直径与不同浓度氨苄青霉素形成的抑菌圈直径进行比较，确定寡肽溶液的抗菌效力。结果以每mg寡肽相当于氨苄青霉素的mg数表示，即mg AMP/mg样品。
实施例2
南极磷虾壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎得虾壳粉；将虾壳粉与水按质量比1∶10混合后，调节pH为8.0，在40℃保温20min，加入为虾壳粉质量0.1％的复合蛋白酶，保温酶解8h，升至85℃灭酶20min，冷却至60℃；调节pH至2.5，加入为虾壳粉质量0.3％的酸性蛋白酶，于40℃保温酶解4h，升温至95℃灭酶10min，得酶解液；将酶解液pH调至中性，5℃静置20h后收集上层清液，出风温度为40℃，进风温度为160℃喷雾干燥后得寡肽粉。
测定所得寡肽粉的蛋白回收率、肽含量、分子量＜1000Da的肽段含量、DPPH清除率(IC50)及抑菌效果，结果如表1所示。采用的DPPH清除率测定方法和琼脂扩散法测定寡肽粉对大肠杆菌的抑菌效力与实施例1相同。
实施例3
南极磷虾壳用水洗净、晾干，经粉碎机粉碎得虾壳粉；将虾壳粉与水按质量比1∶7混合后，调节pH为7.5，在45℃保温15min，加入为虾壳粉质量0.2％的复合蛋白酶，保温酶解7h，升至90℃灭酶18min，冷却至55℃；调节pH至3.0，加入为虾壳粉质量0.2％的酸性蛋白酶，于37℃保温酶解5h，升温至90℃灭酶15min，得酶解液；将酶解液pH调至中性，10℃静置15h后收集上层清液，出风温度为35℃，进风温度为170℃喷雾干燥后得寡肽粉。
测定所得寡肽粉的蛋白回收率、肽含量、分子量＜1000Da的肽段含量、DPPH清除率(IC50)及抑菌效果，结果如表1所示。采用的DPPH清除率测定方法和琼脂扩散法测定寡肽粉对大肠杆菌的抑菌效力与实施例1相同。
表1.寡肽粉的蛋白回收率、肽含量、分子量＜1000Da的肽段含量、DPPH清除率(IC50)及抑菌效果
根据表1，在本发明的实验参数范围内，蛋白回收率、肽含量、分子量＜1000Da的肽段含量、DPPH清除率(IC50)及抑菌效果都保持稳定，基本不变；对比例1(申请号CN201210161452.9)公开的一种利用虾壳制备抗氧化肽的方法，通过碱性蛋白酶酶解，超滤得到分子量小于5000Da的多肽，多肽浓度为0.646-0.699mg/mL(相当于9.9-10.8mg/g原料)，和对比例1相比，本发明的肽含量提高了约20倍，非常显著，并且分子量也降低了；对比例2(Food Chemistry，2014，148(4)：445-452)报道了虾副产物水解活性肽的DPPH清除率的IC50为1.42mg/mL，样品DPPH清除率的IC50值越小，证明活性肽抗氧化的效果越好，而本发明中寡肽粉的DPPH清除率的IC50仅有对比例2的约十分之一，抗氧化效果很强；综上，本发明中的寡肽粉不仅肽含量高，分子量小，而且活性也极佳。
本发明分别对6种蛋白酶在各自最适条件下的单酶水解和双酶水解南极磷虾虾壳的效果进行了比较，以水解度为指标，见表2。
表2.6种蛋白酶在各自最适条件下的单酶水解和双酶水解的水解度
表2中，第一行为第一次酶解所用蛋白酶，第一列为第二次水解所用蛋白酶，对角线的数据为单酶水解。根据表2可以看出，对于南极磷虾虾壳来说，先用复合蛋白酶酶解，再用酸性蛋白酶酶解，虾壳的水解度最高。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。