一种正相高效液相色谱纯化GHK三肽的方法与流程

本发明属于多肽纯化技术领域，具体涉及一种ghk三肽的纯化方法。

背景技术：

ghk三肽是一种含有三个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为h-gly-his-lys-oh，ghk-cu在医学上最早用于促进伤口愈合及增进肌肤弹性，近来部分研究认为能改善细纹，ghk有丰唇之功效，使用在唇膏的生产上，使用后使嘴唇看起来丰润柔亮，拥有独特的唇景，也是安全的丰胸产品的必备原料。

经典的固相多肽合成方法合成ghk原材料价格贵、成本高、产率低，不适合规模化生产，同时经典常规的c18反相色谱纯化方法中，ghk极性大而不保留，造成经典的c18反相色谱纯化方法难以达到纯化目的。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于克服现有c18反相色谱纯化方法中，ghk极性大而不保留，造成经典的c18反相色谱纯化方法难以达到纯化目的的缺点，提供一种成本低、效率高、简单易行、易规模化生产的正相高效液相色谱纯化ghk三肽的方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、溶样

将合成的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品加入甲醇与乙醇体积比为2:8～4:6的混合液中，超声分散后用滤膜过滤，收集滤液。

2、纯化

采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为层析硅胶，流动相a为正己烷，流动相b为无水乙醇，将色谱柱用流动相b:15％平衡后，用流动相b:15％累加进样，每隔2～5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3～1/5，样品全部进完后进行梯度洗脱，收集纯化后的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh溶液，减压浓缩，得到纯度95％以上的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh。

3、脱保护

将纯度95％以上的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3～4小时，减压浓缩，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤，旋转蒸发，冻干，得到纯度95％以上的ghk三肽。

上述溶样步骤1中，优选将合成的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品加入甲醇与无水乙醇体积比为2:8～4:6的混合液中，超声分散后用0.45μm有机滤膜过滤。

上述纯化步骤2中，按照步骤1中boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品的质量加入三氟乙酸与二氯甲烷体积比为1:1的混合液，优选boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品与所述混合液的质量-体积比为1g:10～20ml。

上述纯化步骤2中，所述色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶；洗脱梯度为：流动相b15％～17％20～60min、40％～85％30～70min、75％～85％恒流，优选洗脱梯度为：流动相b15％20min、40％～75％60min、75％恒流；色谱的检测波长为200～240nm；样品流速为20～50ml/min。

本发明的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品是以boc-gly-oh、h-his(trt)-oh、h-lys(boc)-oh、二环己基碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺为原料，用液相合成方法首先合成boc-gly-osu，boc-gly-osu与h-his(trt)-oh形成二肽boc-gly-his(trt)-oh后，再与hosu形成活泼脂boc-gly-his(trt)-osu，最后与h-lys(boc)-oh反应制备而成。

本发明先用正相高效液相色谱纯化boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品后，再脱除保护基，利用ghk三肽极性大的特性而有效除去保护基及使用的有机溶剂残留，从而达到ghk三肽的纯化目的。该方法得到的ghk三肽的纯度可达95％以上，而且脱保护并不影响正相色谱纯化boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh后的纯度，解决了反相色谱法纯化ghk三肽时，ghk三肽在反相色谱柱中极性大不保留的问题，而且正相色谱中采用累加进样分离法，可以提高有效柱容量，节省大量时间和消耗，可达到成本低、收率高、效率高、简单易行、规模产业化生产的要求。

附图说明

图1是实施例2纯化后的ghk三肽质谱图。

图2是实施例2纯化后的ghk三肽色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、溶样

称取1gboc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh，用60ml甲醇与无水乙醇体积比为2:8的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液。

2、纯化

采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，柱子规格为4cm×20cm，填装体积为70ml，流动相a为正己烷，流动相b为无水乙醇，将色谱柱用流动相b:17％平衡后，用流动相b:17％累加进样，每隔2min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/4，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相b17％20min、45％～85％70min、85％恒流，样品流速为20ml/min，检测波长为200nm。收集纯化后的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度95.5％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh。

3、脱保护

将纯度95.5％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh加入15ml三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度95.6％的ghk三肽0.531g，收率61％。

实施例2

1、溶样

称取1gboc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品，用60ml甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液。

2、纯化

采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，柱子规格为4cm×20cm，填装体积为70ml，流动相a为正己烷，流动相b为无水乙醇，将色谱柱用流动相b:15％平衡后，用流动相b:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相b15％20min、40％～75％60min、75％恒流，样品流速为30ml/min，检测波长为215nm。收集纯化后的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度98.2％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh。

3、脱保护

将纯度98.5％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh加入15ml三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到ghk三肽0.592g，收率68％。

发明人采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1。由图1可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与ghk三肽的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为ghk三肽。采用液相色谱仪对得到的产物的纯度进行测定，分析条件为：色谱柱c185μm250×4.6mm，流速0.8ml/min，检测波长215nm，流动相a：体积浓度0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相b：体积浓度0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，洗脱条件：流动相b1％恒流15min，分析结果见图2。由图2可见，所制备的ghk三肽的出峰时间约为6.2分钟，纯度为98.5％。

实施例3

1、溶样

称取1gboc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品，用60ml甲醇与无水乙醇体积比为4:6的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液。

2、纯化

采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200～300目的层析硅胶，柱子规格为4cm×20cm，填装体积为70ml，流动相a为正己烷，流动相b为无水乙醇，将色谱柱用流动相b:16％平衡后，用流动相b:16％累加进样，每隔4min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/5，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相b16％20min、50％～80％60min、80％恒流，样品流速为50ml/min，检测波长为240nm。收集纯化后的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度95.8％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh。

3、脱保护

将纯度95.8％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh加入15ml三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应3小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度96.2％的ghk三肽0.556g，收率64％。

实施例4

1、溶样

称取5gboc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品，用60ml甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液备用。

2、纯化

采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200-300目的层析硅胶，柱子规格为5cm×40cm，填装体积为300ml，流动相a为正己烷，流动相b为无水乙醇，将色谱柱用流动相b:15％平衡后，用流动相b:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相b15％20min、40％～75％60min、75％恒流，样品流速为30ml/min，检测波长为215nm。收集纯化后的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度98.1％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh。

3、脱保护

将纯度98.1％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh加入75ml三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.3％的ghk三肽2.6g，收率60％。

实施例5

1、溶样

称取50gboc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品，用100ml甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液备用。

2、纯化

采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200-300目的层析硅胶，柱子规格为5cm×40cm，填装体积为300ml，流动相a为正己烷，流动相b为无水乙醇，将色谱柱用流动相b:15％平衡后，用流动相b:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相b15％20min、40％～75％30min、75％恒流，样品流速为30ml/min，检测波长为215nm。收集纯化后的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度98.0％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh。

3、脱保护

将纯度98.0％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh加入750ml三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.1％的ghk三肽28.7g，收率66％。

实施例6

1、溶样

称取150gboc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh粗品，用150ml甲醇与无水乙醇体积比为3:7的混合溶液溶解，待溶液完全澄清，用0.45μm有机滤膜过滤，收集滤液备用。

2、纯化

采用正相高效液相色谱对滤液进行纯化，色谱柱填料为粒径200-300目的层析硅胶，柱子规格为10cm×50cm，填装体积为2500ml，流动相a为正己烷，流动相b为无水乙醇，将色谱柱用流动相b:15％平衡后，用流动相b:15％累加进样，每隔5min进样一次，每次进样量为样品总体积的1/3，样品全部进完后进行梯度洗脱，洗脱梯度为：流动相b15％60min、40％～75％60min、75％恒流，样品流速为50ml/min，检测波长为215nm。收集纯化后的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh溶液，在40℃减压浓缩，得到纯度97.8％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh。

3、脱保护

将纯度97.8％的boc-gly-his(trt)-lys(boc)-oh加入2250ml三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:1的混合液中，室温搅拌反应4小时，减压蒸干二氯甲烷，加入甲基叔丁基醚，析出白色固体，过滤，将白色固体溶解于蒸馏水中，用甲基叔丁基醚洗涤3次，旋转蒸发除去有机溶剂残留，冷冻干燥，得到纯度98.0％的ghk三肽81.0g，收率62％。