莱茵衣藻LRR基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
与环境污染治理领域，具体涉及莱茵衣藻lrr基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
背景技术：
：随着重工业的发展，环境的污染日趋严重，其中重金属污染尤为严重。重金属为相对密度大于5g/cm3的金属，重金属在土壤，大气，水环境中难以被降解。目前主要的治理方法为物理治理，化学治理和生物治理，其中物理、化学治理耗材较贵，操作繁琐。而生物治理是通过一些微生物和藻类进行富集重金属，再通过回收微生物和藻类达到回收重金属的目的，整理来说生物治理耗材较少，操作简便，是未来污水重金属富集与回收的一种重要手段之一。利用藻类对于水环境中重金属污染进行治理存在众多的优势。首先藻类适应性很强，易于培养，藻类的细胞壁本身就有一定的吸附重金属的作用，能够在含有一定重金属的水环境中生存，以富含重金属的水环境为生活区域，通过自身的代谢将重金属富集，通过回收藻类能够达到回收重金属的目的，从而有效的解决重金属水环境的污染。其次，莱茵衣藻的基因测序已完成，利用插入突变获得突变体的方法成熟(见专利201611022254.9)，比较容易得到对各种重金属有富集作用的突变藻株。本发明利用插入突变的方法获得了对重金属镉具有明显抗性的突变藻株，经鉴定得到了对衣藻镉代谢调控相关的基因lrr及其编码蛋白。lrr基因突变体的编码蛋白有一段富含亮氨酸(leucinerichrepeat)的结构域，富亮氨酸序列基本骨架为lxxlxxlxxlxlxgxxlxxxipxx(l为亮氨酸，x为不确定氨基酸)，其基本结构由β片层和α螺旋构成。有研究报道，富亮氨酸重复序列在植物的抗病基因中广泛存在，而在有关重金属镉代谢调控方面尚无相关的研究报道。本发明获得的lrr基因突变的藻株，对重金属镉具有非常明显的抗性，能够在较高浓度镉的环境下生存，可进一步研究衣藻重金属镉代谢调控机制，为利用藻类进行污水处理奠定基础。技术实现要素：本发明的首要目的在于提供莱茵衣藻lrr基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于lrr基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本发明的目的还在于提供莱茵衣藻lrr基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉耐受性增强藻株的获得方法以及镉耐受性增强藻株的应用等。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅷ片段随机插入衣藻中得到了明显抗氯化镉的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的抗镉性是由于aphⅷ片段插入到lrr基因的第一个外显子中造成的。通过莱茵衣藻数据库比对，lrr基因的编号为cre06.g302700，定位于衣藻6号染色体的7815997-7822578区域，其cds序列如seqidno:1所示。基于上述发现，本发明的主要目的之一是提供莱茵衣藻lrr基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。所述lrr基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：(1)包含如seqidno:1所示1674bp的核苷酸序列；(2)包含编码seqidno:2所示蛋白质的核苷酸序列；(3)包含与seqidno:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述lrr基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：(1)包含如seqidno:2所示氨基酸序列；(2)包含由seqidno:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与seqidno:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。所述lrr基因的编码蛋白中含有一段富亮氨酸的结构域。本发明的目的之二是提供上述莱茵衣藻lrr基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻lrr基因的表达、使lrr基因失活或缺失lrr基因提高莱茵衣藻镉耐受性。本发明的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻lrr基因提高莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻lrr基因的表达、使lrr基因失活或缺失lrr基因提高莱茵衣藻镉耐受性。本发明的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株。所述镉耐受性增强藻株为不含lrr基因活性的lrr基因突变株或lrr基因缺失株，或lrr基因表达下降的lrr基因表达缺陷株。本发明的目的之五是提供一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻lrr基因突变株，通过构建crispr载体进而获得莱茵衣藻lrr基因缺失株，通过构建rnai干涉载体进而获得莱茵衣藻lrr基因表达缺陷株。本发明的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉耐受性增强藻株在重金属镉污染的监测、检测与治理中的应用。根据莱茵衣藻的lrr基因表达缺陷株、lrr基因突变株或lrr基因缺失株可以在较高浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测、检测和治理中，尤其可应用于污水中镉的监测、检测和治理中，为生物法污水处理提供一种的新的思路与新的材料。同时，研究lrr基因调控衣藻对重金属镉的耐受性的机制，可以进一步为生物法污水治理奠定理论基础。本发明的有益效果是：(1)本发明通过电击转化法将aphⅷ片段导入衣藻中，通过抗性筛选的到对镉有一定抗性的突变体藻株(lrr)方法简单，效率高。(2)本发明通过resda-pcr技术鉴定出突变体突变基因及插入突变位点，用于研究衣藻对重金属镉代谢机制。(3)本发明通过0.6mm氯化镉筛选，并通过含0.6mm氯化镉固体培养基复筛得到对镉有抗性的突变体藻株的方法用时短，方法可行，得到的突变体性状稳定。(4)本发明得到lrr基因缺陷的突变体对0.6mm氯化镉有一定的抗性，可用于水环境中镉污染的检测、监控和治理中。附图说明图1为pjmg-aphⅷ质粒用ecorⅰ酶切后琼脂糖凝胶电泳图。图2为野生型莱茵衣藻21gr和重金属镉抗型突变体(lrr)在0.6mm氯化镉条件下的生长对比图。图3为重金属镉抗型突变体经resda-pcr后的琼脂糖凝胶电泳图。图4为重金属镉抗型突变体中lrr基因的插入突变位点示意图。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用培养基配方如下：tap培养基配方：tris1.21g、solutioni(盐溶液)12.5ml、solutionⅱ(磷酸盐)0.188ml、solutioniii(微量元素)0.5ml、gaa(冰醋酸)0.5ml，按顺序加各组分，定容至500ml即可。固体培养基则加入7.5gagar(琼脂)。tagp培养基配方：tris1.21g、solutioni(盐溶液)12.5ml、甘油磷酸钠(1m)0.376ml、solutioniii(微量元素)0.5ml、gaa(冰醋酸)0.5ml，按顺序加各组分，定容至500ml即可。若要配制固体培养基则加入7.5gagar(琼脂)。实施例1：电转化法获得随机插入aphⅷ片段的衣藻转化子(1)利用前期构建好的质粒pjmg-aphⅷ(zhangfenghu,yinwenliang,weihe,junminpan*,ciliadisassemblywithtwodistinctphasesofregulation,cellreports,2015,10(11):1803-1810)，该质粒中含有编码巴龙霉素抗性的aphⅷ片段，将pjmg-aphⅷ质粒进行过夜酶切处理(ecorⅰ酶切)，再将酶切的质粒进行dna琼脂糖凝胶电泳分离aphⅷ片段(如图1所示)，胶回收获得aphⅷ片段(序列如seqidno:3所示)。(2)将野生型衣藻21gr从tap固体培养基转接至含有tap液体培养基的吹气瓶中，在连续光照条件下吹气培养3天，使其浓度达到1.5×107个细胞/ml。将培养好的细胞转接至含有tap液体培养基的三角瓶中(100ml培养基加入10ml吹气瓶中培养的细胞)，使其初始浓度为1.5×106个细胞/ml，置于摇床上，在连续光照条件下培养20小时，摇床转速为200rpm/min。(3)20小时后衣藻细胞浓度达到6×106个细胞/ml，在超净工作台内收集60ml细胞至50ml灭菌离心管中，2500rpm离心3min。在超净工作台内倒去上清，用预冷的tap+60mm山梨醇液体(含60mm山梨醇的tap液体培养基)重悬，2500rpm离心3min。在超净工作台内倒去上清，加入1ml的tap+60mm山梨醇液体，冰上放置10min。此时，将无菌电击杯预冷，将aphⅷ片段准备好。(4)10min后，在超净工作台内将250μl预冷的细胞加入无菌的电击杯中，随后加入100-200ng的aphⅷ片段，转移至冰上放置。调整电击仪参数(电压800v，电阻1575ω，电容50μf)，用纸迅速擦干电击杯外壳并放入电击仪中，夹紧电击杯，放下安全罩进行电击，点击时间应控制在10-14ms。电击结束后将电击杯转移至冰上放置10min。(5)10min后将电击后的细胞加入至含10mltap+60mm山梨醇的50ml灭菌离心管中，封口，包上锡箔纸，室温下，摇床上慢速且避光修复过夜。此时准备20％的淀粉：称取4g淀粉于50ml离心管中，加入无水乙醇洗一遍，1000rpm离心2min，倒去上清，加入ro水洗两遍，1000rpm，离心2min，倒去上清，加入70％乙醇，放置过夜。(6)于第二天取出一定量70％乙醇中的淀粉，1000rpm离心1min，在超净工作台内倒掉上清，用tap+60mm山梨醇洗4次，1000rpm离心1min。淀粉洗完后，将避光修复过夜的衣藻细胞进行离心，2500rpm，3min。每管细胞中加入1ml加入tap+60mm山梨醇的淀粉重悬液，并涂在含巴龙霉素(10μg/ml)的tap固体培养基上，待其干燥后，用封口膜封口，在光周期(14h光照/10h黑暗)条件下倒置培养，约7天左右转化子长出。实施例2：筛选转化子获得氯化镉抗型突变体藻株(1)将衣藻转化子用灭菌的牙签从含巴龙霉素的tap固体培养基上挑至tagp固体培养基上，每一个转化子对应一个编号。然后将其放至光周期下培养3天，再将其挑至含有0.6mm氯化镉的tagp固体培养基上，编号与tagp固体培养基上的编号对应，野生型21gr作为对照。0.6mm氯化镉的筛选浓度为申请人前期实验获得的重金属镉抗型突变体的最佳筛选浓度，具体见专利201611022254.9。(2)将含有转化子的0.6mm氯化镉固体培养基放至光周期下培养3-4天，然后观察和记录转化子在0.6mm氯化镉固体培养基上的生长情况，若在野生型衣藻死亡时有转化子在上面能够生长，将对应的转化子从tagp固体培养基上挑至0.6mm氯化镉固体培养基上复筛。反复复筛3-5次后，转化子依旧正常生长而21gr不能正常生长，则此转化子为氯化镉抗型突变体，图2为所筛选lrr基因突变体(lrr)与野生型衣藻在含0.6mm氯化镉固体培养基上的生长情况。实施例3：提取突变体的基因组(1)将突变体从tagp固体培养基上用灭过菌的牙签挑至tap液体培养基中培养4天。(2)收集细胞，2500rpm离心3min，弃上清，用4ml液体培养基重悬细胞，用移液枪吸取1ml细胞转移至1.5mlep管中，14000rpm离心1min，弃上清，将细胞放入液氮中冷冻，-80℃储存备用。(3)将冷冻的细胞拿出加入650μl预热的ctab裂解液，充分吹打混匀细胞，放置在65℃水浴锅中水浴1小时，每隔10min颠倒ep管使其充分裂解。(4)加入650μl的pci(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，pci在加入前应充分摇匀，加入后上下颠倒ep管使其充分混匀，14000rpm离心10min。(5)将上清大约500μl移至新的1.5mlep管中，加入等体积500μl的ci(氯仿：异戊醇＝24:1)，ci在加入前应充分摇匀，加入后上下颠倒ep管使其充分混匀，14000rpm离心10min。(6)将上清大约400μl移至新的1.5mlep管中，加入0.7倍体积(280μl)的异丙醇，上下颠倒混匀ep管，-20℃放置15min，14000rpm离心10min后会出现dna白色沉淀，去上清。(7)用无水乙醇配置70％乙醇，洗涤dna沉淀三次，每次用1ml70％乙醇，14000rpm离心5min，最后一次洗涤完毕后，用20μl的移液枪吸去残留的70％乙醇。干燥dna(60℃2min)，加入40μlddh2o溶解dna，再加入1μlrnase，37℃消化过夜。(8)吸取2μldna进行琼脂糖凝胶电泳，检测突变体基因组dna提取情况。实施例4：获得氯化镉抗型莱茵衣藻突变体的突变基因序列及插入突变位点根据插入片段aphⅷ的核酸序列设计特异引物f-z2和f-z8，根据衣藻基因组特点设计引物q0和由q0与alui、psti、sacii、taqi限制性内切酶特异识别序列组成的简并引物degalui、degpsti、degsacii、degtaqi。以突变体的基因组dna作为模板，通过resda-pcr得到四种扩增产物(图3所示，其中a、p、s、t分别代表包含alui、psti、sacii、taqi限制性内切酶的扩增产物)，通过琼脂糖凝胶电泳将500bp以上的序列切胶送测序，将测序结果与aphⅷ片段通过ncbiblast进行比对，得到被插入突变的基因的部分序列，在phytozome网站上的衣藻数据库中进行序列比对，可获得突变基因的核酸序列、编码蛋白以及插入位点等信息。如图4所示，本发明所获得的氯化镉抗型突变体lrr是由于aphⅷ片段正向(5’-3’端)插入到lrr基因的第一个外显子中而形成的突变体。resda-pcr所用引物序列见下表所示：引物名称5′—3′f-z2ttttaccggctgttggacf-z8agttcttctgagggacctgq0ccagtgagcagagtgacgdegaluiccagtgagcagagtgacgiiiiinnswcagcttdegpsticcagtgagcagagtgacgiiiiinnsctgcagwdegsaciiccagtgagcagagtgacgiiiiinnsccgcggwdegtaqiccagtgagcagagtgacgiiiiinnswgtcgaa上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江汉大学<120>莱茵衣藻lrr基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1674<212>dna<213>chlamydomonasreinhardti<400>1atgtcagtttcaacccacgccgcgggcgactcaactgcccaaacggaagcaactcgggtg60acttcatcgagcagcgattccgcgagcctgcgccaggcccgcaggcgcacggtgacgcag120gctgctgagcccgctccgcaatccactggcctcccgcctgttgcggtcgctgttgccgcg180gtcgcgggtatcggtgtgctcgcggttttgtacaacaagttcttcgccagtgttggcagc240ggcgccaggtctgcagtggagaccctgccgcaggccgtcagccagggcatgcagcaaaag300cggctgcaaaaggacgcgcaggcgcggctgaacgagatgtgtgatcagctgcggtcgcaa360cacgccgtggatctgtcggccaagaacctgggcgacgagggcactgcctatgtggtggag420gctctcgccttcaacaccacctgccgcgccctggacctaagcaagaacggcattggaggc480gggctgggtgcggcggcgctggtgcaggtgctgcccagcgccgtgatccagacgctggtg540ctcaacaccaacagcctgggcgacggcggctcggagcagctggccaaggccattgcgggc600cacccgcacctgaccactctggacctgggccagaacggcatcggcgacgccggcgccacc660gcgctggccgaggcgctcaagctcaacacgcggctgcagcggctggacctgtccggcaat720gccatcgacaaggacggcgcggcggcgctggcgggcgcggtggcggggagcagcacgctc780gaggtgctggtgctgacggacaactacctgggcgaggccggcgcgctggcgctggcggac840gcactgcgggccaacaccagcgtcaaggagctgcaccttaagggcaacgagatgggtgat900gcgggcgtcacggccatctgcgaggcgctaatgtcccgcgcctgcgacatcaccttcctg960gacctgggcaacaacagcatcacggaggcgggcgccacgcacctgaaccggctgctgttc1020cagaagcgctccctcaaggagctgcacatgtacatgaacgacatcggggacgagggcgtg1080ggcaagatggctcagtccattgcggacaacaaggggctgtcggtgctggacctgggcggc1140aacaacatcgggcccaagggtgtggcggtgctggcgggcgcactgcgcaaccacggcgcg1200ctgagctccctagagctgggctacaacccgttggggccggagggcactaagaccatcacc1260gacctcgcaaagttccaactgcccaagctgaccacgctcaagctgggttggtgcaaggtg1320gcgggcggcgacggcgcccgcgcgctgtctgacctgctgctgctcaacgccagcctcacg1380cacctggacctgcgcggcaacagcctgggcaacgacggagccatcctgctgtcgcgcggc1440ctcaaggccgccgagaacagcaagctcgcggatctggacctgggctacaacgagatcaag1500gacgacggggcgtgcgcgctggcccaggcgctaaaagccaaccccgagggcgcccctcgt1560gagctgaagcttaactcgaactacattacccgattcggtcaggtggcgctgagcgaggcc1620gtggaccaggtgttcgacatgggcggcggtaagatgaccaccgtgcacttctag1674<210>2<211>557<212>prt<213>chlamydomonasreinhardti<400>2metservalserthrhisalaalaglyaspserthralaglnthrglu151015alathrargvalthrserserserseraspseralaserleuarggln202530alaargargargthrvalthrglnalaalagluproalaproglnser354045thrglyleuproprovalalavalalavalalaalavalalaglyile505560glyvalleualavalleutyrasnlysphephealaservalglyser65707580glyalaargseralavalgluthrleuproglnalavalserglngly859095metglnglnlysargleuglnlysaspalaglnalaargleuasnglu100105110metcysaspglnleuargserglnhisalavalaspleuseralalys115120125asnleuglyaspgluglythralatyrvalvalglualaleualaphe130135140asnthrthrcysargalaleuaspleuserlysasnglyileglygly145150155160glyleuglyalaalaalaleuvalglnvalleuproseralavalile165170175glnthrleuvalleuasnthrasnserleuglyaspglyglyserglu180185190glnleualalysalailealaglyhisprohisleuthrthrleuasp195200205leuglyglnasnglyileglyaspalaglyalathralaleualaglu210215220alaleulysleuasnthrargleuglnargleuaspleuserglyasn225230235240alaileasplysaspglyalaalaalaleualaglyalavalalagly245250255serserthrleugluvalleuvalleuthraspasntyrleuglyglu260265270alaglyalaleualaleualaaspalaleuargalaasnthrserval275280285lysgluleuhisleulysglyasnglumetglyaspalaglyvalthr290295300alailecysglualaleumetserargalacysaspilethrpheleu305310315320aspleuglyasnasnserilethrglualaglyalathrhisleuasn325330335argleuleupheglnlysargserleulysgluleuhismettyrmet340345350asnaspileglyaspgluglyvalglylysmetalaglnserileala355360365aspasnlysglyleuservalleuaspleuglyglyasnasnilegly370375380prolysglyvalalavalleualaglyalaleuargasnhisglyala385390395400leuserserleugluleuglytyrasnproleuglyprogluglythr405410415lysthrilethraspleualalyspheglnleuprolysleuthrthr420425430leulysleuglytrpcyslysvalalaglyglyaspglyalaargala435440445leuseraspleuleuleuleuasnalaserleuthrhisleuaspleu450455460argglyasnserleuglyasnaspglyalaileleuleuserarggly465470475480leulysalaalagluasnserlysleualaaspleuaspleuglytyr485490495asngluilelysaspaspglyalacysalaleualaglnalaleulys500505510alaasnprogluglyalaproarggluleulysleuasnserasntyr515520525ilethrargpheglyglnvalalaleuserglualavalaspglnval530535540pheaspmetglyglyglylysmetthrthrvalhisphe545550555<210>3<211>2118<212>dna<213>chlamydomonasreinhardti<400>3aattcgatctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaatt60aatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatg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