莱茵衣藻VPS9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
和污水治理领域，具体涉及莱茵衣藻vps9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
背景技术：
：随着社会经济和工业化生产的飞速发展，环境污染问题日趋严重，特别是重金属污染问题。重金属污染的来源有很多，工厂排出的“三废”(废水、废渣和废气)、汽车尾气、农药残留以及人们日常活动中产生的各种生活垃圾和废旧电子产品等均含有重金属，“三废”的超标违规排放以及生活垃圾、废旧电子产品的随意丢弃等极容易造成有毒有害的重金属在土壤、空气和水体中大量积累。而重金属具有长期性和不可降解性，难以被微生物进行降解，能够长时间存在土壤和水体中，随着饮用水和食物链最终会在人体中逐步积累，直接危害人类健康。镉污染是一种常见的重金属污染，主要是随着电镀、冶金、采矿、电池和化学工业等的废水和废渣的排放积累到水体和土壤中。镉不是人体必需元素，正常人的血液中的镉浓度小于5μg/l，尿液中小于1μg/l。镉可以在人体内不断积累，通过与金属硫蛋白形成镉硫蛋白积累到肾脏和肝脏中，影响泌尿系统的正常功能，镉还能够影响骨镉中的钙，造成骨骼严重软化，引起骨痛病，另外镉还可以干扰人体对二价金属元素的吸收，造成铁、铜、锌等元素的缺乏。早在1984年，联合国环境规划署就已经将镉列入具有全球意义的12种危害物之一。目前，对重金属污染的治理主要有物理化学法(化学沉淀法、活性炭吸附法、高分子捕集剂法、溶剂萃取法、离子交换法、膜分离等)和生物法(微生物絮凝法、生物吸附法、植物修复法等)。相比较而言，传统的物理化学法往往成本较高、操作复杂，适合集中处理高浓度的重金属污染区域，如果大面积的使用则容易造成二次污染。而对于大流域、低浓度的重金属污染生物法治理具有更多的优势，不仅投入成本低、操作简单，而且容易避免和减少二次污染的问题。目前，利用微生物进行重金属污水治理成为的研究人员的关注热点，与动植物相比，微生物体积小、表面积大、繁殖快、适应能力强、易于培养等特点，被广泛研究用于重金属污水处理中。能够吸附和代谢重金属的微生物种类很多，主要包括一些工程细菌、真菌和藻类等。藻类是进行重金属污染水体修复的理想生物材料之一，目前被报道的可用于重金属污水治理的藻类种类很多，例如：莱茵衣藻、小球藻、马尾藻、四尾栅藻、团扇藻和螺旋藻等。不同的藻类往往对不同重金属的吸附效果也不同，许多研究表明藻类对多种重金属均有很好吸附能力，可以广泛应用于重金属污染水域的重金属富集回收及水体改造等方面。莱茵衣藻是一种单细胞的真核生物，直径约10μm，细胞质中有一个大型杯状叶绿体，能够进行光合作用，因此被称为“绿色酵母”。在衣藻细胞的顶端具有两根鞭毛，可以游动，在细胞侧面还有可感光的眼点。莱茵衣藻同时具有动物细胞和植物细胞的特征，核基因为单倍体且基因组测序工作也已经完成，更重要的是莱茵衣藻有成熟的遗传转化体系，突变体容易获得，且细胞培养容易，生长速度快，繁殖快，已成为了科学研究的重要模式生物。本发明利用电转化法将aphⅷ片段随机插入衣藻中，得到了对氯化镉十分敏感的突变藻株，进一步鉴定得到了与重金属镉耐受性调控相关的基因vps9及其编码蛋白，可应用于镉污染水域的监控与检测中，为生物法污水中重金属镉的检测与水体改造提供新生物材料，同时也为进一步研究衣藻对重金属镉的耐受机制奠定基础。技术实现要素：本发明的首要目的在于提供莱茵衣藻vps9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于vps9基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本发明的目的还在于提供莱茵衣藻vps9基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法以及镉敏感型藻株的应用等。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅷ片段随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅷ片段插入到vps9基因7个内含子中造成的。vps9基因属于鸟苷酸转换因子，能够促进小g蛋白上的gdp和gtp相互转换。vps9基因在jgi莱茵衣藻基因数据库中的基因编号是cre12.g547450，位于莱茵衣藻第12号染色体的8552458-8559307区域，其cds序列如seqidno:1所示。基于上述发现，本发明的目的之一是提供莱茵衣藻vps9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。所述vps9基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：(1)包含如seqidno:1所示3483bp的核苷酸序列；(2)包含编码seqidno:2所示蛋白质的核苷酸序列；(3)包含与seqidno:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述vps9基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：(1)包含如seqidno:2所示氨基酸序列；(2)包含由seqidno:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与seqidno:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。本发明的目的之二是提供上述莱茵衣藻vps9基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻vps9基因的表达、使vps9基因失活或缺失vps9基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。本发明的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻vps9基因降低莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻vps9基因的表达、使vps9基因失活或缺失vps9基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。本发明的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉敏感型藻株。所述镉敏感型藻株为不含vps9基因活性的vps9基因突变株或vps9基因缺失株，或vps9基因表达下降的vps9基因表达缺陷株。本发明的目的之五是提供一种莱茵衣藻敏感型藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻vps9基因突变株，通过构建crispr载体进而获得莱茵衣藻vps9基因缺失株，通过构建rnai干涉载体进而获得莱茵衣藻vps9基因表达缺陷株。本发明的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在重金属镉污染的监测、检测中的应用。根据莱茵衣藻的vps9基因表达缺陷株、vps9基因突变株或vps9基因缺失株对重金属镉的敏感性，只能在较低浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测和检测中，尤其可应用于污水中镉的监测和检测中，如所述莱茵衣藻镉敏感型藻株可以监测环境水体中的镉含量是否超标，方便检测环境中镉污染程度并起到预防或者改善环境镉污染。所述莱茵衣藻镉敏感型藻株应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的状况，为水体中重金属镉的检测、以及生物法处理污水提供一种新的思路与新的材料。同时，研究vps9基因调控衣藻对重金属镉的耐受性的作用机制，可以进一步为生物法污水治理奠定理论基础。本发明的有益效果是：(1)本发明发现的vps9基因及其编码蛋白是一种新的与重金属镉耐受性调控相关的基因及蛋白，目前尚未见相关的研究报道。(2)本发明中采用的获得与莱茵衣藻中重金属镉调控相关的基因和突变体的方法简单、技术体系成熟，能够进一步改进和应用到其他的藻类或模式植物中。(3)本发明提供的vps9基因具有插入约2k左右片段(aphⅷ)的插入突变体，突变体表现出了明显的对重金属镉敏感的特性，有利于进一步研究vps9基因在衣藻重金属镉吸附和代谢调控中的作用机制。(4)藻类是研究生物法治理重金属水体污染的重要模式生物，本发明中获得的vps9基因突变体(hm6)相对于野生型来说只能在含较低浓度氯化镉的条件下生长，可应用于镉污染水域的监控与检测中，为污水的检测与治理提供新的思路与生物材料。附图说明图1为pjmg-aphⅷ质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图。图2为野生型莱茵衣藻21gr和氯化镉敏感型衣藻突变体hm6在含0.4mm的氯化镉的固体平板上的生长对比图。图3为氯化镉敏感型衣藻突变体(hm6)经resda-pcr后琼脂糖凝胶电泳图。图4为氯化镉敏感型衣藻突变体(hm6)的vps9基因插入突变位点示意图。具体实施方式为了使相关人员能够更好的理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明进行详细的说明。实施例中没有明确说明的方法均为常规的实验方法。下述实施例中所用培养基配方如下：tap培养基配方：tris1.21g、solutioni(盐溶液)12.5ml、solutionⅱ(磷酸盐)0.188ml、solutioniii(微量元素)0.5ml、gaa(冰醋酸)0.5ml，按顺序加各组分，定容至500ml即可。固体培养基则加入7.5gagar(琼脂)。tagp培养基配方：tris1.21g、solutioni(盐溶液)12.5ml、甘油磷酸钠(1m)0.376ml、solutioniii(微量元素)0.5ml、gaa(冰醋酸)0.5ml，按顺序加各组分，定容至500ml即可。若要配制固体培养基则加入7.5gagar(琼脂)。实施例1一、通过电转化法获得莱茵衣藻转化子(1)准备aphⅷ片段将含有aphⅷ片段的pjmg-aphⅷ质粒(zhangfenghu,yinwenliang,weihe,junminpan*,ciliadisassemblywithtwodistinctphasesofregulation,cellreports,2015,10(11):1803-1810)用ecorⅰ酶37℃酶切过夜，1％琼脂糖凝胶电泳分离aphⅷ片段(2118bp，序列如seqidno:3所示)，酶切后电泳结果如图1所示，其中m为bm5000dnamarker，1为pjmg-aphⅷ质粒ecorⅰ酶酶切产物，2k左右的条带即为aphⅷ片段。用生工公司凝胶回收试剂盒(货号为b518191-0100)进行胶回收aphⅷ片段，q5000超微量核酸检测仪测定回收dna片段的浓度，-20℃保存备用。(2)准备用于电转化的衣藻细胞莱茵衣藻21gr在tap固体平板上进行活化，然后转接至tap液体培养基中进行吹气培养，置于连续光照(24h光照)条件下吹气培养3-4天可达到1×107细胞/ml。取10ml上述衣藻细胞转接至含100mltap液体培养基的三角瓶中使初始浓度为1×106细胞/ml，置于摇床上(200rpm)，在连续光照条件下培养20h左右，使衣藻细胞浓度达到5×106细胞/ml。(3)电击转化衣藻细胞用50ml离心管收集衣藻细胞，加入预冷的tap+60mm山梨醇溶液(含60mm山梨醇的tap液体培养基)重悬，2500rpm离心3min，再加入适量的预冷的tap+60mm山梨醇溶液重悬使衣藻细胞的终浓度为1-2×108细胞/ml，冰上放置10min。于超净工作台内洗电击杯，先用无水乙醇洗一次，再用tap+60mm山梨醇溶液洗三次，随后预冷电击杯。向电击杯中加入250μl预冷过的1-2×108细胞/ml的衣藻细胞，再加入150ngaphⅷ片段dna，轻轻吸打混匀，于冰上放置10min。调整电击仪(型号btxecm630)的参数为电压800v，电阻1575ω，电容50μf。擦干电击杯外壳的水分，使电击杯带有金属条的两侧与电击仪的电击夹接触并夹紧电击杯，放下安全罩，开始电击(电击时间应控制在10-14ms)。电击完毕后，将电击杯在冰上放置10min。将电击的衣藻细胞转移至含有10mltap+60mm山梨醇溶液的50ml离心管中，锡箔纸包住，置于摇床上100rpm摇过夜。2500rpm离心3min收集过夜修复的衣藻细胞，加入1ml20％的玉米淀粉(淀粉用无水乙醇洗1遍，再用无菌蒸馏水洗3遍，最后用tap+60mm山梨醇洗4次，并用tap+60mm山梨醇重悬。)，吸打混匀，平铺于含有巴龙霉素(10μg/ml)的tap固体平板上，于超净工作台中吹干液体，封口，倒置于光周期下(14h光照/10h黑暗)培养，大约7天左右可长出转化子。二、筛选衣藻转化子获得氯化镉敏感型突变体将衣藻转化子用灭菌的牙签挑至tagp固体平板上并进行编号，在光周期下生长3天后，再将转化子挑至含有0.4mm氯化镉的tagp固体平板上进行筛选，野生型21gr作为对照。0.4mm氯化镉的筛选浓度由申请人前期研究获得，参见专利201611022254.9。将获得的衣藻转化子在含0.4mm氯化镉的tagp固体平板上筛选3-4天，观察转化子的生长情况。若在野生型衣藻21gr能够正常生长的情况下突变体藻株生长显著受到抑制或者逐步死亡，说明突变体具有对氯化镉敏感的特性，将对应的转化子从tagp固体平板上挑至含0.4mm氯化镉的tagp固体平板上进行复筛。如此反复复筛3-5次后，突变体依旧不能够正常生长而21gr能正常生长，则说明该突变体为氯化镉敏感型突变体。图2为野生型莱茵衣藻21gr和筛选得到的氯化镉敏感型衣藻突变体hm6在含0.4mm的氯化镉的tagp固体平板上的生长对比图。三、氯化镉敏感型突变体的突变基因的鉴定(1)提取氯化镉敏感型突变体的基因组dna将所获得的氯化镉敏感型突变体hm6从tagp固体平板上接种到tap液体培养基进行吹气培养，在光周期下培养4天左右可达到生长对数期。收集衣藻细胞，采用ctab法提取突变体衣藻的基因组dna，1％琼脂糖凝胶电泳检测dna提取质量，q5000超微量核酸蛋白测定仪测定所提取的dna浓度，-20℃储存备用。(2)突变体基因组dna进行resda-pcr(restrictionenzymesite-direcedamplificationpcr)扩增获得插入片段及其侧翼序列信息根据插入片段aphⅷ的核酸序列设计特异引物f-z2和f-z8，根据衣藻基因组特点设计引物q0和由q0与alui、psti、sacii、taqi限制性内切酶特异识别序列组成的简并引物degalui、degpsti、degsacii、degtaqi。引物序列见下表：引物名称5′—3′f-z2ttttaccggctgttggacf-z8agttcttctgagggacctgq0ccagtgagcagagtgacgdegaluiccagtgagcagagtgacgiiiiinnswcagcttdegpsticcagtgagcagagtgacgiiiiinnsctgcagwdegsaciiccagtgagcagagtgacgiiiiinnsccgcggwdegtaqiccagtgagcagagtgacgiiiiinnswgtcgaaresda-pcr分为两轮扩增。第一轮扩增：以突变体基因组dna为模板，以正向引物f-z2和反向引物degalui、degpsti、degsacii、degtaqi分别进行pcr扩增。第二轮扩增：将第一轮pcr产物稀释25倍后作为模板，用正向引物f-z8和反向引物q0进行第二轮pcr扩增。第二轮pcr结束后，将第二轮pcr产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，切500bp以上条带送去测序。图3为本发明所涉及的氯化镉敏感型突变体hm6经resda-pcr后的电泳图，其中a、p、s、t分别代表含有alui、psti、sacii、taqi限制性内切酶识别序列的简并引物扩增产物，m为dl2000dnamarker。(3)氯化镉敏感型突变体突变基因序列和插入突变位点的分析与鉴定将测序结果与aphⅷ片段序列进行比对，得到被插入突变的基因的部分序列，在phytozome网站上的衣藻数据库中进行序列比对，可获得突变基因的核酸序列及其编码蛋白氨基酸序列，进一步分析可获得具体插入位点。如图4所示，本发明所获得的氯化镉敏感型突变体hm6是由于aphⅷ片段反向插入到所述基因vps9的第7个内含子中形成的突变体。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江汉大学<120>莱茵衣藻vps9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>3483<212>dna<213>chlamydomonasreinhardti<400>1atggcggacgaactcttctcaactagcacctcgcagctgaatttcgagaagttcatcagc60acaatcaatcaggaagctgccaaggaccttgttcgcagcatcaaccagttcatgaagaac120ttcaggaagcgggcacccgatagcgaggcggatgcgcgcgaggtgcaggagtttctgaca180cagatggagcaggcgtttgcacgccacccgctgtgggccggcagcgggcggacggagctt240gagaacgccgtggagggcctggagaagtacctcatgactaagctgtacgaccgcaccttt300gcggcggacccgctggaccgggagcgggatgacgtgctggggcggcggctggcggcgctg360gccgggttcgtggggccggcacacctggaggtcagcgccagcctgcagggccctctggcg420gcggacgacggggggcaactggcggcggcgcagagggagctccggcgcatgtcgctgtac480aagagccctcgcgacaagctggttcagatcctgaactgctgcaagatcataaacaacctg540ttggccagcaagcgggccggcgcaggcgcggacgacttcacgcccacactcatctacgtg600accatcaaggcgcagcccgaggccctggcctccaacctggccttcgttgagcgctatcgc660tatgccgcacacctgggcggagaggcggcgtacttctttgtgcagatgcaaggcgccgcc720accttcctggagaccctcaccacctccagcctggccggctgcgacccggatgagttcatt780gcgcacatgctggccgccggagccatgagcgagcaggagctcagcgaggggcagctgcag840gcccagcgcaggaggtccggcgcactcacctccgtcgcgccgccgccgcccgcgctgccg900ccgaccggcgccggtgttggtgccgcggcgccatcacaggtgtacggcaacccaatgctc960gcggcggcggctggcgccggcgcagtcgtgcagccgtcgtaccgtgctggggcggcggcg1020ccgccgcctggcggcgcggcgtcgccgtacgggcacacgtacgggcagccaccgccaccg1080ccaccgccgccgccgccgccggggagtcatggccatgcggcaccagtgtactacacggcg1140gcgggggcggtaccgggagtgcaaggccaggcgggcgttgcctacccgggcacagtgtac1200ggcgcccctgcgccgtcaggctatccgtacgggcagcagtacgcgtacgggcagcagcag1260tggccgcagcaaggcgtgccgccgcccccaccgccccctcccccgccgccctcctctgcg1320tctcccgccgctgcgcacccccacggcgcctctgcttctggcaccgcctctacgtctcag1380ctggtgccgctgccgcccaagagcgtgtcgcaactggaggcggacggagtcaggctggtg1440ctgcgcgccgaggccgccggcgagctgcgcgcccgctaccgctacctgtacgccagtccc1500gagggcctcacgctgcgcgacgtgagccaactgctggcggcgtacaaggagctggcgatc1560aagtacgagacactggcgcaggctgtggagaacaacgtgctcaaatacttttcagacctg1620gaggtctaccaggcgggagtggcgcccgcgctgccagcagggcccacacacgccgcgcag1680ccacaccagcagccgcagccgcaccagccgcgccacccgccgccgccgcctcccctgggg1740ccacccgcggtgtcggtggcgttgccttccgccgcgcacccgcacccccctcctcctccg1800cctccacccccgccgcttccggcgccgcacccctcagcagcacaggcggccgcaacgccc1860gcaccgcacccgccctcctcctcagcggcagcggcagccgccaccactgctgccgccgcc1920actgctgccgccgtcaccaccgcgccatccggcacggggccggcagcgcggcatgtggac1980ctgtcgcagttcatgcccgcctaccagctggaggcggagggcctagccggcttcgcgccc2040gccggggcgcctgtggaggcggcgggggcgcctacagcaggcgccacgaccgccgacctg2100ccgcctgcggcggcggcagaggaggccgagccgctagttgcggatgcgtccttcacgctg2160ccgccgccggcctcgccgccgcgggcccacgggcaggagcagcagcaacatcagcccgtg2220acgccgctgctgccgcaggcatccgcctccagcgccgccgccggcgccatcaacagcgac2280ggcggtggtggcgccgccagcgctgaggacgctgacgtggacctgttggacaagaagctg2340acgccgccgccgccgctacgcagtgtactgctggataagcagcccgaactggaccttctg2400tccttcaatgactcgcccgtgcctacggcagggaccacaggcaccggcatggcgggcgcg2460ccgccgccgccgcctccagggccgccgcctgtgctgttgcaggatgccgttccggacgcc2520gaggaggtgggcgcccgcagcagcagccaaggcgcgaccggtgcaggcgctggtccgggc2580ctagaggcaacgctgtcgccggcagtggcagcgctagccacgcagcctgctggcggggag2640ccggcggctggcgccggggacagcggccctggcgttgccgacctggatctggacttggga2700ctagggctgaatgcccaggacgccgcctcggcgcccacggtcgtgttcgcgccgtcgcag2760ccgccggaggcagtcgccaccgccacctcagcaccgccagaggccacgagcccggctcct2820gctcctgccactgcccctgccgctaccgatgcggctgagccgggcgatggcagtgacgct2880gctggaggcggcggcgcagggctgtcggggacgctggacctgggccaggtgcttctggac2940gtggatgtgggcggaggcggaggcggggagtccgcggcaccagaagctgtggcggtggcg3000ccagcggatgcggtggcggcgccggcagccatgccggaggcgccgcaagcagccgatgtg3060gctccgccagtggcggcgccggcagaggcggtgcagccagtggcagcgctagctggggag3120gtggagacggaggagcagcggcaggcgcgggtggatgcactgcttggggagctcctgggc3180ggcggaggtggaggcggcggtggggaggaaaacacgggcgccggtgtggcggaggcgccg3240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