基因突变体及其应用的制作方法

本发明涉及基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的核酸、分离的多肽、检测乳腺癌生物标志物的方法、系统、试剂盒和涉及基因突变体的构建体和重组细胞。
背景技术：
：近年来我国癌症的发病率和死亡率不断攀升，恶性肿瘤已成为我国重大的公共卫生问题。据我国肿瘤登记中心2016年发布的结果显示，2012年我国肿瘤新发病例数358.6万例，死亡例数218.7万例，粗发病率265/10万，死亡率161.5/10万。在恶性肿瘤发病现状中，乳腺癌在女性恶性肿瘤中处于第一位，每年新发约27.3万，且发病年龄不断呈现年轻化趋势，是严重威胁女性生命的第一杀手[1]。乳腺癌是具有很强遗传背景的恶性肿瘤，现有研究显示，5-10％的乳腺癌是由遗传因素导致。目前brca1，brca2，tp53，palb2，pten，chek2，atm以及rad50等基因被认定为乳腺癌易感基因[2]，其中brca1和brca2基因为遗传性乳腺癌的主要易感基因。研究表明，携带有brca1和brca2基因致病突变的人群在70岁之前发生乳腺癌的概率分别可达40–80％和20–85％[3]。同时被诊断为遗传性乳腺癌或卵巢癌的患者，发生复发转移的可能性也高于普通人群。brca1和brca2属于抑癌基因，均呈常染色体显性遗传，且该基因突变容易引发早年发病。brca2基因位于人类染色体13ql2,包含27个外显子，编码brca2蛋白含3418个氨基酸，对细胞生长的调节有重要作用。brca2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复dna损伤的功能，导致染色体不稳定，促进肿瘤发生。男性brca2突变携带者终生患前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌的概率分别为20％,6％和3％。而女性brca2突变携带者终生患乳腺癌为26％–84％，卵巢癌的概率为20％。[4]brca2基因突变相关的肿瘤往往会表达er(雌激素受体)与pr(孕激素受体)，与散发性乳腺癌表现出相似的特征。现已经报道的brca2突变种类数量多于1800，变异范围达整个基因的编码区。主要发生的突变为移码突变，也会发生大量的错义突变，但错义突变大多属于意义未明变异。因此发现brca2新的致病突变，对开展遗传性乳腺癌的分子诊断具有重要意义[5]。区域捕获测序是利用特制的dna序列探针将全基因组中的特定区域捕获下来，然后针对每个区域进行深度测序的技术，与传统的连锁分析、候选基因关联分析技术相比，区域捕获测序技术针对基因组内特定目标区域，目标集中，测序深度和精度更高。随着区域捕获测序等二代测序技术的广泛应用，一批新的致病突变基因和新的致病位点被相继发现，极大地推动了相关疾病及其防治措施的研宄进程。技术实现要素：本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测乳腺癌生物标志物的方法。本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了乳腺癌的新的致病突变。在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。所述分离的核酸与seqidno：1相比具有c.2389dela突变。其中，seqidno：1是野生型brca2基因的序列，seqidno：3是突变型brca2基因的序列。发明人确定了brca2基因突变体，这种新突变体与乳腺癌的发病密切相关，从而通过检测这种新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患乳腺癌。在发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。所述分离的多肽与seqidno：2相比具有p.k797sfsx13突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患乳腺癌。在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测乳腺癌生物标志物的系统。该系统包括：检测生物样本中的brca2基因中是否存在c.2389dela突变，其中所述brca2基因为seqidno:1的序列表示，所述存在c.2389dela突变的brca2基因为seqidno:3的序列表示；或者检测生物样本中的brca2蛋白中是否存在p.k797sfsx13突变，其中所述brca2蛋白为seqidno:2序列表示，所述存在p.k797sfsx13突变的brca2蛋白为seqidno:4的序列表示。在本发明的第四方面，本发明提出一种与突变brca2基因互补的核酸探针，所述突变是brca2基因的c.2389dela突变，所述探针与突变brca2基因的互补区域选自seqidno:3所示的序列。在本发明的第五方面，本发明提出了一种用于检测乳腺癌生物标志物的试剂盒。该试剂盒含有：适于检测brca2基因突变体的至少一种的试剂，其中与seqidno：1相比，所述brca2基因突变体具有c.2389dela突变。利用本发明的试剂盒，能够有效地检测乳腺癌生物标志物。在本发明的第六方面，本发明还提出了一种构建体。该构建体包含前面所述的分离的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的核酸”表示，本发明的构建体包含与seqidno：1相比具有c.2389dela突变的核酸序列。由此，本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作乳腺癌相关研究的模型。在本发明的第七方面，本发明还提出了一种重组细胞。该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。本发明的重组细胞，能够有效地用作乳腺癌相关研究的模型。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1.ⅱ-2号先证者sanger测序峰图，箭头标记为突变所在/起始位点。图2.遗传性乳腺癌家系。空白圆形：表型正常女性；空白方形：表型正常男性；实心圆形：女性乳腺癌患者；箭头所指为家系内先证者。图3.ⅰ-2号sanger测序峰图，箭头标记为突变所在/起始位点。图4.ⅰ-3号sanger测序峰图，箭头标记为突变所在/起始位点。图5.ⅱ-1号sanger测序峰图，箭头标记为突变所在/起始位点。图6.ⅱ-3号sanger测序峰图，箭头标记为突变所在/起始位点。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。基因突变体在本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，与seqidno：1相比，该核酸具有c.2389dela突变。在本文中所使用的表达方式“基因突变体”，是指与基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与基因突变体的基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于dna、rna或cdna。其中，seqidno：1是野生型brca2基因序列,seqidno：3是突变型brca2基因序列。根据本发明的一个具体示例，前面所述的基因突变体的核酸为dna。根据本发明的实施例，发明人确定了brca2基因的新突变体，新突变体与乳腺癌的发病密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患乳腺癌，也可以通过检测这些突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易患乳腺癌。对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及seqidno：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。本申请中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及brca2基因序列，实际也包括相应的rna序列。该brca2基因突变体的核酸，是本申请的发明人通过目标区域捕获测序联合候选基因突变验证的方法确定的乳腺癌的致病基因brca2基因的新的致病突变。该致病突变位点在现有技术中并未被提到。需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“目标区域捕获测序”是指利用特制的探针对样本感兴趣的某段特定序列进行捕获富集后，再利用第二代测序技术进行高通量测序及基因组分析的方法。利用该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大的提高了基因组中目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。在本发明中，将该方法用于识别和研究与疾病相关的编码区域内的结构变异，进而，结合大量的公共数据库提供的数据，有利于更好地解释所得变异结构之间的关联和致病机理。其中，野生型brca2基因序列如下所示：(seqidno：1)atgcctattggatccaaagagaggccaacattttttgaaatttttaagacacgctgcaacaaagcagatttaggaccaataagtcttaattggtttgaagaactttcttcagaagctccaccctataattctgaacctgcagaagaatctgaacataaaaacaacaattacgaaccaaacctatttaaaactccacaaaggaaaccatcttataatcagctggcttcaactccaataatattcaaagagcaagggctgactctgccgctgtaccaatctcctgtaaaagaattagataaattcaaattagacttaggaaggaatgttcccaatagtagacataaaagtcttcgcacagtgaaaactaaaatggatcaagcagatgatgtttcctgtccacttctaaattcttgtcttagtgaaagtcctgttgttctacaatgtacacatgtaacaccacaaagagataagtcagtggtatgtgggagtttgtttcatacaccaaagtttgtgaagggtcgtcagacaccaaaacatatttctgaaagtctaggagctgaggtggatcctgatatgtcttggtcaagttctttagctacaccacccacccttagttctactgtgctcatagtcagaaatgaagaagcatctgaaactgtatttcctcatgatactactgctaatgtgaaaagctatttttccaatcatgatgaaagtctgaagaaaaatgatagatttatcgcttctgtgacagacagtgaaaacacaaatcaaagagaagctgcaagtcatggatttggaaaaacatcagggaattcatttaaagtaaatagctgcaaagaccacattggaaagtcaatgccaaatgtcctagaagatgaagtatatgaaacagttgtagatacctctgaagaagatagtttttcattatgtttttctaaatgtagaacaaaaaatctacaaaaagtaagaactagcaagactaggaaaaaaattttccatgaagcaaacgctgatgaatgtgaaaaatctaaaaaccaagtgaaagaaaaatactcatttgtatctgaagtggaaccaaatgatactgatccattagattcaaatgtagcaaatcagaagccctttgagagtggaagtgacaaaatctccaaggaagttgtaccgtctttggcctgtgaatggtctcaactaaccctttcaggtctaaatggagcccagatggagaaaatacccctattgcatatttcttcatgtgaccaaaatatttcagaaaaagacctattagacacagagaacaaaagaaagaaagattttcttacttcagagaattctttgccacgtatttctagcctaccaaaatcagagaagccattaaatgaggaaacagtggtaaataagagagatgaagagcagcatcttgaatctcatacagactgcattcttgcagtaaagcaggcaatatctggaact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aaggaaagtttatggactggaaaaggaatacagttggctgatggtggatggctcataccctccaatgatggaaaggctggaaaagaagaattttatagggctctgtgtgacactccaggtgtggatccaaagcttatttctagaatttgggtttataatcactatagatggatcatatggaaactggcagctatggaatgtgcctttcctaaggaatttgctaatagatgcctaagcccagaaagggtgcttcttcaactaaaatacagatatgatacggaaattgatagaagcagaagatcggctataaaaaagataatggaaagggatgacacagctgcaaaaacacttgttctctgtgtttctgacataatttcattgagcgcaaatatatctgaaacttctagcaataaaactagtagtgcagatacccaaaaagtggccattattgaacttacagatgggtggtatgctgttaaggcccagttagatcctcccctcttagctgtcttaaagaatggcagactgacagttggtcagaagattattcttcatggagcagaactggtgggctctcctgatgcctgtacacctcttgaagccccagaatctcttatgttaaagatttctgctaacagtactcggcctgctcgctggtataccaaacttggattctttcctgaccctagaccttttcctctgcccttatcatcgcttttcagtgatggaggaaatgttggttgtgttgatgtaattattcaaagagcataccctatacagtggatggagaagacatcatctggattatacatatttcgcaatgaaagagaggaagaaaaggaagcagcaaaatatgtggaggcccaacaaaagagactagaagccttattcactaaaattcaggaggaatttgaagaacatgaagaaaacacaacaaaaccatatttaccatcacgtgcactaacaagacagcaagttcgtgctttgcaagatggtgcagagctttatgaagcagtgaagaatgcagcagacccagcttaccttgagggttatttcagtgaagagcagttaagagccttgaataatcacaggcaaatgttgaatgataagaaacaagctcagatccagttggaaattaggaaggccatggaatctgctgaacaaaaggaacaaggtttatcaagggatgtcacaaccgtgtggaagttgcgtattgtaagctattcaaaaaaagaaaaagattcagttatactgagtatttggcgtccatcatcagatttatattctctgttaacagaaggaaagagatacagaatttatcatcttgcaacttcaaaatctaaaagtaaatctgaaagagctaacatacagttagcagcgacaaaaaaaactcagtatcaacaactaccggtttcagatgaaattttatttcagatttaccagccacgggagccccttcacttcagcaaatttttagatccagactttcagccatcttgttctgaggtggacctaataggatttgtcgtttctgttgtgaaaaaaacaggacttgcccctttcgtctatttgtcagacgaatgttacaatttactggcaataaagttttggatagaccttaatgaggacattattaagcctcatatgttaattgctgcaagcaacctccagtggcgaccagaatccaaatcaggccttcttactttatttgctggagatttttctgtgttttctgctagtccaaaagagggccactttcaagagacattcaacaaaatgaaaaatactgttgagaatattgacatactttgcaatgaagcagaaaacaagcttatgcatatactgcatgcaaatgatcccaagtggtccaccccaactaaagactgtacttcagggccgtacactgctcaaatcattcctggtacaggaaacaagcttctgatgtcttctcctaattgtgagatatattatcaaagtcctttatcactttgtatggccaaaaggaagtctgtttccacacctgtctcagcccagatgacttcaaagtcttgtaaaggggagaaagagattgatgaccaaaagaactgcaaaaagagaagagccttggatttcttgagtagactgcctttacctccacctgttagtcccatttgtacatttgtttctccggctgcacagaaggcatttcagccaccaaggagttgtggcaccaaatacgaaacacccataaagaaaaaagaactgaattctcctcagatgactccatttaaaaaattcaatgaaatttctcttttggaaagtaattcaatagctgacgaagaacttgcattgataaatacccaagctcttttgtctggttcaacaggagaaaaacaatttatatctgtcagtgaatccactaggactgctcccaccagttcagaagattatctcagactgaaacgacgttgtactacatctctgatcaaagaacaggagagttcccaggccagtacggaagaatgtgagaaaaataagcaggacacaattacaactaaaaaatatatctaa突变的brca2(p.k797sfsx13)基因的蛋白序列如下所示(突变位点发生了移码突变用“-”表示)：(seqidno:4)mpigskerptffeifktrcnkadlgpislnwfeelsseappynsepaeesehknnnyepnlfktpqrkpsynqlastpiifkeqgltlplyqspvkeldkfkldlgrnvpnsrhkslrtvktkmdqaddvscpllnsclsespvvlqcthvtpqrdksvvcgslfhtpkfvkgrqtpkhiseslgaevdpdmswssslatpptlsstvlivrneeasetvfphdttanvksyfsnhdeslkkndrfiasvtdsentnqreaashgfgktsgnsfkvnsckdhigksmpnvledevyetvvdtseedsfslcfskcrtknlqkvrtsktrkkifheanadeceksknqvkekysfvsevepndtdpldsnvanqkpfesgsdkiskevvpslacewsqltlsglngaqmekipllhisscdqnisekdlldtenkrkkdfltsenslprisslpksekplneetvvnkrdeeqhleshtdcilavkqaisgtspvassfqgikksifrirespketfnasfsghmtdpnfkketeasesgleihtvcsqkedslcpnlidngswpatttqnsvalknaglistlkkktnkfiyaihdetsykgkkipkdqkselincsaqfeanafeapltfanadsgllhssvkrscsqndseeptlsltssfgtilrkcsrnetcsnntvisqdldykeakcnkeklqlfitpeadslsclqegqcendpkskkvsdikeevlaaachpvqhskveysdtdfqsqksllydhenastliltptskdvlsnlvmisrgkesykmsds-skvtimnlmln-发明人惊奇的发现，野生型的brca2基因共编码3418个氨基酸。ⅱ-2号先证者样本的乳腺癌易感基因突变发生在brca2基因编码区上，具体突变位点是在第2389核苷酸。ⅱ-2号先证者的测序数据显示其在第2389位核苷酸之间缺失了碱基a，发生移码突变，最终导致只能编码808个氨基酸。上述基因突变体与乳腺癌的发病密切相关，从而通过检测上述基因突变体或者多肽在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患乳腺癌。brca1和brca2属于抑癌基因，对细胞生长的调节有重要作用。brca2基因发生突变后表达的蛋白质失去了修复dna损伤的功能，导致染色体不稳定，促进肿瘤发生。在目前的人群研究中，有许多关于brca1和brca2基因突变与易患乳腺癌的报道，但是本发明的突变是从未报道过的的新突变。根据本发明的实施例，该突变体的核酸进一步丰富了brca2基因的致病突变图谱，并且更深入地阐明了乳腺癌的分子发病机制，为乳腺癌的早期致病基因筛查和干预治疗提供科学依据。另外，本发明所提出的基因突变体可作为乳腺癌的生物标志物用于筛选易患乳腺癌的生物样品，根据本发明的具体实施例，筛选易患乳腺癌的生物样品的方法可以包括以下步骤：首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品brca2基因是否存在突变的核酸样本即可。生物样品可以为选自人体血液、皮肤、毛发、唾液和肌肉的至少一种，根据本发明的实施例，本发明实施例的生物样本为血液。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患乳腺癌的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中brca2基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组dna，也可以是该全基因组中包含brca2基因序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总rna，也可以是从生物样品中提取的mrna。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组dna。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患乳腺癌的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用rna作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取rna样本，优选rna样本为mrna；以及基于所得到的rna样本，通过反转录反应，获得cdna样本，所得到的cdna样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用rna作为核酸样本筛选易患乳腺癌的生物样品的效率。接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第一代、第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自hiseq2000、solid、454、bgiseq500和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自hiseq2000、solid、454、bgiseq500和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集brca2基因序列或者brca2基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用选自brca2基因特异性引物的至少一种，对核酸样本进行pcr扩增，以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用选自brca2基因核酸探针的至少一条，对核酸样本进行目标区域捕获，以及针对所得到的捕获产物，构建核酸测序文库，核酸探针的设计方法为根据brca2基因的核酸序列进行叠瓦式设计。由此，可以通过pcr扩增或者目标区域捕获，富集brca2基因序列，从而能够进一步提高筛选易患乳腺癌的生物样品的效率。需要说明的是，捕获brca2基因序列的核酸探针是根据常规的探针设计方法设计得到的，不受实施例的特别限制。根据本发明的实施例，brca2基因特异性引物的序列不受特别限制，例如可以参考人类基因组序列数据库grch37.1/hg19，采用primer3.0在线设计获得。根据本发明的优选实施例，所述brca2基因外显子特异性引物具有如seqidno：5和6所示的核苷酸序列。seqidno：55’-gtcttggctgcagcatgtca-3’seqidno：65’-ttggattactcttagatttgtg-3’关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如illumina公司所提供的规程，例如参见illumina公司multiplexingsamplepreparationguide(part#1005361；feb2010)或paired-endsampleprepguide(part#1005063；feb2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应brca2基因的核酸序列即可。最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列相应的参考序列进行比对，当所得到的核酸序列中具有前述突变时，即指示生物样品易患乳腺癌。由此，通过根据本发明实施例的筛选易患乳腺癌的生物样品的方法，可以有效地筛选易患乳腺癌的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与相应野生型基因序列进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用soapaligner/soap2进行比对。需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易患乳腺癌的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。构建体及重组细胞根据本发明的实施例，该构建体包含前面所述的分离的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的核酸”表示，本发明的构建体包含与seqidno：1(野生型brca2基因序列)相比具有c.2389dela突变。由此，本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作乳腺癌相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的dna、rna，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为dna，因为dna相对于rna而言，其更稳定，并且易于操作。在本发明的第六方面，本发明还提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞而获得的。从而，本发明的重组细胞能够有效表达构建体所携带的brca2基因突变体。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作乳腺癌相关研究的模型。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。需要说明的是，在本文前面筛选易患乳腺癌的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于检测乳腺癌生物标志物的系统或者试剂盒，在此不再赘述。此外，还需要说明的是，根据本发明实施例的筛选乳腺癌的生物样品的方法、系统以及试剂盒，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。本实施例采用目标区域捕获测序技术，针对一个常染色体显性遗传的乳腺癌家系进行高通量测序，结合生物信息分析发现brca2基因上的c.2389dela突变与乳腺癌相关，并通过共分离实验等方法验证了这一变异。实施例1遗传性乳腺癌brca2基因突变c.2389dela检测1、样本信息：一个遗传性乳腺癌家系，包括一名先证者和5名家属，具体信息见表2主要仪器信息：移液器，pcr仪，离心机，涡旋振荡器，电泳仪，2.0，dna打断仪，磁力架，干式恒温金属浴，completegenomics测序仪主要试剂：qiagen血液dna提取试剂盒，completegenomics平台建库试剂，人基因组(hg19)内目标区域约为600kb的液相探针(罗氏公司，nimblegenez芯片)2、样本采集遗传性乳腺癌家系包含5个成员，其中乳腺癌患者2名(图2。在家系中选取1位乳腺癌患者作为区域捕获测序样本(表1)，每个样本采集外周血样品5ml，加入edta抗凝，-80摄氏度保存。后又收集家系内1位患者和3位正常对照个体作为二次验证样本(表2)，每位采集外周血样品5ml,加入edta抗凝，-80摄氏度保存。表1.遗传性乳腺癌家系区域捕获测序样本基本情况表编号性别患病年龄患病情况ⅱ-2女未知乳腺癌表2.遗传性乳腺癌家系验证样本基本情况表编号性别患病年龄患病情况ⅰ-2女64乳腺癌ⅰ-3女60表型正常ⅱ-1女44表型正常ⅱ-3女38表型正常3、实验流程3.1dna提取使用qiagendnabloodminikit，并按照试剂盒中的提取说明，从乳腺癌患者血液样本中提取基因组dna，使用2.0检测dna浓度，原则上每份样本的dna获得量≥2μg，然后电泳检测dna是否完整和降解程度。3.2测序前文库构建参考completegenomics外显子测序文库构建流程，具体步骤：1、基因组dna随机打断为220-400小片段，然后进行纯化和末端修复；2、加a接头并进行pcr扩增；3、通过碱基互补配对的原理，使用探针与基因组dna杂交，捕获到目标序列，洗脱目标dna序列；4、pcr扩增，对dna进行双链环化；5、接头两端26bp处酶切；6、末端修复，加b接头；7、分离dna双链成单链，对单链进行环化；8、单链环化分子滚环复制，形成dna纳米球dnb。3.3completegenomics高通量测序对质控合格的文库dna进行completegenomics高通量测序。每个样本获得的测序原始数据量达到0.6gb以上，目标区域的平均测序深度到达400x，目标区域覆盖度为99％以上。3.4测序数据处理及生物信息分析根据测序平台的数据处理说明及实际需求，对下机所得数据进行初步处理及进行信息分析。首先进行序列比对，将测序得到的序列用teramap软件比对到人的参考基因组上，同时不允许有插入和缺失；然后鉴定可能与参考基因组不一样的区域，将有可能比对到这些区域的序列拿出来进行局部组装，将组装得到的序列与参考基因组比较，确定各种类型的变异；进而，使用varscorevaf和varscoreeaf对检测到的突变进行打分；最后，过滤掉低质量(vqlow),低深度(alt_depth<2/allreads<5)和低频率(maf<0.25)的突变,得到的最后的突变位点信息。3.5对乳腺癌易感基因的突变数据进行解读，找到致病突变经过生物信息分析获得的snp和indel突变数据进行如下分析筛选：首先，将所有的乳腺癌易感基因的snp和indel突变数据筛选出来；其次，将乳腺癌易感基因的外显子区域和内含子连接区域的剪接突变、无义突变和移码突变筛选出来；然后在bic(breastcancerinformationcore)数据库，hgmd(thehumangenemutationdatabase)数据库以及相关研究文献中对筛选出来的突变位点进行搜索，明确突变位点是否为已知突变，如果没有相关报告，则说明该突变为新突变。4、实验结果通过对样本ⅱ-2的测序数据进行分析、数据库对比及解读，发现先证者存在乳腺癌相关易感基因的突变位点，同时发现这些突变位点目前均未在研究文献、bic等数据库报道过，故判定为新的突变位点。该样本中通过分析解读后的突变位点如下表：表3.先证者ⅱ-2血液dna样本中测序所得的突变位点信息样本序号基因转录本突变区域核苷酸改变氨基酸改变纯合/杂合ⅱ-2brca2nm_000059cds10c.2389delap.797sfsx13杂合以下是对发现的新发现的遗传性乳腺癌突变位点的详细描述：(1)brca2基因编码区的野生型序列为：野生型的brca2基因共编码3418个氨基酸。ⅱ-2号先证者样本的乳腺癌易感基因突变发生在brca2基因编码区上，具体突变位点是在第2389核苷酸。测序数据显示其在第2389位核苷酸碱基a缺失，发生移码突变，最终导致只能编码808个氨基酸。实施例2sanger法测序验证乳腺癌的致病突变由于目标区域测序存在一定程度的假阳性，发明人利用sanger测序方法，对新发现的可能具有致病意义的突变位点进行了验证。对实施例1检测获得的新突变位点所在序列设计引物，然后通过pcr扩增、产物纯化和测序的方法获得上述突变的有关序列，根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，是杂合突变还是纯合突变，以及序列与表型与乳腺癌之间的相关性。具体方法步骤如下：1、dna提取按照实施例1中所述的提取dna的方法，分别提取制备受试者(包括乳腺癌患者和正常人)外周静脉血中的基因组dna，备用。2、引物设计及pcr反应首先，参考人类基因组序列数据库grch37.1/hg19，采用primer3.0设计得到brca2基因外显子特异性引物具体序列见下表：表4.brca2基因c.2389dela突变位点pcr引物序列基因突变位点上游引物seqidno：5(5’-3’)下游引物seqidno：6(5’-3’)brca2c.2389delagtcttggctgcagcatgtcattggattactcttagatttgtg接着，于96孔反应板中，分别按照以下配比配制各基因组dna样本的pcr反应体系以及进行pcr反应。反应体系：25μl然后，于perkinelmer9700热循环仪上，采用touchdown方法将配制获得各pcr反应体系按照以下反应条件分别进行pcr反应(不同的突变位点采用相同的反应条件)：反应条件：预变性：94℃1分钟；前10个循环：变性94℃，30秒，退火60℃，30秒(退火温度每个循环降0.5℃)，延伸72℃，30秒；后25个循环：变性94℃，30秒，退火55℃，30秒，延伸72℃，30秒；最后延伸：72℃，10分钟；4℃保存。由此，获得上述各受试者的pcr扩增产物。3、测序将步骤2中获得各受试者的pcr扩增产物，进行dna测序。其中，测序采用abi3730型测序仪进行。验证结果显示高通量测序分析结果与sanger测序结果一致。综上，发明人证明了，brca2基因为乳腺癌的致病基因，并且本发明发现新突变：c.2389dela是乳腺癌的致病突变。实施例4对突变携带的相关家属和家族史分析使用pcr联合sanger测序法，对携带有乳腺癌易感基因突变的先证者的家属进行相应突变位点的验证，明确突变位点是否与疾病产生共分离，家系图如图2所示。实验流程与实施例2相同，结果分析：从峰图可以看出位点突变在患者中杂合缺失一个碱基，一半序列为野生型，一半序列有一个碱基的错位，因此出现套峰的情况。验证结果显示高通量测序分析结果与sanger测序结果一致：ⅰ-2号样本brca2基因c.2389dela突变型，sanger测序峰图如图3所示；ⅰ-3号样本brca2基因野生型，sanger测序峰图如图4所示；ⅱ-1号样本brca2基因c.2389dela突变型，sanger测序峰图如图5所示；ⅱ-3号样本brca2基因c.2389dela突变型，sanger测序峰图如图6所示；表5.遗传性乳腺癌家系家属sanger验证结果表编号突变信息患病情况ⅰ-2brca2:c.2389dela患病ⅰ-3negative正常ⅱ-1brca2:c.2389dela正常ⅱ-3brca2:c.2389dela正常参与验证的家属包括该先证者主要的女性家族成员。验证结果表明，家族中乳腺癌患者均携带和先证者相同的突变位点，而没有携带相应的突变位点的家属没有患乳腺癌，符合疾病共分离的规律。以上结果表明，我们所发现的brca2基因乳腺癌易感基因突变位点会导致乳腺癌发生风险升高，是遗传性乳腺癌的致病突变。实施例4检测试剂盒制备一种检测试剂盒，其包含适于检测brca2基因c.2389dela突变体的引物或者探针，以便用于筛选易患乳腺癌的生物样品，其中核酸引物的具体序列见实施例2，核酸探针根据brca2基因序列进行叠瓦式设计，增加目标区域的捕获效率。利用上述试剂盒检测乳腺癌生物标志物的具体步骤为：按照实施例2的步骤1所述的方法提取待测者dna，以所提取的dna为模板与上述brca2特异性引物进行pcr反应或者目标区域捕获，并按照本领域常规方法对产物纯化，将纯化的产物进行文库构建并测序，然后通过观察测序所得到的序列是否具有上述基因的突变位点，从而有效地检测待测者是否易患乳腺癌，进一步，能够从待测者中筛选出易患乳腺癌的生物样品。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页12