甘露糖结合蛋白基因用于制备转基因抗稻瘟病水稻的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程分子育种领域，特别涉及甘露糖结合蛋白基因用于制备转基因抗稻瘟病水稻的应用。

背景技术：

稻瘟病菌(pyriculariaoryzaecav.)是造成水稻作物发生植物病害的重要元凶之一，其对水稻作物的危害严重影响了水稻作物的安全生产和增产。现有的选育和利用水稻作物的抗病品种，虽然安全有效地控制了稻瘟病菌(pyriculariaoryzaecav.)，但是由于稻瘟病菌群体毒性组成复杂，并且不断演化，因而导致已有的抗稻瘟病的水稻作物在种植过程中，随时间延长，其抗稻瘟病的能力会逐渐丧失。针对此，一方面，需要进一步研究和认识稻瘟病菌群体的组成及演化；另一方面，发掘新的能使水稻作物具备抗稻瘟病能力的方法是十分关键的。

兰科脉羊耳兰植物中的甘露糖结合蛋白是存在于植物内一种天然的生物活性蛋白质，已被证实具有抑制稻瘟病菌的活性，且对高等动物无毒性。目前，转基因水稻经转化脉羊耳兰甘露糖结合蛋白获得抗稻瘟病还未见报道。

技术实现要素：

鉴于上述不足之处，本发明提供了将兰科脉羊耳兰(liparisnervosa(thunb.)lindl.)植物中的一种甘露糖结合蛋白，通过植物基因工程技术，即构建该甘露糖结合蛋白基因的植物表达载体，经基础的农杆菌侵染方式，将上述表达载转化至水稻愈伤组织，筛选培育得到了具有抗稻瘟病菌(pyriculariaoryzaecav.)的转基因水稻。该甘露糖蛋白已经被证实具有抗有效抗水稻稻瘟病菌(pyriculariaoryzaecav.)的生物活性。具体为：

甘露糖结合蛋白基因用于制备转基因抗稻瘟病水稻的应用，所述甘露糖结合蛋白基因为脉羊耳兰(liparisnervosa(thunb.)lindl.)甘露糖结合蛋白基因，其基因的序列如seqidno:1所示。

本发明还提供了一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，该方法采用包含脉羊耳兰(liparisnervosa(thunb.)lindl.)甘露糖结合蛋白基因的植物表达载体对水稻成熟胚诱导的继代三次的愈伤组织进行的遗传转化获得，所述的脉羊耳兰(liparisnervosa(thunb.)lindl.)甘露糖结合蛋白基因的序列如seqidno:1所示；所述的水稻成熟胚诱导的的继代三次的愈伤组织植物材料由包含脉羊耳兰(liparisnervosa(thunb.)lindl.)甘露糖结合蛋白基因的植物表达载体转化；转化菌株为农杆菌菌株eha105；所用载体为phb。

进一步的，所述转基因抗蚜虫水稻的品种包括但不限于：日本晴(oryza.satival.spp.japonica)，川优6203，花香7号，德香4103和旌优127。

本发明丰富了日本晴(oryza.satival.spp.japonica)转基因水稻抗稻瘟病害的途径。对于有效控制这些水稻的稻瘟病及保护水稻农业生产都具有十分重要的意义。

附图说明

图1：phb载体图。

图2：phb-lna转入农杆菌后菌落pcr鉴定。m:dl2000plusdnamarker(成都奥克生物技术有限公司)；+：phb-lna质粒；-：农杆菌eha105空菌；1-7：单克隆。

图3：hgyf和hgyr引物对转phb-lna植株的鉴定。m：dl2000dnamarker(成都奥克生物技术有限公司)；+：模板为phb-lna质粒；-：模板为野生型日本晴水稻dna；1-7：模板为转phb-lna载体阳性植株dna；

图4：lnaf1和lnar1引物对转phb-lna植株的鉴定。m：dl2000dnamarker(成都奥克生物技术有限公司)；+：模板为phb-lna质粒；-：模板为野生型日本晴水稻dna。

具体实施方式

实施例1：日本晴(oryza.satival.spp.japonica)水稻经转化脉羊耳兰(liparisnervosa(thunb.)lindl.)植物甘露糖结合蛋白后抗稻瘟病。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1水稻材料、菌株与质粒载体：日本晴(oryza.satival.spp.japonica)水稻品种，根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株eha105，phb质粒载体，见图1。以上材料均由发明人实验室提供。

1.1.2转化材料：上述水稻品种成熟胚诱导的继代三次的愈伤组织。

1.1.3试剂和药品：植物组织培养试剂均购自sigma公司，潮霉素(hyg)购自roche公司(50mg/l)，其它不作特别标记的化学药品为国产分析纯试剂，所用溶液均以ddh2o配制。

1.1.4培养基：

基本培养基为nb培养基，愈伤诱导、转化、筛选、分化和生根培养基配方如下：

(1)诱导培养基：nb+2,4-d2mg/l；ph5.8-5.9。

(2)预培养培养基：nb+2,4-d2mg/l；ph5.8-5.9。

(3)共培养培养基：nb+2,4-d2mg/l+as100μm/l；ph5.2。

(4)筛选培养基：nb+2,4-d2mg/l+羧苄青霉素250mg/l+hyg30-50mg/l；ph5.8-5.9。

(5)分化培养基：nb+kt10mg/l+naa0.4mg/l；ph5.8-5.9。

(6)生根培养基：1/2ms；ph5.8-5.9。

以上各种培养基中的有机成分，抗生素，激素均用0.22μm微孔滤膜抽滤除菌，其他成分高压灭菌，ms和nb培养基的具体配方如下。

1.2方法

1.2.1农杆菌转化

1.2.1.1农杆菌感受态细胞的制备

整个操作过程在超净工作台中完成，具体操作步骤为：

(1)将本实施例1.1.1中超低温冰箱中保存的农杆菌eha105取出，在yeb固体培养基上划线接种，28℃培养1～2d。

(2)挑取单菌落于5ml含50mg/lkan和50mg/lrif的yeb液体培养基中，28℃、250rpm振荡培养3～4h。

(3)冰浴30min后4℃、10,000g离心5min，收集菌体。

(4)用1ml抽滤灭菌的20mmol/lcacl2溶液悬浮菌体，分装成100μl/管，超低温冰箱或液氮冷冻保存。

1.2.1.2农杆菌的转化

(1)取出本实施例1.2.1.1中的农杆菌感受态细胞，置于冰上解冻。

(2)加入制备的10μl脉羊耳兰甘露糖结合蛋白的基因与连接到phb质粒上的产物，小心混匀后，冰浴10min。

(3)液氮中冷冻1min后轻轻放在37℃水浴中保温5min。

(4)加入1mlyeb或lb液体培养基，在28℃摇床中微振荡培养4～6h。

(5)5000g离心5min。

(6)保留300μl左右上清液，用枪头吹吸悬浮菌替，均匀涂布在含50mg/lkan和50mg/lrif的yeb或lb固体培养基上，28℃培养2～3d。

1.2.1.3农杆菌的阳性菌落鉴定

挑取本实施例1.2.1.2中培养得到的形状形态规则饱满的单菌落接种于800μl含相应抗生素的yeb液体培养基中。培养24后，取少量菌液做pcr鉴定。电泳检测结果见图2。

1.2.1.4农杆菌的保存

在超净工作台上取本实施例1.2.1.3中的阳性菌液，按菌液：甘油＝5:1的比例加入甘油，吹打均匀，然后放入-80℃超低温冰箱保存，需要使用时，冰上解冻，取少许加到新培养基中活化培养。

1.2.2农杆菌介导法转化水稻愈伤

1.2.2.1愈伤组织的预培养

分别取本实施例1.1.2中颜色黄亮、自然分散、直径2-3mm的日本晴(oryza.satival.spp.japonica)水稻品种的成熟胚诱导的继代三次的愈伤组织，分别转接至预培养培养基中，27℃暗培养4天。

1.2.2.2农杆菌的培养

(1)从超低温冰箱取出本实施例1.2.1.4中保存的少量菌液于添加有kan50mg/l和rif50mg/l的yeb固体培养基上划线，28℃暗培养2-3d进行活化。

(2)挑取一个单菌落转接至yeb液体培养基中，28℃恒温摇床培养24h。

(3)取适量菌液于4℃、4000g离心10min。

(4)弃上清，吸取少量抽滤好的aam培养基使农杆菌菌体悬浮。取适量菌液滴加到aam培养基中，静置一小时，使农杆菌形成均匀的悬浮液。aam培养基配方如下：

1.2.2.3共培养

将本实施例1.2.2.1中经过预培养的愈伤组织置于灭菌的培养瓶中，分别加入本实施例1.2.2.2中的农杆菌菌液，轻轻摇动后静置20min，然后倒掉菌液，将愈伤组织置于无菌滤纸上晾干，接种在共培养基中，25℃暗培养3d。

1.2.2.4洗除农杆菌

将本实施例1.2.2.3中的愈伤组织置于灭菌的培养瓶中，无菌水冲洗至无丝状菌体。用含250mg/l羧苄青霉素的无菌水在摇床上120rpm震荡1h，然后将愈伤组织在无菌滤纸上晾干。

1.2.2.5抗性愈伤的筛选

将本实施例1.2.2.4中洗净晾干的愈伤组织接于筛选培养基上，每两周转接一次，潮霉素浓度逐渐增加，浓度分别为25mg/l,35mg/l和45mg/l。

1.2.2.6植株的分化和生根

按照本实施例1.2.2.5方法，经过2次转接后，筛选培养基中的愈伤组织长出瘤状鲜黄色抗性愈伤，待抗性愈伤长大松散之后，挑选适量接于分化培养基上，28℃全光照条件下培养。待幼苗长出后转入生根培养基，28℃，16h光照，8h黑暗条件下培养。幼苗生根后，炼苗2-3d，再洗净培养基种于土壤中，温室培养。

1.2.2.7分别统计本实施例lna转化水稻的转化率和分化率

转化率(％)＝抗性愈伤克隆数/侵染愈伤粒数×100％

分化率(％)＝成功分化克隆数/抗性愈伤克隆数×100％

阳性率(％)＝转基因阳性植株数/转基因植株数×100％

phb-lna载体转化水稻愈伤组织的转化率、分化率和阳性率如下。

1.2.2.8转基因水稻的种植

所有上述试验的品种的转基因水稻植株按本实施例1.2.2.6中温室培养至开始分蘖时种植于四川大学试验基地。

1.2.2.9转基因阳性鉴定及表达分析

1.2.2.9.1转基因水稻的阳性鉴定

潮霉素基因鉴定：以转基因植物基因组作为模板，利用连接在phb载体上的潮霉素hgy抗性基因标记引物hgyf和hgyr进行pcr扩增。鉴定结果见图3。

hgyf：5’-tcgttatgtttatcggcactttg-3’；

hgyr：5’-gcgtctgctgctccatacaag-3’。

外源基因鉴定：以转基因植物dna为模板，用外源基因引物(lnaf1和lnar1)进行pcr扩增鉴定。

lnaf1：5’-cgggatccatggcttcctccctaaccag-3’；

lnar1：5’-cgagctctcatgcttcatcttttccaag-3’。

phb-lna植株的鉴定结果见图4。

1.2.2.9.2外源lna基因在转基因水稻中的表达分析

提取本实施例1.2.2.9.1中的阳性转基因水稻(t0代)rna，反转录后用lna基因引物(lnaf1和lnar1)进行pcr扩增，得到525bp的单一条带，说明转基因植株中lna基因成功整合至水稻基因组中，并在rna水平上有表达。回收片段经连接后送测序，经测序比对，lna基因在转化过程中未发生突变。

1.2.2.10转基因植株的抗病能力测定

水稻品种对稻瘟病的抗性级别确定如下：级别越低，抗性越高；反之，级别越高，抗性就越低。

测试结果

转脉羊耳兰甘露糖结合蛋白后日本晴转基因水稻对稻瘟病的抗性测试结果如下：

序列表

<110>四川大学

<120>甘露糖结合蛋白基因用于制备转基因抗稻瘟病水稻的应用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>715

<212>dna

<213>兰科脉脉羊耳兰（orchidaceae，liparisnervosa(thunb.)lindl.）

<400>1

gatcccaacaaagcagccaacccagccatggcttcctccctaaccagctccaacacaatt60

ctcctcctctccatcctgttcttcatagcccacttaaccgctccagcctctgctaacaac120

cgcttgaatgccggcaattcgctcgggaccggacaatcactagccgaaggcgcctacata180

ttcgtcattcaaaatgactgcaacctcgtcctctatgataacaaccaggcagtttgggct240

tcagggaccaatggaagggcctccaactgcattctcagcatgcaaaccgatggaaatctc300

gtaatttacagtggcagcacggccatctgggcgagcaacaccaatcgccaaactgggttt360

tattatctcattctacagagagatcgcaacgtcgttatctatgataacgccaacaatgct420

atttgggcgactggaacaaacgtcggcaacgctgctattaccgtcattccgcatagcaac480

ggcacgatggcagcgtgtggagcgtcgcagaataaggtgaaggagctgtatcttggaaaa540

gatgaagcatgaaatcctttatagatgggtgaaggaagtgttatatgttagtaggttttg600

aataaaatggtaatggtgatcggtgagtctgaggatgcttttatctctgctgtagtatgg660

atgtttgctctgaataataaagttgcttgtgtgaattaaaaaaaaaaaaaaaaaa715