一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法及其应用与流程

本发明涉及水产动物遗传育种技术领域，更具体涉及一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法，采用该方法可以创制出四倍体的黄鳝，还可以培育出人工诱导雌核发育的二倍体黄鳝，为培育出具有优良性状的黄鳝养殖品种、快速获得养殖黄鳝纯系提供了强有力的技术支持。

背景技术：

黄鳝(monopterusalbus)为合鳃鱼目、合鳃鱼科、黄鳝属，具有雌雄同体、先雌后雄的性反转生物学特性，其性腺发育在生命过程中经历雌性、间性和雄性三种性腺分化。黄鳝是开展鱼类性别分化和生殖发育机制研究的理想试验材料。不仅如此，黄鳝肉味鲜美，含有丰富的多不饱和脂肪酸，如dha(二十二碳六烯酸，docosahexaenoicacid)、epa(二十碳五烯酸，eicosapentaenoicacid)和卵磷脂，营养价值高，是我国重要的名特优水产养殖对象。

统计资料表明，黄鳝在国内外市场的年需求量为300万吨左右，但目前年产量不到40万吨，全国黄鳝苗种缺口至少在200亿尾以上，其原因在于黄鳝雌雄同体、先雌后雄的天然性反转特性，既导致雌性亲鳝因个体小而怀卵量少，又造成雌亲鳝与雄亲鳝发育不同步，生产中无法获得稳定的雌雄亲本群体，尤其是雄性性成熟亲本奇缺。因此，黄鳝的规模化人工繁殖难以进行，养殖黄鳝所需要的苗种几乎全部来自于捕捞野生鳝苗。黄鳝养殖业的可持续发展亟需培育出性状稳定的优良养殖品种和品系。

染色体倍性操作技术在鱼类优良品种培育方面发挥了巨大作用。不育的三倍体鱼将性腺发育所需的繁殖能用于生长，因此三倍体鱼通常具有高产的特性。三倍体鱼的培育通常采用温度休克或秋水仙素处理等物理或化学方法直接诱导，但无论是物理方法还是化学方法，都无法获得100％的三倍体鱼。通过制备出四倍体鱼后，再与二倍体鱼进行倍间杂交，则可以培育出100％的三倍体鱼。目前已经建立了虹鳟、罗非鱼和团头鲂等人工同源四倍体鱼的培育方法，以及鲫鲤、鲫鲂等通过远源杂交染色体倍性操作产生的异源四倍体鱼的培育方法(徐康，段巍，肖军，陶敏，张纯，刘筠，刘少军，鱼类遗传育种中生物学方法的应用及研究进展。中国科学：生命科学，2014，44(12)：1272-1288.)。但是，目前仅有1篇热休克人工诱导三倍体黄鳝的研究报道(常重杰，杜启艳，卢龙斗，路淑霞，李慧.热休克诱导三倍体黄鳝的研究，河南师范大学学报(自然科学版)，1997，25(2):60-63.)，迄今没有四倍体黄鳝的培育技术。

连续近亲交配是获得养殖鱼类纯系的经典方法，但这种方法通常需要8-10代同胞兄妹的交配才可能获得纯系。人工诱导雌核发育则可以快速增加鱼类遗传的同质性，是迅速建立养殖鱼类纯系的有效方法。抑制受精卵第一次卵裂雌核发育的纯合度相当于连续4代的同胞兄妹交配，极大地提高了养殖鱼类纯系培育的效率。人工诱导雌核发育技术已经成功应用于鲤、鲫、草鱼、团头鲂、罗非鱼、牙鲆、虹鳟等重要养殖鱼类(komenh,thorgaardgh.androgenesis,gynogenesisandtheproductionofclonesinfishes:areview.aquaculture,2007,269(1-4):150–173.felipa,zanuys,carrillom,piferrerf.inductionoftriploidyandgynogenesisinteleostfishwithemphasisonmarinespecies.genetica,2001,111(1-3):175–195.)，但是，迄今尚没有建立黄鳝的人工诱导雌核发育技术。

针对养殖黄鳝没有品种，种质完全依赖于野生资源的问题，本发明提供了一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法，为培育出黄鳝优良养殖品种和品系提供了强有力的技术手段。一方面，利用该技术可以创制出四倍体的黄鳝，为进一步培育出三倍体的黄鳝奠定了基础。另一方面，还可以利用该方法进行黄鳝的人工诱导雌核发育，从而快速获得黄鳝纯系。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法，方法简单。

本发明的另一个目的在于提供了一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法的应用。利用本发明的方法，可以创制出四倍体的黄鳝，为进一步培育出三倍体的黄鳝奠定了基础。另一方面，还可以利用该方法进行黄鳝的人工诱导雌核发育，从而快速获得黄鳝纯系。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法，包括下述步骤：将受精后102～127min内的黄鳝受精卵置于40-42℃水浴中热休克处理3-5min。

以上所述的方法中，优选的，是将受精后第105min的黄鳝受精卵置于40℃水浴中热休克处理3.5min。

以上所述的方案中，优选的，热休克处理后的受精卵按照本领域的常规方式进行孵化，孵化出膜后利用流式细胞仪筛选目标黄鳝。

一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法的应用，包括利用该方法制备四倍体的黄鳝，或是用于制备黄鳝纯系；

以上所述的应用，优选的，是将黄鳝精子与卵子混合受精后，利用本发明提供的方法抑制受精卵的第一次卵裂，从而获得四倍体黄鳝。

以上所述的应用，优选的，是将异源鱼类的灭活精子与黄鳝卵子混合受精后，再利用本发明提供的方法抑制受精卵的第一次卵裂，从而获得人工诱导雌核发育的二倍体黄鳝。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

目前没有任何进行黄鳝四倍体培育和人工诱导黄鳝雌核发育的技术，本发明第一次在黄鳝四倍体培育和人工诱导雌核发育的操作技术方面取得突破，第一次建立黄鳝雌核二倍体的诱导方法，方法简单，诱导效率高，为培育黄鳝优良养殖品种，快速获得黄鳝纯系提供了强有力的技术手段。

该技术既可以用于培育黄鳝优良养殖品种应用于生产实践，又可以利用人工诱导雌核发育培育出的基因组纯合度高的黄鳝进行全基因组测序、解析黄鳝性反转的分子遗传机理、发掘重要功能基因等基础研究。

附图说明

图1为二倍体黄鳝流式细胞仪倍性检测结果示意图。

图2为四倍体黄鳝流式细胞仪倍性检测结果示意图。

具体实施方式

本发明实施例所述技术方法，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法在制备四倍体黄鳝中的应用，包括下述步骤：

1.热休克处理控制黄鳝受精卵卵裂

将受精后第105min的黄鳝受精卵置于在40℃水浴中热休克处理3.5min，以抑制受精卵第一次卵裂。将热休克处理后的黄鳝受精胚转移至玻璃培养皿(直径20cm)室温静置孵化至出膜(胡炜，冯科，陈戟，朱作言。一种黄鳝基因编辑的方法。中国发明专利，2016年8月11日，申请号：201610651812.1.申请公布号：cn106222204a.申请公布日：2016.12.14)。热休克后，存活的受精卵与总受精卵之间的比例是85.5％。

2.四倍体黄鳝的筛选

出膜后的黄鳝幼苗转移到塑料盒中养殖，塑料盒规格为40cm×20cm×10cm，投喂鸡蛋黄和水蚯蚓。当幼苗生长至1个月时，转移到室外网箱中进行养殖，网箱规格为1m×1m×1m，网目大小为100目，设置水葫芦作为黄鳝的栖息地，投喂水蚯蚓和商业化的黄鳝配合饲料养殖。待黄鳝养殖到20cm左右，抽取血液，采用流式细胞仪(bdfacsversetmflowcytometer，bdbiosciences，nj，usa)检测血细胞中的dna含量，就可以筛选出四倍体黄鳝。出膜后四倍体黄鳝与出膜黄鳝的比例是41.4％。

具体检测方法如下：

(1)取正常繁殖的黄鳝及上述热休克处理得到的黄鳝，分别抽取静脉血2-5ul于装有1ml1×pbs溶液的1.5mlep管中，轻轻吹打混匀；

(2)1000rpm离心15min，弃上清，加入1ml-20℃预冷70％乙醇，轻轻吹打混匀后于-20℃固定过夜；

(3)第二天，1000rpm离心15min，去上清，加入500μl碘化丙啶染色液(0.04mg/ml，propidiumiodide(pi)，sigma)，轻轻吹打混匀；

(4)静置1小时后，经200目网片过滤，利用流式细胞仪(bdfacsversetmflowcytometer，bdbiosciences，nj，usa)检测dna相对含量。

实施例2：

不同受精时间进行热休克处理后的四倍体诱导情况：

分别将受精后第102min，105min，120min和127min的黄鳝受精卵置于在40℃水浴中热休克处理3.5min，以抑制受精卵第一次卵裂。将热休克处理后的黄鳝受精胚转移至玻璃培养皿(直径20cm)室温静置孵化，待黄鳝受精胚在室温条件下孵化8天后，分别随机挑选上述热休克处理后的黄鳝胚胎，采用流式细胞仪(bdfacsversetmflowcytometer，bdbiosciences，nj，usa)检测这些热休克处理后的黄鳝胚胎的倍性，结果显示，在受精后102min，105min，120min和127min经40℃热休克处理3.5min后，获得的四倍体黄鳝胚胎比例分别为10.5％，41.4％，25％和10.9％。具体检测方法如下：

(1)待黄鳝受精卵在室温条件下孵化8天后(心脏搏动期)，分别随机挑选以上4组黄鳝胚胎若干，显微镜下剥离卵黄，分别放置在干净培养皿中用刀片切碎，转入装有500ul1×pbs溶液的1.5mlep管中；

(2)加入10μl胶原酶(5mg/ml，liberasetmresearchgrade，roche)，摇床(25℃，200rpm)消化处理2h至无明显组织块；

(3)1000rpm离心15min，弃上清，加入500μl-20℃预冷70％乙醇，轻轻吹打混匀后于-20℃固定过夜；

(4)第二天，1000rpm离心15min，去上清，加入500μl碘化丙啶染色液(0.04mg/ml，propidiumiodide(pi)，sigma)，轻轻吹打混匀；

(5)静置1小时后，经200目网片过滤，利用流式细胞仪(bdfacsversetmflowcytometer，bdbiosciences，nj，usa)检测dna相对含量。

实施例3：

一种控制黄鳝受精卵第一次卵裂的方法在制备雌核发育黄鳝中的应用，包括下述步骤：

人工挤压性成熟的雄性鲤鱼腹部，获得鲤鱼精子，在照距26cm条件下，用30w紫外灭菌灯(254nm)照射鲤鱼精子30min，然后与黄鳝卵子进行人工授精，在受精105min后，将黄鳝受精卵在40℃水浴热休克处理3.5min，热休克处理后的黄鳝胚胎按实施例1所述方法自然孵化出苗。

对照组为鲤鱼精子或灭活的鲤鱼精子与黄鳝卵子受精后，进行孵化。

结果：鲤鱼精子无论灭活与否，与黄鳝卵子杂交的胚胎都不能存活，紫外线照射处理后的鲤鱼精子与黄鳝卵子受精后，利用本发明提供的方法孵化得到的黄鳝均为人工诱导雌核发育的黄鳝。