一种识别HL‑60内Ag+的萘酰亚胺类化合物荧光探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种能识别hl-60细胞内ag⁺的萘酰亚胺类化合物荧光探针及其制备方法，属于金属离子的荧光探针领域。

背景技术：

银是人体组织内的微量元素之一。微量的银不但能帮助人体抵抗有害的侵袭病菌，它还能帮助修复和重建对生命至关重要的人体组织，但是ag⁺过量会阻断生物体的代谢系统，对人体具有非常大的危害。联合国世界卫生组织(who)明确规定银对人体的安全值为0.05mg/l以下，饮用水中银离子的限量为0.05mg/l．如果饮用水里的银含量超过0.05mg/l就会产生明显的毒负作用．其中白血病就是其中较为严重的疾病，本方法使用人早幼粒白血病细胞hl-60，用于检测过量的银离子对白血病的产生的影响，目前银的化合物被广泛应用于人类生活的各行各业，人类机体在环境中接触银离子的机会大大增加，也说明了人类患白血病的几率也大大增加。化疗是白血病治疗的重要手段,但在临床应用过程中有严重的不良反应并易产生耐药。因此，发展银离子的快速检测不论是对水质控制还是对环境保护以及人类生活还是用于银离子过量导致的白血病的早期检测都有积极的作用。

目前常用于检测ag⁺分析检测方法目前主要是利用ag⁺和指示剂(也可称为化学分子探针)之间的特异性化学反应或超分子作用产生的信号变化来对ag⁺进行分析检测，这些荧光探针分子对ag⁺有高选择性以及较高的灵敏度。

本发明提供了一种能够识别hl-60细胞内ag⁺的荧光探针萘酰亚胺类化合物及其制备方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能识别hl-60细胞内ag⁺的萘酰亚胺类化合物荧光探针及其制备方法。本发明提供的荧光探针对hl-60细胞内ag⁺的识别结果准确，灵敏度高。

本发明提供的能够识别hl-60细胞内ag⁺的萘酰亚胺类化合物，具有式(i)所示

（i）

本发明还提供了一种能识别hl-60细胞内ag⁺的萘酰亚胺类化合物荧光探针的制备方法。更详细地说是以4-溴-1,8-萘酐、氨基取代氮杂环为原料，合成出中间体n取代4-溴-1,8-萘酰亚胺，然后中间体与氨基取代氮杂环合成萘酰亚胺类化合物化合物。

实现本发明的技术方案如下：

反应步骤如下：

（1）将4-溴-1,8-萘酐、2-氨基吡啶、无机碱、氯化铜放入甲苯中，n2保护加热回流后，反应结束后得到粗产物，经重结晶得到纯的化合物（ⅱ），为黄色固体。

（2）将化合物（ⅱ）与4-硝基苯甲醛、2-氨基噻唑、无机碱和碘化亚铜溶于dmf中加热回流，反应后经柱层析得到化合物（i），为橙黄色晶体。

根据本发明，优选的，步骤（1）所述的4-溴-1,8-萘酐、2-氨基吡啶的摩尔比为1:1；

根据本发明，优选的，步骤（2）所述的化合物（ⅱ）n-（2-吡啶基）4-溴-1,8-萘酰亚胺、2-氨基噻唑的摩尔比为1:1；

根据本发明，优选的，步骤（1）所述的反应温度为90-140℃，更优选为110-120℃；

根据本发明，优选的，步骤（2）所述的反应温度为90-140℃，更优选为100-120℃；

根据本发明，优选的，步骤（1）所述催化剂氯化铜加入量为4-溴-1,8-萘酰亚胺的摩尔量的2倍到3倍；

根据本发明，优选的，步骤（2）所述催化剂碘化亚铜加入量为过量；

根据本发明，步骤（1）所述的无机碱可以为氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾或磷酸钾，优选的为氢氧化钠；

根据本发明，优步骤（2）所述无机碱可以为氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾或碳酸铯，优选的为碳酸铯；

更为详细的，所述的能够识别hl-60细胞内ag⁺的萘酰亚胺类化合物荧光探针的制备方法，步骤如下：

（1）在装有回流冷凝装置的100ml的圆底烧瓶中依次加入1mmol4-溴1,8-萘酐、1mmol2-氨基吡啶、2mmol氢氧化钠以及2mmol氯化铜于20ml的甲苯中，反应温度设定115℃。采用schlenkline技术n2保护下回流，tlc监测反应，17h后，完成反应。放置过夜，静置室温后，析出固体，过滤，再以40ml的甲苯重结晶，得化合物（ⅱ），收率82%。称取化合物（ⅱ）1mmol的n-(2-吡啶基)-4-溴-1，8-萘酰亚胺，1mmol的2-氨基噻唑，2mmol的碳酸铯以及过量的碘化亚铜于20ml的dmf中。采用schlenkline技术n2保护下回流，tlc监测反应，17h后，完成反应。放置过夜，静置室温后，析出固体，过滤，再以40ml的甲苯重结晶，得化合物（ⅱ），收率49.6%。

本发明的优点是：与现有技术相比，本发明提供了一种能够识别hl-60细胞内ag⁺的荧光探针萘酰亚胺化合物的制备方法，本发明提供的能够识别hl-60细胞内ag⁺的荧光探针萘酰亚胺化合物具有式（i）的结构，本发明所述的萘酰亚胺荧光探针可以用于hl-60细胞内ag⁺检测，对ag⁺灵敏度高，响应值高；实验结果表明，本发明所述化合物作为荧光探针使用于hl-60细胞时，对ag⁺有显著的响应；对于不同浓度的ag⁺检测时呈良好的线性关系，在hl-60细胞内对ag⁺有很好的选择性，染有化合物萘酰亚胺的hl-60悬浮细胞经蓝光激发后，在显微镜中观察，细胞发出绿色荧光，检测方法可靠。

附图说明

图1为识别hl-60细胞内银离子荧光探针n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的紫外吸收谱图。

图1-1为识别hl-60细胞内银离子荧光探针n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的荧光光谱图。

图2为识别hl-60细胞内银离子荧光探针n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺在650nm的激发波长下测定对于ag⁺选择性的荧光光谱图。

图3为识别hl-60细胞内银离子荧光探针n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺在650nm的激发波长下测定加入不同浓度的hg⁺前后的荧光光谱图。

图4为hl-60悬浮细胞在银离子荧光探针n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺溶液中培养30min前后的荧光激发对比图，图中：a为hl-60悬浮细胞未激发的图像；b为在有化合物n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的hl-60悬浮细胞经蓝光激发后，在显微镜中观察，细胞发出微弱的绿色荧光；c为hl-60悬浮细胞在n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺和ag⁺混合溶液中培养30分钟后，染有n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺和ag⁺的混合溶液的hl-60悬浮细胞经蓝光激发后细胞的荧光强度有增强。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：本实施例为根据所述式(i)结构化合物的反应流程制备的具体实施例。

（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺：在装有回流冷凝装置的100ml的圆底烧瓶中依次加入1mmol4-溴1,8-萘酐、1mmol2-氨基吡啶、2mmol氢氧化钠以及2mmol氯化铜于20ml的甲苯中，反应温度设定115℃。采用schlenkline技术n2保护下回流，tlc监测反应，17h后，完成反应。放置过夜，静置室温后，析出固体，过滤，再以40ml的甲苯重结晶，得化合物（ⅱ），收率82%。称取化合物（ⅱ）1mmol的n-(2-吡啶基)-4-溴-1，8-萘酰亚胺，1mmol的2-氨基噻唑，2mmol的碳酸铯以及过量的碘化亚铜于20ml的dmf中。采用schlenkline技术n2保护下回流，tlc监测反应，17h后，完成反应。放置过夜，静置室温后，析出固体，过滤，再以40ml的甲苯重结晶，得化合物（ⅱ），收率49.6%。

其核磁共振氢谱图数据为：

¹hnmr(100mhz,cdcl3):δ9.52(s,1h),8.81(dd,j=4.7,1.5hz,1h),8.65(dd,j=7.4,1.6hz,1h),8.49(dd,j=7.5,1.4hz,1h),8.26(d,j=7.5hz,1h),8.07(dd,j=7.5,1.5hz,1h),7.92–7.81(m,3h),7.79(d,j=7.5hz,1h),7.39(d,j=7.5hz,1h),6.86(d,j=7.5hz,1h).

实施例2：实施例1制得的n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的紫外吸收谱图（见图1）和荧光光谱图（见图1-1）。

准确称取n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺，将其移入10ml容量瓶中，用无水乙醇溶解，待样品完全溶解后定容，配制成浓度3.0×10^-5mol•l^-1的溶液，分别测定其紫外吸收光谱和荧光激发光谱。测定结果如图1、图1-1所示；图1为银离子荧光探针n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的紫外吸收光谱；图1-1为银离子荧光探针n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺对于聚集有诱导发光效应检测的荧光光谱图。

从图1可以看出n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的最大吸收波长在420nm处；从图1-1可以看出n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的最大激发波长在650nm处。因此综合考虑决定化合物的激发波长为650nm。选择最大激发波长是为了获得高激发率的物质形态，提高灵敏度。

实施例3：实施例1制得的n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺荧光探针在650nm的激发波长下测定对于ag⁺选择性。

准确称取n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺，溶于色谱纯无水乙醇中，配置成浓度为1.0×10^-4mol•l^-1的配体溶液中，分别选取10种不同金属离子（zn²⁺、hg⁺、cu²⁺、mg²⁺、li⁺、al³⁺、ni⁺、k⁺、ca²⁺、ag⁺），配成配体浓度3.0×10^-5mol•l^-1，金属离子浓度1.0×10^-4mol•l^-1的混合溶液，测定溶液荧光光谱的变化。测定结果如图2所示。

从图2可以看出，ag⁺的荧光强度明显强于其它离子荧光强度，说明n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺荧光探针对ag⁺有很高的选择性。

实施例4：实施例1制得的n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺对不同浓度的ag⁺的荧光检测。

准确称取n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺，溶于色谱纯无水乙醇中，配置成浓度为1.0×10^-4mol•l^-1的溶液，再分别按照浓度为5×10^-5mol•l^-1、1×10^-4mol•l^-1、1.5×10-⁴mol•l^-1、2×10-⁴mol•l^-1、2.5×10^-4mol•l^-1、3×10^-4mol•l^-1、3.5×10^-4mol•l^-1、4×10^-4mol•l^-1、4.5×10^-4mol•l^-1。加入ag⁺，配成化合物浓度1.0×10^-5mol•l^-1，金属离子浓度分别为0、0.5×10^-5mol•l^-1、1×10^-4mol•l^-1、1.5×10^-4mol•l^-1、2×10^-4mol•l^-1、2.5×10^-4mol•l^-1、3×10^-4mol•l^-1、3.5×10^-4mol•l^-1、4×10^-4mol•l^-1、4.5×10^-4mol•l^-1的10瓶混合溶液，分别测定溶液荧光光谱的变化。测定结果如图3所示。

从图3看出加入不同浓度的ag⁺，溶液的荧光光谱最大发射峰都不曾发生了蓝移或红移，而荧光强度随之有明显增强。随着金属离子浓度的升高，n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的混合溶液荧光强度成上升趋势。

实施例5：hl-60悬浮细胞在实施例1制得的n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺溶液中培养30min前后的荧光激发对比。

将培养好的hl-60细胞置于配制好的n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺溶液中，浸泡30分钟后用磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)洗三次，在倒置荧光显微镜下用蓝光激发，并照相。

将培养好的hl-60细胞置于配制好的n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺和金属离子的混合溶液中浸泡30分钟后，取出用磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)洗三次，在倒置荧光显微镜下蓝光激发并照相。测定结果如图4所示。

从图4可以看出，图中a为hl-60悬浮细胞未激发的图像，与图中a相比，在有化合物n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺的hl-60悬浮细胞经蓝光激发后，在显微镜中观察，细胞发出微弱的绿色荧光[见图中b]，而hl-60悬浮细胞在n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺和ag⁺混合溶液中培养30分钟后，染有n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺和ag⁺的混合溶液的hl-60悬浮细胞经蓝光激发后细胞的荧光强度有增强[见图中c]。从而可以说明n-（2-吡啶基）-4-（2-噻唑基）-1.8-萘酰亚胺可以特异性识别hl-60细胞中的hg⁺，在hl-60细胞内实现了对ag⁺响应的荧光增强分子开关，这为该体系应用于生物识别等更多领域起到了较大的奠基作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。