本发明涉及一种生物指示剂菌片洗脱方法，该技术属于灭菌监测领域。
背景技术：
在医疗保健行业，卫生检疫行业，制药企业等多种涉及无菌技术的行业，常常有必要对各种无菌生产工艺、无菌产品、无菌包装材料等灭菌效果进行评估验证，检测设备的灭菌效力。世界各地每年都会有因灭菌不彻底导致感染事件发生的报道。生物监测即是通过标准化的菌株，其合乎要求的抗力来考核灭菌负荷是否达到无菌保障水平的要求。
生物指示剂是灭菌监测的金标准，通过标准化的菌株及符合要求的抗力来对特定灭菌过程进行监测。生物指示剂中所用菌株比器械或敷料上真实的微生物负荷的抗力更大，因此通过生物指示剂可对灭菌过程进行检测，保证灭菌有效性。
gb18281中，生物指示剂的定义为对特定处理有确定抗力，并包装在内层包装中可供使用的染菌载体。染菌载体最常见的形式是以滤纸片作为试验菌的支持材料。专利cn201410080507.2提供了一种提高菌片回收率的方法，采用组织破碎仪的方法，对菌片进行破碎。破碎后采用细胞筛过滤去除菌片碎屑的方法进行菌片中芽孢回收。由于采用2ml离心管进行菌片破碎，破碎后的菌片碎屑如不进行细胞筛过滤，则在后续稀释过程中菌片碎屑堵塞移液器枪头，导致稀释计数结果存在较大的偏差。而采用细胞筛过滤菌片碎屑的方法，也会导致部分芽孢吸附在菌片碎屑及细胞筛上，对计数结果存在一定的影响。专利cn201410080507.2所采用的洗脱液中含有一定浓度的nacl，生物指示剂菌片经过一定时间的灭菌暴露后，如若洗脱液中含有盐，则会影响芽孢的恢复生长。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是：
提供一种生物指示剂菌片的洗脱方法,用于生物指示剂菌片的活菌计数及抗力测定,解决了目前菌片洗脱效率低，芽孢计数有偏差的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种生物指示剂菌片的洗脱方法，包括如下步骤：
a取无菌容器，加入无菌磁力搅拌子或玻璃珠;
b将上述容器中加入菌片洗脱液；
c将生物指示剂菌片采用无菌操作方法放置于上述容器中；
d将上述容器放于磁力搅拌器上，进行菌片破碎；
e将破碎后的菌片进行涡旋震荡，进一步对菌片进行破碎；
f用无菌水对上述菌片悬液进行稀释，得到稀释后的样品。
优选的，所述容器为三角摇瓶体积为100ml-500ml，所述玻璃珠直径为4mm-10mm；所述玻璃珠直径为6mm-8mm；所述玻璃珠使用数量为5-15颗；所述菌片洗脱液为0.01%-0.1%的吐温-80溶液；所述菌片洗脱液的体积为30ml-100ml；所述磁力搅拌器上破碎时间为15min-20min；所述再次破碎的涡旋震荡的时间为1min-5min；所述破碎样品的稀释所用的溶液为无菌水；所述生物指示剂为压力蒸汽灭菌生物指示剂，环氧乙烷灭菌生物指示剂，过氧化氢等离子体灭菌生物指示剂中的一种或几种。
本发明的有益效果是：与现有技术相比,本发明所述生物指示剂菌片的洗脱方法,采用磁力搅拌与涡旋两种手段来将菌片破碎完全，以协同提高菌片的洗脱效率。在菌片破碎时，采用较大体积（30ml-100ml）的洗脱液，一方面有助于菌片的破碎完全，另一方面将破碎的滤纸纤维稀释，使其不再堵塞移液器枪头,因此,无需对破碎后的滤纸纤维悬液进行细胞筛过滤，从而避免了由于过滤时芽孢吸附在滤纸纤维碎屑和细胞筛表面，对计数结果造成影响,同时也降低了菌片污染杂菌的风险。其次,本发明所述方法在破碎和稀释的不同阶段，选用不同的洗脱液，在菌片破碎时采用0.01%-0.1%的吐温80作为洗脱液，以提高菌片的洗脱效果；在稀释时，以无菌水对悬液进行稀释，降低稀释液中的吐温80含量，使其不影响芽孢的活化生长。
附图说明
图1：菌片破碎后悬液在相差显微镜下观察示意图；
图2：不同洗脱液的洗脱效率对比图。
具体实施方式
下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
实施例1生物指示剂菌片洗脱方法
取压力蒸汽灭菌生物指示剂菌片，按照如下步骤对其进行破碎洗脱：
1)取250ml无菌三角摇瓶，加入无菌磁力搅拌子和6颗直径为6mm的玻璃珠。
2)将上述三角摇瓶中加入50ml，0.1%吐温80菌片洗脱液。
3)将生物指示剂菌片，采用无菌操作方法，放置于上述三角摇瓶中。
4)将三角摇瓶放于磁力搅拌器上，进行菌片破碎15min。
5)将上述破碎的样品进行涡旋震荡5min，进一步对样品进行破碎。
取5ul菌片破碎后的悬液滴于洁净载玻片上，轻轻盖上盖玻片，置于奥林巴斯cx-41，相差显微镜下观察。如下图1所示,芽孢在滤纸纤维周围聚集，若在破碎后，采用细胞筛过滤的方法除去滤纸纤维，必然伴随着部分芽孢被滤纸纤维吸附，导致洗脱回收率的下降。
实施例2不同洗脱液的洗脱效率
取两组压力蒸汽灭菌生物指示剂菌片，每组3片菌片，染菌量宣称值为3.8×105。分别采用洗脱液(a组为0.1%吐温80，b组为无菌水)，对菌片进行洗脱，比较不同洗脱液的洗脱效率。
实验方法：
a组样品：
1)取250ml无菌三角摇瓶，加入无菌磁力搅拌子和6颗直径为6mm的玻璃珠。
2)将上述三角摇瓶中加入50ml纯化水。
3)将生物指示剂菌片，采用无菌操作方法，放置于上述三角摇瓶中。
4)将三角摇瓶放于磁力搅拌器上，进行菌片破碎15min。
5)将上述破碎的样品进行涡旋震荡5min，进一步对样品进行破碎。
6)取破碎后的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-1的样品。
7)取-1稀释度的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-2的样品。
8)取-2稀释度的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-3的样品。
9)取-3的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-4的样品。
10)对每个稀释度的样品，分别取1ml菌悬液，加入无菌平板中，倾倒15mltsa培养基。每个稀释度做3个平行。将凝固后的平板倒置放于56°培养箱中，培养48h后计算菌落数。
b组样品:
1)取250ml无菌三角摇瓶，加入无菌磁力搅拌子和6颗直径为6mm的玻璃珠。
2)将上述三角摇瓶中加入50ml的0.1%吐温-80。
3)将生物指示剂菌片，采用无菌操作方法，放置于上述三角摇瓶中。
4)将三角摇瓶放于磁力搅拌器上，进行菌片破碎15min。
5)将上述破碎的样品进行涡旋震荡5min，进一步对样品进行破碎。
6)取破碎后的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-1的样品。
7)取-1稀释度的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-2的样品。
8)取-2稀释度的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-3的样品。
9)取-3的样品悬液500ul至10ml离心管中，加入4.5ml无菌水，得稀释度为-4的样品。
10)对每个稀释度的样品，分别取1ml菌悬液，加入无菌平板中，倾倒15mltsa培养基。每个稀释度做3个平行。将凝固后的平板倒置放于56°培养箱中，培养48h后计算菌落数。
如图2所示,通过比较发现:a组的洗脱率为63.1%，b组的洗脱率为97.8%，0.1%吐温80的洗脱效率明显高于无菌水。
以上显示和描述了本发明的基本原理,主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。