一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用的制作方法

文档序号：14827778发布日期：2018-06-30 09:10阅读：492来源：国知局

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种融合酶的构建及其在催化柚皮素产山萘酚中的应用。

背景技术：

山萘酚属于黄酮类化合物，分子式为C15H10O6，分子量为286.23。山萘酚广泛存在于多种植物中，具有抗氧化、抗炎症、抗癌等多种细胞保护功能。(1)抗氧化作用：山奈酚具有抑制AGE(Advanced glycation endproducts)形成和消除自由基功能，在预防细胞内酯类及DNA氧化损伤等方面具有较强抗氧化作用；(2)抗炎症作用：山萘酚作用于血管上皮细胞即表现出明显的抗炎症作用，效果强于其结构类似物槲皮素；研究还发现，人类口服低剂量山萘酚较槲皮素更易于吸收。山萘酚还能有效抑制一氧化氮生成，下调炎症反应中iNOS、TNF-a、NF-kB等因子的表达，从而有助于保护大脑，预防缺血性中风导致的脑损伤以及其它慢性炎症疾病；(3)抗癌作用：山萘酚通过激活前凋亡因子、抗肿瘤细胞增殖和生长等作用，能够诱导肿瘤细胞凋亡并降低各种癌症如肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌等的发病率。随着对山萘酚作用机理的深入研究，逐步发现山萘酚在预防动脉粥样硬化和糖尿病、抗衰老、抗微生物感染等方面具有特殊功效。而且山萘酚也是银杏叶提取物(GBE)重要的功能性化合物，也是其质量控制的标志性化合物之一。

目前山萘酚主要从桑叶、银杏等植物中通过提取制备，但其在植物中含量很低，因此通过提取分离手段制备难度大、产率低、成本高，且受植物分布、种类等因素限制(中国发明专利ZL200610152524.6)。由此可见，如何有效获取山萘酚是值得我们去深入研究的重大科技问题，解决这一问题，无疑对人类疾病的预防和治疗具有重要意义。柚皮素是山萘酚的前体化合物，植物通过合成途径关键酶黄烷酮3-羟化酶(F3H)催化柚皮素生成二氢山萘酚，二氢山萘酚再通过黄酮醇合成酶(FLS)的催化生成山萘酚。但目前报道的催化柚皮素生成山萘酚的产量还很低。分析可能的原因是：(1)黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)催化能力还有待提高，需要筛选催化效率更高的基因源；(2)F3H和FLS的催化能力不匹配，容易造成二氢山萘酚的积累。

由此可见，获得催化性能优异的黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)是高效催化柚皮素制备山萘酚的关键因素之一。但目前只有有限的几个基因已经克隆、表达并定性，因此我们无法通过文献报道获得催化性能优异的酶基因。本研究主要通过组合筛选策略对不同来源的黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)基因进行了筛选，获得了最佳组合。另一方面，融合酶技术也被广泛应用异源合成途径的构建，通过融合酶技术可有效降低中间产物的生成，并能大幅提高目标产物的产量。但融合酶技术需要通过合适的连接肽才能使融合酶正确折叠，发挥催化作用。因此本研究另一方面的工作是对合适的连接肽进行筛选，获得最有利于融合酶发挥催化功能的连接肽。最终使融合酶能有效减少中间产物二氢山萘酚的产生，从而解除了中间产物对菌体生长的影响，实现了山萘酚的高效合成。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供了一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用，携带该融合酶基因的重组菌能高效转化柚皮素制备山萘酚。

技术方案:一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

催化柚皮素生成山萘酚的融合酶，连接肽为TPTPTPTP。

编码上述融合酶的基因，核酸序列如SEQ ID NO:10所示。

含有上述核苷酸序列的重组质粒。

含有上述重组质粒的大肠杆菌。

上述融合酶在催化柚皮素生成山萘酚中的应用。

上述大肠杆菌在催化柚皮素生成山萘酚中的应用。

上述应用的步骤为：将大肠杆菌在50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上经过37℃培养过夜，挑转化子到150mL的LB培养基中，所述LB培养基内含有50μg/mL氨苄青霉素，37℃，200rpm振荡培养20h，将种子液接入3L发酵培养基中，37℃，并控制流加速度，使菌体浓度达到OD600 50–55，随后添加终浓度为0.1mM IPTG，并每隔1h添加终浓度为400mg/L的柚皮素，30℃转化培养9h，在转化过程中培养基葡萄糖浓度小于5g/L。

有益效果：1.通过组合筛选策略获得能有效催化柚皮素生成山萘酚的黄烷酮3-羟化酶(PeF3H)和黄酮醇合成酶(CuFLS)，是目前报道的最佳组合。

2.通过连接肽的筛选，获得了能适合PeF3H和CuFLS功能化融合的连接肽TPTPTPTP，通过该连接肽构建的融合酶(F69)能高效催化柚皮素生成山萘酚。

3.携带该融合酶(F69)的重组菌BL21-F69，通过高密度发酵，山萘酚的产量达到1010.2mg/L，是目前报道最高产量的17倍。

附图说明

图1为不同连接肽对融合酶转化柚皮素生成山萘酚的影响图；

图2为诱导温度、诱导菌浓度及IPTG浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响图，其中a为温度影响，b为诱导菌浓度影响，c为IPTG浓度影响；

图3为添加不同碳源对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响图；

图4为底物浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响图；

图5为高密度培养重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚图。

具体实施方式

以下实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。

实施例1

1.黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)的筛选

1.1黄烷酮3-羟化酶(F3H)和黄酮醇合成酶(FLS)基因的优化合成

对Populus eupnratica，Citrus sinensis和Ginko biloba来源的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因(XP_011043194.1，NP_001275816.1，AAU93347.1)按照大肠杆菌K12优势密码子表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的酶基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并在基因的N端和C端分别添加Nco I和BamH I酶切位点，获得优化后的黄烷酮3-羟化酶基因，分别命名为：Pef3h，Cisf3h，Gbf3h。其核酸序列分别为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

对Citrus unshiu，Cameuia sinensis和Fagopyrum tataricum来源的黄酮醇合成酶(FLS)基因(BAA36554.1，ABM88786.1，AEC33116.1)，按照大肠杆菌K12优势密码子表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对上述基因序列进行优化，选择氨基酸同义密码子使用频率高的密码子作为优势密码子，最终获得优化后的酶基因序列信息，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并在基因的N端和C端分别添加Nco I和BamH I酶切位点，获得优化后的黄酮醇合成酶基因，分别命名为：Cufls，Csfls，Ftfls。其核酸序列分别为SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

1.2重组质粒构建

1.2.1重组质粒pETDuet-PeF3H，pETDuet-CisF3H和pETDuet-GbF3H的构建

将优化合成的基因Pef3h，Cisf3h和Gbf3h分别用Nco I和BamH I双酶切，同时将重组质粒pETDuet-1也用Nco I和BamH I双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-PeF3H，pETDuet-CisF3H和pETDuet-GbF3H。

1.2.2重组质粒pACYCDuet-CuFLS，pACYCDuet-CsFLS和pACYCDuet-FtFLS的构建

将优化合成的基因Cufls，Csfls和Ftfls分别用Nco I和BamH I双酶切，同时将重组质粒pACYCDuet-1也用Nco I和BamH I双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pACYCDuet-CuFLS，pACYCDuet-CsFLS和pACYCDuet-FtFLS。

1.3重组菌的获得

将重组质粒pETDuet-PeF3H(A)，pETDuet-CisF3H(B)及pETDuet-GbF3H(C)和pACYCDuet-CuFLS(1)，pACYCDuet-CsFLS(2)及pACYCDuet-FtFLS(3)分别共转化大肠杆菌BL21(DE3)，共获得9个重组子，分别命名为BL21-A1(携带pETDuet-PeF3H和pACYCDuet-CuFLS)，BL21-A2(携带pETDuet-PeF3H和pACYCDuet-CsFLS)，BL21-A3(携带pETDuet-PeF3H和pACYCDuet-FtFLS)，BL21-B1(携带pETDuet-CisF3H和pACYCDuet-CuFLS)，BL21-B2(携带pETDuet-CisF3H和pACYCDuet-CsFLS)，BL21-B3(携带pETDuet-CisF3H和pACYCDuet-FtFLS)，BL21-C1(携带pETDuet-GbF3H和pACYCDuet-CuFLS)，BL21-C2(携带pETDuet-GbF3H和pACYCDuet-CsFLS)，BL21-C3(携带pETDuet-GbF3H和pACYCDuet-FtFLS)。

1.4重组菌转化柚皮素生成山奈酚的比较

分别将上述重组菌(BL21-A1，BL21-A2，BL21-A3，BL21-B1，BL21-B2，BL21-B3，BL21-C1，BL21-C2，BL21-C3)在含有氨苄青霉素(50μg/mL)和氯霉素(35μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到10mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素和35μg/mL氯霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，和100mg/L或者400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。柚皮素、二氢山萘酚及山萘酚的测定采用HPLC方法测定，HPLC测定的条件为：Agilent 1260Infinity；DAD检测器检测波长为280及368nm，柱温为40℃，流动相流速为0.8mL/min(A:甲醇，B:1％甲酸水＝55：45，15min)。结果表明含有重组菌BL21-A1的转化能力最强(表1)。

表1重组菌转化柚皮素生成山奈酚的比较

2.融合酶的构建及筛选

2.1重组质粒的构建

由上述实验结果可以发现Pef3h和Cufls的基因组合效果最佳，能有效催化柚皮素生成山萘酚。因此随后融合酶的构建以Pef3h和Cufls为基因源进行相关实验。连接肽对融合酶的构建至关重要，因为融合酶能否正确折叠发挥催化功能与连接肽密切相关，本研究共对6种连接肽进行了筛选，并分别构建了6种融合酶，分别为：PeF3H-GGGGS-CuFLS(F66)，PeF3H-(GGGGS)2-CuFLS(F67)，PeF3H-TPTP-CuFLS(F68)，PeF3H-(TPTP)2-CuFLS(F69)，PeF3H-EAAAK-CuFLS(F70)和PeF3H-(EAAAK)2-CuFLS(F71)。其核酸序列分别为SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。相关的质粒构建如下所述。

2.1.1重组质粒pETDuet-f66，pETDuet-f67，pETDuet-f68，pETDuet-f69，pETDuet-f70和pETDuet-f71的构建

以pETDuet-PeF3H为模板，并以SEQ ID NO:1为基础设计去除终止密码子的引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物为PeF3H-f1：CCCCCATGGCTCCTAGTACACTGAC，PeF3H-f2：CCCGGATCCTGCCAGAATT TCTTCGATAG，下划线表示酶切位点。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到基因和pETDuet-1分别用Nco I和BamH I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-PeF3H-f。

以pACYCDuet-CuFLS为模板，并以SEQ ID NO:4为基础设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物为CuFLS-f1：CCCGGATCCATGGAGGTTGAACGTGTTCA，CuFLS-f2：CCCAAGCTTTTACTGCGGCAGTTTGTTCAGTT，下划线表示酶切位点。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，1min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到基因和pETDuet-PeF3H-f分别用BamH I和Hind III进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS。

以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F66：ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f66。

以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F67：ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f67。

以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F68：ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f68。

以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F69：ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f69。

以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F70：ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f70。

以重组质粒pETDuet-PeF3H-f-CuFLS为模板，以UP：TGCCAGAATTTCTTCGATAGGTTTG和F71：ATGGAGGTTGAACGTGTTCAGGCGA为引物，斜体加粗表示连接肽。通过反向PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；35次循环(94℃，50s；51℃，90s；72℃，6min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。将获得的片段直接16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得重组质粒pETDuet-f71。

2.1融合酶转化效果的评价

将重组质粒pETDuet-f66，pETDuet-f67，pETDuet-f68，pETDuet-f69，pETDuet-f70和pETDuet-f71转化大肠杆菌BL21(DE3)，共获得6个重组子，分别命名为：BL21-F66，BL21-F67，BL21-F68，BL21-F69，BL21-F70和BL21-F71。

分别将上述重组菌(BL21-F66，BL21-F67，BL21-F68，BL21-F69，BL21-F70和BL21-F71)在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到10mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。柚皮素、二氢山萘酚及山萘酚的测定采用HPLC方法测定，HPLC测定的条件为：Agilent 1260Infinity；DAD检测器检测波长为280及368nm，柱温为40℃，流动相流速为0.8mL/min(A:甲醇，B:1％甲酸水＝55：45，15min)。结果表明含有重组菌BL21-F69的转化能力最强，山萘酚的产量131.9±9.3mg/L。(图1)。

3.重组菌BL21-F69转化条件的优化

3.1溶氧对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响

将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并分别用硅胶塞(低氧)和8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69用8层纱布(高氧)培养的山萘酚产量为170.7mg/L，远高于用硅胶塞(低氧)培养的130.6mg/L(表2)。由此可见，氧供应对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚至关重要。

表2溶氧对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响

3.1诱导温度、诱导菌浓及IPTG浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响

将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.2mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，并分别16，20，25，30或37℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69在30℃转化条件下山萘酚的产量最高(图2a)。

将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度分别为0.02，0.05，0.1，0.2或0.4mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69在IPTG浓度为0.1mM转化条件下，山萘酚的产量最高(图2b)。

将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.5，0.8，1.2，1.6，2.0时，加入终浓度为0.1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现重组菌BL21-F69在OD600为0.8时开始转化，此时山萘酚的产量最高(图2c)。

3.3添加不同碳源对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响

将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度为0.1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，400mg/L的柚皮素，不同种类及浓度的碳源(0.5％葡萄糖，2％葡萄糖，0.5％果糖，2％果糖，0.5％甘油，2％甘油)30℃转化24h。结果发现添加0.5％甘油，重组菌BL21-F69转化柚皮素生成山萘酚的产量最高，达到196.5mg/L(图3)。

3.4底物浓度对重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚的影响

将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到5mL的LB培养基试管中(50μg/mL氨苄青霉素)，并用8层纱布(高氧)隔绝培养，37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.8时，加入终浓度为0.1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，0.5％甘油，并分别加入100，400，800，1600mg/L的柚皮素，30℃转化24h。结果发现底物浓度为800mg/L，重组菌BL21-F69转化柚皮素生成山萘酚的产量最高，达到246.4mg/L(图4)。

4.高密度培养重组菌BL21-F69转化柚皮素制备山萘酚

种子培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。

发酵培养基：4.2g/L NaH2PO4·2H2O，8.7g/L K2HPO4·3H2O，50.0g/L酵母粉，30g/L葡萄糖，5.5g/L(NH4)2SO4，2.5g/L MgSO4·7H2O，1.1g/L EDTA，1mL/L生物素，0.3g/L消泡剂。

流加培养基：12.6g/L NaH2PO4·2H2O，26.0g/L K2HPO4·3H2O，200g/L酵母粉，16.5g/L(NH4)2SO4，20g/L MgSO4·7H2O，3.3g/L EDTA，3mL/L生物素，0.3g/L foam，800g/L葡萄糖。

发酵条件：发酵pH控制7.0，前期温度控制在37℃，诱导转化温度控制在30℃，在发酵过程中，培养基中葡萄糖的浓度控制在小于5g/L，溶氧控制在大于15％。

将重组菌BL21-F69在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上经过37℃培养过夜，挑转化子到150mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养20h。将种子液接入3L发酵培养基中，37℃，并控制流加速度，使菌体浓度达到OD600 50–55左右。随后添加终浓度为0.1mM的IPTG，并每隔1h添加终浓度为400mg/L的柚皮素，30℃转化培养9h，在转化过程主要通过控制培养基葡萄糖浓度小于5g/L，来控制乙酸的积累对重组菌的毒害。最终重组菌转化柚皮素生成山萘酚的产量达到1010.2mg/L(图5)。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种催化柚皮素生成山萘酚的融合酶及其应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctccta gtacactgac ggccttagcc ggcgaaaaaa ccctgaatcc gagctttgtt 60

cgttttcagg atgaacgtcc taaagttgcg tataatgagt tcagcaacga gattccagtt 120

attagcttag cgggcatcga tgatgtgggc ggtaaacgcg ccgaaatctg caagaagatt 180

gtggaagcct gtgaagattg gggtatcttt caggttgtgg atcatggtgt tgatgccaaa 240

ctgatctcag atatgacacg tctggctacg gaatttttcg ctctgcctcc ggaagaaaaa 300

ctgaaatttg atatgagcgg cggcaaaaaa ggcggcttta ttgtgtcaag tcacctacag 360

ggtgaagttg ttaaagattg gcgcgaaatc gtgacatatt tttcttttcc taaacagtca 420

cgcgattatt ctcgctggcc agataaaccg gaaggttgga tggaagtgac caaagaatat 480

agtgataaac tgatgggtgt tgcatgtaaa ctgctggaag ttctgtcaga agctatgggc 540

ttagaaaaag aagccctgac caaggcctgc gttgatatgg atcagaaaat cgtggttaat 600

tattatccta aatgtccaca gccggacctg acactgggcc tgaaacgcca taccgatccg 660

ggaactatta cgctgctgtt acaggatcag gttggcggtt tgcaagctac caaagataat 720

ggcaaaacgt ggattacggt gcagccgatc gaaggtgcgt ttgtggttaa tctgggggat 780

catggtcatt atctgtctaa tggtcgcttt aaaaatgccg atcatcaggc agtggttaat 840

agcaatagta gtcgcctgtc tattgccacc tttcagaatc cagcaccgga agcgaccgtg 900

tatccgctga aaattcgcga aggcgaaaaa ccagtgctgg aagaacctat cccgtttagc 960

gaaatgtatc gtcgcaaaat gagtaaagac ctcgaactgg cccgcctgaa aaaactggcc 1020

aatgagaaaa agcagtatag tgaaaaagct aaattagatg ccaaacctat cgaagaaatt 1080

ctggcataa 1089

<210> 2

<211> 1092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcaccga gtaccctgac ggccttagca gagaagaaaa cattacaggc aagttttgtg 60

cgcgatgaag atgaacgtcc taaagttgca tataatcagt tttctaacga gattccagtt 120

atctctattg cgggcatcga tgatggcggt gaaaaacgcg ccgaaatctg caacaaaatc 180

gttgaggcct gcgaagaatg gggcgtgttt cagattgttg atcatggcgt tgatgccaaa 240

ttagtgagcg agatgaaaac actggccaaa gaatttttcg ccctgcctcc ggaagataaa 300

ttacgctttg atatgagcgg cggcaaaaaa ggcggcttta ttgtgtcaag tcatctacag 360

ggtgaagccg ttcaggattg gcgcgaaatc gtgacgttct ttagctatcc tattcgtacc 420

cgcgattata gtcgttggcc agataaaccg gaagcgtgga aagcagtgac ggaagaatat 480

tcaaagaaac tgatggaatt agcctgtaaa ctgctgggtg tgctgagcga agctatgggc 540

ttagaaacgg aagcgctgac caaagcgtgc gttgatatgg atcagaaagt ggttgttaat 600

ttttatccta aatgtccgca gccggatctg accttaggtc tgaaacgtca taccgatccg 660

ggaactatca cgctgttact acaagatacg gtgggcggtt tacaggctac gagagataat 720

ggcaaaacgt ggattacggt tcagcctgtg gaaggtgcat ttgtggttaa tctcggcgat 780

catggtcatt acttgagtaa tggtcgcttt cgcaatgccg atcatcaggc cgtggttaat 840

agcaatagtt ctcgcctgag tattgctaca tttcagaatc cagctccaga tgctacagtg 900

tatcctctga aaatccgcga aggtgaaaaa tctgtgttag atgaacctat cacctttgcc 960

gaaatgtatc gtcgcaaaat gtctaaagac atagaaatcg ccaagaagaa gaaactggcc 1020

aaagaacagc aggttaaaga actggaaaca gttaaactgg aaaccaaacc tatcgaagaa 1080

attctggcat aa 1092

<210> 3

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctccag tgcagagcgt gagtgccgca ccggttccta aatttctgcc gacggaaaac 60

gaggccaaag tgttacagtc tatctttgtt cgtgatgaag atgaacgtcc taaagttgcg 120

tataacgaat tttctaaaga aatcccgatt atctctctgg ccggtatgga aggcgaagaa 180

cgcggtcgcg ttcgcgaaga agttcgtgcc gcttgtgaag aatggggcat ctttcaggtg 240

ttacatcatg gtgttccgag cgacctcgtt catcgcatgt cacagctgtc tcgtagcttc 300

ttcgccctgc ctagccatga aaaactgaaa tttgatatga cgggcggcaa acgcggcggc 360

tttgttgtga gtagtcatct ccagggcgaa agcgtgttag attggcgcga aatctttact 420

tattttagct atccgctgcg ctctcgtgat tatagtcgtt ggcctcagaa tcctgatggt 480

tggcgcgaag tggttgaaga atatagtcag gaactgatga aactggcttg caaactgtta 540

gaaattatta gcgaatctct gggcttagaa ccacaggcag tgaccaaagc atgtttagat 600

atggatcaga aagttgtgat caatttttat cctaaatgtc cacagccgga tatgacctta 660

ggtctgaaac gtcataccga tccggggaca atcaccttac tgttacagga tcaggtgggt 720

ggtctgcaag ctaccaaaga tggcctgaat tggattaccg tggaaccagt tgaaggcgcc 780

tttgtggtta atctgggaga ccacatgcat tatctaagca atggtaaata taagaatgcg 840

gatcatcagg ccgtggttaa tgctgatacc tcacgcctgt ctatcgctac gtttcagaat 900

ccagcccagg aagccattgt gtatccgctg gaaggtgtgg ttaaagcgga agataaatgc 960

gttatggaag aacctattac gtttgctcag atgtattcac ataagatgaa tcgcgatctg 1020

gaattagcac gccagaaaaa actggccaaa ttgcagcagg atgaaagtaa ataa 1074

<210> 4

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaggttg aacgtgttca ggcgattgcg tctctgtccc actctaacgg tactattccg 60

gcggagttca ttcgcccgga aaaagaacag ccggcatcta ccacctatca tggtccggca 120

ccggagatcc cgaccattga tctggatgat ccggttcagg accgtctggt tcgttctatc 180

gcggaagcgt ctcgtgaatg gggtatcttc caggtgacca accacggtat cccgtctgac 240

ctgatctgta agctgcaggc ggttggtaaa gagtttttcg agctgccgca ggaagagaag 300

gaggtttact ctcgtccggc tgacgcgaaa gacgttcagg gttacggcac taaactgcag 360

aaggaagttg aaggtaaaaa gtcttgggtt gaccacctgt tccaccgtgt gtggccgccg 420

agctctatta actaccgctt ctggccgaag aacccgccgt cctatcgtgc ggttaacgaa 480

gaatacgcga agtatatgcg tgaagttgtt gataaactgt tcacctacct gtccctgggc 540

ctgggtgtgg aaggtggtgt tctgaaagag gctgctggcg gcgacgacat cgaatacatg 600

ctgaaaatca actactatcc gccgtgcccg cgtccggatc tggcgctggg cgttgtggcg 660

cacaccgacc tgtctgcgct gaccgtgctg gttccgaacg aagttccggg tctgcaggtt 720

tttaaggatg accgctggat cgacgcaaaa tacatcccga acgcgctggt tatccacatc 780

ggcgaccaga tcgaaattct gagcaacggt aagtacaagg cagtgctgca tcgtaccacc 840

gttaacaagg ataagactcg tatgtcttgg ccggtgtttc tggaaccgcc ggcagatact 900

gttgttggtc cgctgccgca gctggttgac gatgaaaacc cgccgaaata caaagcgaaa 960

aagttcaagg actactctta ctgcaaactg aacaaactgc cgcagtaa 1008

<210> 5

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggaagtgg agcgtgttca ggccctgtca catgtgacct tacatgaatt accggccaag 60

ttcattcgtc cagttcatga acagccggaa aatagtaaag ctatcgaagg cgtgacggtt 120

cctgttatct ctctgagtca gccgcatgat gttgtggtgg atgcgttaag caaggcctgt 180

agcgaatggg gcttcttcct gattacggat catggtgtgg aaccgtcact gattggtcgc 240

ctgaaagaag ttggcgaaga atttttcaat ctgccgcaga aagaaaaaga atcttatgct 300

aatgatccga gtagcggtag ctttgaaggc tatggcacca aaatgaccaa aaattttgat 360

gaaaaagtgg agtggatcga ttattatttt catgttatgc atcctcctaa aaaactgaac 420

ctggatatgt ggcctaaaaa tccgagtagc tatcgcggcg tgacggaaga atataatgtt 480

gaaatcatgc gcacgaccaa taagctgttt gaactgctga gcgaaggctt aggtttagat 540

ggcaaagtgc tgtcttctag tctgggcggc gatgaaatcg aatttgagat gaaaatcaat 600

atgtatcctc cgtgtccaca gccacagctg gcattaggcg ttgaacctca tacagatatg 660

agcgccttaa ccctgttagt tcctaatgat gttccaggtc ttcaggtgtg gaaagatggc 720

aattgggttg cagttaatta tctgcctaat gcgctgtttg tgcatgtggg cgatcagtta 780

gaagtgctga gcaatggtaa atataagtca gtgctgcatc gctcactggt taacaaggaa 840

cgtacacgga tgtcttgggc cgtgtttgtt gtgccacctc atgaagccgt cattggtcca 900

ttaccggaac tgatcgatga aaagaatcca gccaaatata gtaccaaaac gtatgccgaa 960

tatcgccatc gaaaattcaa taagatcccg cagtaa 996

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atggaagttg agcgggttca ggctattgcg accctgtcgc gcagcgtgga taccattcct 60

ttagaatata ttcgtagcga aaaagaacag cctgccatta cgacctttca gggtagcgtg 120

ctggaagtgc cagccatcga cattaacgag tctaacgaaa cgagcttagt tgaatctatc 180

aaaaaagcga gtgaagaatg gggcctgttt caggtggtta atcatggtat cccgatcgaa 240

gtgatctcac acttgcagcg cgttggcaaa gagttctttg aactgccgat cgaagaaaaa 300

gaagaatatg ctaaaccgga aggcagtaaa gatgtggaag gctatggtac aaaattacaa 360

aaagaagtgg aaggcaaaaa aggctgggtt gatcatctgt ttcatcgcat ttggccgcct 420

agtgctatca attataagtt ttggcctaaa aatcctacct cttacaaaga agccaacgag 480

gaatattgta aatgcttacg cggcgttgcc gaaaaaatct ttcgctgtat gagtctgggc 540

ttaggtctgg aaggtccgga actgatggaa gcagcgggcg gcgatagctt agaatacctc 600

ctgaaaatta attattatcc accgtgtcca cgtccggact tggctctggg cgttgttgca 660

catacagata tgagtacgct gaccatctta gttcctaatg aggttccagg tttacaggtg 720

tttcgtgatg gtctgtggta tgatgttaaa tatattccta atgcgctgat tgtgcatgtg 780

ggggatcagt tagaaatcat gagcaatggc aaatataagg cagttctgca tcgcacgacg 840

gttaacaaag aaaaagtgcg catgtcttgg ccggtgtttc tggaacctcc cgctgaacat 900

gtgttaggtc cacatccgaa aattgtggat gatcgtaatc cagccaaata caagaccaaa 960

aaatatggcg attatatgta ttgcaaactg aataagctgc ctcagtaa 1008

<210> 7

<211> 2109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7