一种稳定的液体纳他霉素的生产制备工艺的制作方法

本发明涉及一种稳定的液体纳他霉素的生产制备工艺，属于生物工程领域。

背景技术：

近年来，随着人们生活和消费水平的提高，人工合成化学防腐剂的弊端日益受到食品界及广大社会的重视；食品加工的需求也越来越向“绿色”和“天然”的方向转变，因此，天然、安全的功能性食品防腐剂的研究开发，就成为当前食品防腐保鲜领域的必要。目前，当今社会对于食品安全问题的关注热度逐年升高。防腐保鲜也成为了研究的热门项目之一。在这一领域中，添加食品防腐剂成为重要的手段之一，天然食品防腐剂以其抗菌性强、天然、水溶性好，安全无毒等诸多优点已成为世界防腐剂开发的主要方向之一。纳他霉素作为一种天然的食品防腐剂，能有效地抑制和杀死霉菌、酵母菌、丝状真菌，从而有效的降低强致病性真菌毒素对人类的侵害，同时延长食品的货架期，减少浪费。

纳他霉素也称匹马霉素、游链霉素，是一种天然的二十六元多烯大环内酯类抗真菌剂，由纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌等经过发酵、提取、精制而成的一种次级代谢产物，其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯苯甲酰胺，难溶于大部分的有机溶剂。纳他霉素在食品中的使用剂量低，很难被人体消化道吸收，对人体无致癌、致畸、致突变和致敏作用。同时纳他霉素溶解度很低，既不会影响食品中的其他成分，也不会影响食品风味，其作为一种天然、广谱、高效、安全的食品防腐剂。

然而，纳他霉素在水中的溶解度非常小，若将纳他霉素悬浮在水溶液中会导致不溶解的晶体颗粒沉降在溶液底部，无法充分得到利用，因此，需要研发溶解度更高、稳定性更好的纳他霉素制品。

技术实现要素：

本发明正是针对上述纳他霉素的现有产品的应用缺点，对工艺进行改进和创新。提供一种稳定的液体纳他霉素的生产制备工艺。本发明改进了纳他霉素发酵产生工艺，所获得的纳他霉素晶体从片状晶体(晶体大小150um-200um以上)变成20um以下的微小型晶体，从而使纳他霉素稳定的悬浮于水溶液中。且发酵液经过分离纯化提取过程中，纯度达到90％以上。本发明方法制备的纳他霉素几乎无降解、不发生沉淀分层，可以直接使用，无需搅拌等其他措施。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是，一种稳定的液体纳他霉素的生产制备工艺，包括以下步骤：

(1)发酵生产晶体20um以下的微小型纳他霉素；

(2)纳他霉素发酵液经过酶解预处理4-8小时；

(3)将步骤(2)酶解后发酵液洗涤，收集得到微小型纳他霉素浆料；

(4)将洗涤好的浆料与纯化水1:1搅拌均匀，形成液体纳他霉素；由于晶体长度小可以稳定的悬浮于水中；

(5)在液体纳他霉素中加入0.2％-2％的食用胶，继续搅拌使其充分溶解，这样便得到极其稳定的液体纳他霉素。

所述步骤(1)，发酵培养基组成：酵母蛋白胨25-35g/l，葡萄糖70-100g/l，nacl1-3g/l，mgso40.5-2g/l，ph7.3-7.6，115-121℃灭菌20-30min。接种褐黄孢链霉菌，接种量控制5-10％。

发酵过程参数控制为：初始ph7.3-7.6，过程控制ph5.8-6.2；初始通气量18-22m³/min，15小时后25-30m³/min，100小时后16-20m³/min；初始搅拌转速50-60rpm/min，8-15小时70-80rpm/min，15小时后100-120rpm/min；温度控制28-32℃。

发酵过程工艺控制为：发酵30-60小时，添加硫酸锌0.02％-1％，硫酸锰0.01-0.05％，发酵60-80小时，添加乙酸钠0.05-0.2％，丙酸钠0.1-0.2％。上述添加量均为质量体积百分比。

步骤(1)中发酵生成的微小型纳他霉素晶体，以细棒状形态存在，其中长度20um以下的占95％以上。

步骤(2)中所述纳他霉素发酵液的酶解预处理为：酶添加量0.1-0.3‰，升温至50℃～55℃保温4-8h，有机大分子物质酶解生成小分子。

所使用的酶为胰蛋白酶、动物蛋白水解酶、脂肪酶、溶菌酶中的一种或几种，优选地，为动物蛋白水解酶，或动物蛋白水解酶和胰蛋白酶按照1:1～2:1比例混合。

步骤(3)中所述发酵液洗涤方式为：将离心浆料加入纯化水进行洗涤，初次加入水的体积与浆料的体积比为1:5，搅拌1～2h后，停止搅拌静置将上层水抽走；再将沉淀加入水洗涤，再次加入水的体积与浆料的体积为1:3，搅拌1～2h后，停止搅拌静止后抽走上层水。将洗涤好的浆料与纯化水1:1搅拌均匀，得到纳他霉素溶液。

所述食用胶为黄原胶、海藻酸钠、卡拉胶中的一种或几种。

由于常规的纳他霉素难以溶解，且使用溶解体系不易混合均匀、稳定性差是由纳他霉素本身物理化学特性，属于纳他霉素应用过程中难以解决的一个关键性问题。本发明基于纳他霉素的现有产品的应用缺点，对工艺进行改进和创新。

首先，本发明从原有生产纳他霉素的基础上出发，改变发酵过程中参数及工艺控制，发酵产生的晶体从片状晶体(晶体大小150um-200um以上)变成20um以下的微小型晶体。本发明发酵过程中通过二价金属离子的加入，增强菌体代谢过程中的酶活，加速次级代谢过程的进行，晶体生成速度加快，细小晶核同时生成较多，浓度相对较大，因此晶体来不及生长，更容易生成微小型纳他霉素晶体。发酵过程中，根据菌体生长及产物合成需要，在菌体进行次级代谢产物合成时，提高通气量及搅拌转速，一方面提高菌体生长速率，另一方面，为次级代谢产物的合成提供更有利的条件，搅拌转速的提高，使搅拌力度加强，也促使晶体向微小型晶体发展。在发酵后期，添加前体物质，为次级代谢产物的合成提供充足的前体，提高产物合成量。使最终发酵产生的纳他霉素晶体均为细棒状，长度20um以下，粒径5um以下的占95％以上。

其次，发酵液分离纯化提取过程中，通过探索使用不同种类酶及酶的使用量，将有机大分子物质分解生成可溶的小分子物质，通过高速离心洗涤等方式分离提纯得到微小型纳他霉素，纯度达到90％以上，并维持原有晶型不变。本发明以酶解的方法代替原有有机溶剂提取方法，酶解后的发酵液大分子物质被降解，更易于发酵液的分离纯化，得到高纯度纳他霉素，降低生产过程中的损失，减少对环境的污染，分离提纯过程中没有化学变化的产生，因而可维持原有晶型不变。

最后，在稳定的体系中加入0.2％-2％的食用胶，进而增加体系的稳定性，可长时间保存。因此，纳他霉素几乎无降解、不发生沉淀分层，可以直接使用。

因此，本发明具备突出优点是：

(1)纳他霉素经发酵、纯化处理可以直接得到稳定的液体纳他霉素，该过程不使用任何的有机溶剂，安全绿色。

(2)发酵产生的纳他霉素晶体从片状晶体(晶体大小150um-200um以上)变成20um以下的微小型晶体，纯度达到90％以上。

(3)本发明方法以单一食用级别的原料形成的高效、稳定的液体纳他霉素，纳他霉素几乎无降解、不发生沉淀分层。且生产工艺简单、能耗低、绿色无污染。

(4)本发明方法制备的纳他霉素溶液抑菌效果更好，在实际使用中，使用量更少，因此可减少纳他霉素的使用量。且本发明为液体制剂，使用也更方便。

附图说明

图1为常规纳他霉素和微小型纳他霉素晶体对比。其中a为常规纳他霉素晶体，大小150um-200um。b为晶体粒径20um占95％以上的纳他霉素。

图2为实验1常规方法制得的液体纳他霉素不同时间的沉降结果。

图3为实验2本发明方法制得的液体纳他霉素不同时间的沉降结果。

图4为实验3本发明方法制得的液体纳他霉素添加食用胶后不同时间的沉降结果。

图5为不同工艺制得的液体纳他霉素涂在面包上对霉菌的抑制情况对比。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例1

1t发酵罐，将液体纳他霉素生产所需培养基和水装入到发酵罐中，体积大约占发酵罐总体积的2/3。培养基组成：酵母蛋白胨25g/l，葡萄糖80g/l，nacl1g/l，mgso41g/l，ph7.3-7.6。密封罐口，打开蒸汽阀门，对发酵培养基进行灭菌，灭菌温度115～121℃，时间20～30min，灭菌完成后，夹层通冷却水进行降温，温度降到29～32℃。接种褐黄孢链霉菌，接种量5％。发酵初始ph7.5，过程控制6.0；初始通气18m3/min，15小时后28m3/min，100小时后18m³/min；初始搅拌转速50rpm/min，8-15小时75rpm/min，15小时后转速105rpm/min，发酵温度29℃。发酵33小时，添加硫酸锌0.04％，硫酸锰0.01％，发酵70小时，添加乙酸钠0.06％，丙酸钠0.1％。

发酵总时长120小时，结束后的发酵液，添加0.3‰的动物蛋白水解酶，50℃酶解预处理6小时，酶解过程停止搅拌。酶解结束后将酶解上清回收处理再利用，剩下的酶解沉淀经离心机进行离心，离心转速4000-8000rpm/min，将离心浆料加入水进行洗涤，初次加入水的体积与浆料的体积的5倍，搅拌1～2h后，停止搅拌静置将上层水抽走，再将沉淀加入水洗涤，加入水的体积与浆料的体积为1:3，搅拌1～2h后，停止搅拌静止后抽走上层水。将洗涤好的浆料与纯化水1:1搅拌均匀，由于晶体长度小可以稳定的悬浮于水中即可得到稳定性极高，形态细小针形的液体纳他霉素，最后加入1.5％的黄原胶继续搅拌均匀，即得到稳定的液体纳他霉素。

实施例2

10t发酵罐，将液体纳他霉素生产所需培养基和水装入到发酵罐中，体积大约占发酵罐总体积的2/3。培养基组成：酵母蛋白胨30g/l，葡萄糖90g/l，nacl2g/l，mgso42g/l，ph7.3-7.6。密封罐口，打开蒸汽阀门，对发酵培养基进行灭菌，灭菌温度115～121℃，时间20～30min，灭菌完成后，夹层通冷却水进行降温，温度降到29～32℃。接种褐黄孢链霉菌，接种量8％。发酵初始ph7.5，过程控制6.3；初始通气20m³/min，15小时后25m³/min，100小时后18m³/min；初始搅拌转速60rpm/min，8-15小时80rpm/min，15小时后转速120rpm/min，发酵温度30℃。发酵32小时，添加0.04％硫酸锌，0.01％硫酸锰，发酵65小时，添加0.06％乙酸钠，0.1％丙酸钠。

发酵总时长120小时，结束后的发酵液，添加0.2‰的动物蛋白水解酶和0.1‰的胰蛋白水解酶，55℃酶解预处理8小时，酶解过程停止搅拌。酶解结束后将酶解上清回收处理再利用，剩下的酶解沉淀经离心机进行离心，离心转速6000-8000rpm/min，将离心浆料加入水进行洗涤，初次加入水的体积与浆料的体积为1：5，搅拌1～2h后，停止搅拌静置将上层水抽走，再将沉淀加入水洗涤，加入水的体积与浆料的体积为1:2，搅拌1～2h后，停止搅拌静止后抽走上层水。将洗涤好的浆料与纯化水1:1搅拌均匀，由于晶体长度小可以稳定的悬浮于水中即可得到稳定性极高，形态细小针形的液体纳他霉素，最后加入2％的黄原胶继续搅拌均匀，即得到稳定的液体纳他霉素。

试验例1不同生产工艺制得的液体纳他霉素晶体形态及沉降实验

实验1.1t发酵罐培养基组成：酵母蛋白胨25g/l，葡萄糖80g/l，nacl1g/l，mgso41g/l，ph7.3-7.6，115-121℃灭菌20-30min。接种褐黄孢链霉菌，接种量5％。发酵初始ph7.5，过程控制6.0；通气20l/min，转速100rpm/min，发酵温度30℃。发酵结束后镜检观察晶体形态。如图1a所示，200um粒径占90％。

经纯化处理得到浆料与纯化水1:1搅拌均匀获得液体纳他霉素，观察放置不同时间沉降现象如图2，放置1天试管底部就有少量纳他霉素沉降，放置4天-7天试管底部纳他霉素几乎都沉降下来。

实验2.1t发酵罐培养基组成：酵母蛋白胨25g/l，葡萄糖80g/l，nacl1g/l，mgso41g/l，ph7.3-7.6，115-121℃灭菌20-30min。接种褐黄孢链霉菌，接种量5％。发酵初始ph7.5，过程控制6.0；初始通气18m³/min，15小时后28m³/min，100小时后18m³/min；初始搅拌转速50rpm/min，8-15小时75rpm/min，15小时后转速105rpm/min，发酵温度29℃。发酵32小时，添加0.04％硫酸锌，0.01％硫酸锰，发酵70小时，添加0.06％乙酸钠，0.1％丙酸钠。发酵结束后镜检观察晶体形态，如图1b所示，20um粒径占95％。

经纯化处理得到浆料与纯化水1:1搅拌均匀获得液体纳他霉素，观察放置不同时间沉降现象如图3。放置15天仍如最初的状态无任何沉降现象，继续观察到达60天时试管里的液体纳他霉素仍均一，稳定未发现沉降现象。

实验3.实验过程如上述实验2，得到液体纳他霉素后再加入1-2％黄原胶，搅拌均匀，与实验2对比发现加入黄原胶后液体纳他霉素的体系更加稳定，放置180天后仍未有沉淀生成(如图4所示)，因此用此工艺制备的液体纳他霉素更好的解决了纳他霉素在水中不溶的问题。

试验例2

在我们日常生活中，面包极易生霉，将上述实施例1制得的液体纳他霉素(含量约40g/l)质量分数稀释到0.3g/kg喷在烘焙食品切片面包的表面，然后将面包放置在30摄氏度的恒温恒湿培养箱中，放置不同时间，检测其中霉菌的数量。试验结果如图5所示，对照组使用常规工艺生产的纳他霉素，实验组使用与对照组同等浓度的本发明产品液体纳他霉素，可看出纳他霉素悬液组霉菌总数在30天内被明显抑制，相较于对照组抑制效果有显著的提高。原因是由于实验组所用本发明制得的液体纳他霉素大多都是微小细棒状，均一稳定，喷在面包的表面均匀，可以充分的被利用，从而抑菌效果也大大的提高不少。