本发明属于高通量测序领域，更具体地，涉及基于宫颈癌宿主细胞的甲基化检测方法。
背景技术：
宫颈癌是严重威胁女性健康的世界性恶性肿瘤。宫颈原位癌一般高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，但近年来发现宫颈癌发病年龄呈年轻化趋势。全球每年死于宫颈癌的女性有20多万例，其中85％发生在发展中国家。据统计，中国的宫颈癌发病率已居世界第二，成为中国女性的杀手之一，摧残数以万计的女性的健康，影响中国千万家庭的幸福生活。因此，如果能寻找出能够有效早期筛查宫颈癌前病变的检测方法，就可以在病变早期进行干预治疗，从而降低我国女性宫颈癌死亡率。
此前，宫颈癌早筛以液基薄层脱落细胞学检查(TCT)为主，但受取材及标本制作过程的影响，该法仍存在一定的假阳性率及假阴性率；此外，TCT检查缺乏组织结构，并不能作为最终的诊断依据。甲基化为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。正常人DNA序列中有很多富含CpG的区域，被称为CpG岛，通常这些区域是非甲基化的，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的，这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失，从而导致细胞的增殖失控形成恶性肿瘤细胞。因此，甲基化检测可用于癌症早期的辅助检测。
目前有关DNA异常甲基化对宫颈癌作用的研究取得了巨大出的进步，但现有的基于宫颈癌宿主细胞的甲基化检测方法主要为单个或者多个位点的标志物检测，其具有检测位点少，诊断准确率不高的缺陷，因此，采用高通量测序检测甲基化可以克服以上缺点。此外，宫颈癌宿主细胞的采样量与DNA提取量直接相关，从而决定了检测的成败，宫颈脱落细胞采样不可避免的出现采样量低的情况，从而导致无法进行甲基化检测。引起采样量低的原因主要是：1、由于操作人员采集操作不规范；2、受检者对采样的认知程度较低(经期间不可采集、检查前24～48h内避免性生活、盆浴、以及阴道冲洗和用药)；3、受检者炎症细胞太多(阴道炎)，导致取样量少；4、取材时会导致宫颈出血，无法进一步采样5、采样会带有分泌物，取到的白细胞和脓细胞较多，而宫颈脱落细胞较少。针对这些问题重新采样一方面延长了筛查时间(生理要求三个月后才能重新采样)，另一方面是有些受检者即使重采样仍然无法获得合格的采样量。因此，为了克服以上缺陷，针对采样量低的宫颈癌宿主细胞的甲基化检测，是提高早筛效率的关键。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种宫颈癌宿主细胞的甲基化测序方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种宫颈脱落细胞DNA的甲基化测序方法，包括如下步骤：
(1)提取宫颈脱落细胞的基因组DNA；
(2)将步骤(1)提取的DNA进行片段化、末端修复和3’端加A；
(3)将步骤(2)的产物与甲基化接头、T4连接酶和连接反应液反应，获得加接头的DNA片段，进行纯化；
(4)将步骤(3)的产物进行重亚硫酸盐处理并纯化，将DNA片段中未甲基化的C转化为U；
(5)将步骤(4)的产物进行PCR扩增、纯化，获得测序文库；
(6)将测序文库进行高通量测序，获得的测序数据进行生物信息学分析甲基化情况。
作为上述方法的优选，所述方法用于10ng及以上的基因组DNA。
作为上述方法的优选，所述方法用于10ng～25ng的基因组DNA。
作为上述方法的优选，步骤(3)中，连接反应液在反应体系中含有如下组分：Tris-HCl 50～100mM、MgCl2 10～20mM、ATP 0.5～1mM、二硫苏糖醇4～6mM、乙醇0.1～0.3mM、亚精胺0.1～0.2mM。
作为上述方法的优选，步骤(4)中，重亚硫酸盐处理并纯化采用EZ DNA Methylation-LightingTMKit试剂盒进行。
作为上述方法的优选，所述重亚硫酸盐处理是采用CT Conversion Reagent溶液对DNA片段进行处理，处理条件为95～98℃反应7～9min，53～55℃反应45～60min。
作为上述方法的优选，步骤(5)中，PCR扩增采用KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR Kit作为酶反应试剂。
作为上述方法的优选，所述纯化采用磁珠纯化法。
作为上述方法的优选，步骤(1)和/或步骤(5)后还可以进行DNA定量。
作为上述方法的优选，高通量测序采用illumina测序平台。
本发明的有益效果是：
在宫颈癌早筛中，宫颈脱落细胞采样量低时，提取的DNA量会出现低于100ng，甚至低于10ng的情况，达不到甲基化建库测序要求，使得难以快速再次获得的宫颈脱落细胞遭到浪费，且大大降低早筛效率。本发明方法能满足宫颈脱落细胞采样量低的要求，对DNA起始量为10ng的样本也可实现甲基化测序，并且检测准确率高，避免了低样本量的宫颈癌宿主细胞浪费。本发明方法在接头连接反应液、PCR扩增酶的优选、CT Conversion Reagent溶液处理时间上进行了创造性改进，实现了10ng灵敏度的微量甲基化建库测序。
具体实施方式
针对背景技术提到的问题，本发明提供一种宫颈脱落细胞DNA的甲基化测序方法，包括如下步骤：
(1)提取宫颈脱落细胞的基因组DNA；
(2)将步骤(1)提取的DNA进行片段化、末端修复和3’端加A；
(3)将步骤(2)的产物与甲基化接头、T4连接酶和连接反应液反应，获得加接头的DNA片段，进行纯化；
(4)将步骤(3)的产物进行重亚硫酸盐处理并纯化，将DNA片段中未甲基化的C转化为U；
(5)将步骤(4)的产物进行PCR扩增、纯化，获得测序文库；
(6)将测序文库进行高通量测序，获得的测序数据进行生物信息学分析甲基化情况。
作为上述方法的优选，所述方法用于10ng及以上的基因组DNA。
作为上述方法的优选，所述方法用于10ng～25ng的基因组DNA。
作为上述方法的优选，步骤(3)中，连接反应液在反应体系中含有如下组分：Tris-HCl 50～100mM、MgCl2 10～20mM、ATP 0.5～1mM、二硫苏糖醇4～6mM、乙醇0.1～0.3mM、亚精胺0.1～0.2mM；发明人通过对连接反应液进行探索，在常规反应液的基础上，增加了乙醇和亚精胺，并且经过合理配伍，获得的反应液能够增强连接酶的活性，大大的提高接头连接效率，从而使得构建的文库浓度提高，能够满足微量起始DNA的建库需求。
作为上述方法的优选，步骤(4)中，重亚硫酸盐处理并纯化采用EZ DNA Methylation-LightingTMKit试剂盒进行。
作为上述方法的优选，所述重亚硫酸盐处理是采用CT Conversion Reagent溶液对DNA片段进行处理，处理条件为95～98℃反应7～9min，53～55℃反应45～60min；发明人对现有试剂的程序进行优化，通过优化发现，降低CT Conversion Reagent溶液的处理时间，也能构建出满足测序条件的文库，并且更短的反应时间可以减少反应试剂对DNA片段的破坏，提高测序质量。
作为上述方法的优选，步骤(5)中，PCR扩增采用KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR Kit作为酶反应试剂。该试剂中的酶能识别到重硫酸盐处理转化后形成的尿嘧啶，减少或完全抑制其PCR的放大，可以减少非特异性扩增。
作为上述方法的优选，所述纯化采用磁珠纯化法。
作为上述方法的优选，步骤(1)和/或步骤(5)后还可以进行DNA定量。
作为上述方法的优选，高通量测序采用illumina测序平台。
下面结合具体实施例进一步解释本发明，但不局限于此。未特别注明的试剂和仪器均可在市面购买获得，未特别注明的实验方法、条件均按本领域常规技术或厂家建议操作。
实施例1
本实施例所用的10例宫颈脱落细胞由郑州大学第三附属医院提供，宫颈脱落细胞源自10例临床确诊的宫颈鳞癌患者。
1、提取宫颈脱落细胞的基因组DNA
将采集到的所有宫颈脱落细胞用DNA抽提试剂盒(QIAGEN公司)进行基因组DNA的提取，提取方法按厂家说明书，提取后的DNA采用Qubit3.0定量，结果如表1所示，可见10例宫颈脱落细胞的DNA提取量为9.5～4906ng，总DNA量小于100ng的2例，其中1例小于10ng。
表1、10例宫颈脱落细胞的基因组DNA提取量
2、DNA片段化、末端修复和3’端加A
1号样品按起始DNA量为1ng、10ng、25ng、100ng进行后续检测，10号样品全部用于检测。使用超声仪将上述样本的基因组DNA打断至测序所需的100～200bp的片段，将片段化DNA在无菌和无酶的反应管中进行末端修复和加A反应，反应体系如表2所示，反应条件为20℃反应30min，65℃反应30min。
表2、末端修复和3’端加A反应体系
3、加甲基化修饰的接头
将上一步反应产物与T4连接酶、甲基化接头、连接反应液混合，25℃反应15min，获得加接头的DNA片段；随后采用磁珠纯化。100μl加接头反应体系为：DNA片段修复加A产物50μl、T4连接酶(TaKaRa)5μl、甲基化接头(适于illumina)1μl、连接反应液(含有终浓度如下的组分：Tris-HCl 80mM、MgCl2 15mM、ATP 0.7mM、二硫苏糖醇5mM、乙醇0.2mM、亚精胺0.15mM。
4、重亚硫酸盐处理
采用EZ DNA Methylation-LightingTMKit中的试剂进行重亚硫酸盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，具体步骤如下：
(1)将上一步纯化后的DNA片段(20μl)加入130μl的CT Conversion Reagent溶液，混匀，均分成两管；
(2)在PCR反应仪中，98℃反应8min，54℃反应45min；
(3)向Zymo-SpinTMIC Column加入600μl的M-Binding Buffer，加入上一步反应产物，混匀；
(4)全速(≥10000xg)离心1min，去除流出液；
(5)加200μl的L-Desμlphonation Buffer至柱子中，室温孵育15～20min，全速离心1min；
(6)加200μl的M-Wash Buffer至柱子中，全速离心1min，重复1次；
(7)将柱子放入新离心管中，晾干，加12μl的M-Elution Buffer至柱基质中，全速离心1min，再将洗脱下来的溶液回加到柱基质中，全速离心1min。
5、PCR扩增与纯化
将重亚硫酸盐处理后的DNA片段(10μl)与测序通用引物(Universal Primer 2.5μl)、illumina接头引物(i5Index Primer 2.5μl)和KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR Kit(15μl)反应，扩增程序如表3所示，扩增完成后进行磁珠筛选与纯化，获得illumina测序文库。
表3、PCR扩增程序
6、测序与分析
采用illumina测序平台对文库进行上机测序，获得的下机数据进行质量过滤，合格的测序数据与人类参考基因组比对，获得甲基化检测结果，生物信息分析方法采用本领域常规技术。
表4、实施例1的建库质量和测序质量评估
本实施例的建库质量和测序质量评估如表4所示，以上结果可见，本方法的灵敏度可达10ng左右，建库起始DNA量为1ng时，文库最终DNA量低，无法完成后期测序。
对比例1、常规甲基化测序建库方法
将1号样品按1、10、25、100ng建库起始浓度进行建库，建库方法参考illumina常规建库方法，重亚硫酸盐处理方法按EZ DNA Methylation-LightingTMKit进行。
建库结果如下表5所示，采用常规甲基化建库方法的仅能检出建库起始DNA量为100ng的样本。
表5、采用常规方法进行甲基化建库和测序的建库质量和测序质量
实验例1、连接反应液的优化
以10ng的起始DNA量(样本1)进行甲基化建库测序，实施例1的其余步骤不变，接头连接步骤中，连接反应液的组分设置如下表6所示。
表6、连接反应液组分设置
采用不同的连接反应液，建库质量和测序质量评估如下表7所示。
表7、不同连接反应液对建库质量和测序质量的影响
以上结果表明，在常规反应液的基础上，增加乙醇和亚精胺，并且经过合理配伍，获得的反应液能使得构建的文库浓度提高，能够满足微量起始DNA的建库需求，并且获得的测序质量良好。
实验例2、PCR扩增中酶的优选
以10ng的起始DNA量(样本1)进行甲基化建库测序，实施例1的其余步骤不变，步骤6PCR扩增中KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR Kit以KAPA2G Robust HotStart ReadyMix和Ex Taq buffer 5.0+Ex HS Taq(Takara)替代，建库质量和测序质量对比如表8，KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR Kit扩增效率高，更适用于扩增重亚硫酸盐处理过的DNA。
表8、PCR扩增中的酶mix对建库质量和测序质量的影响
实验例3、重亚硫酸盐处理时间优化
以10ng的起始DNA量(样本1)进行甲基化建库测序，实施例1的其余步骤不变，为了减少重亚硫酸盐处理过程中酸性对DNA的破坏，在EZ DNA Methylation-LightingTMKit试剂盒流程的基础上，对CT Conversion Reagent溶液处理时间优化，分别设计40、45、50、60min四个处理时间梯度，建库质量及测序质量如表9所示，可见处理45min时建库质量及测序质量最佳。
表9、处理时间对建库质量及测序质量的影响