本发明属于生物医学技术领域，涉及一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
背景技术：
乳腺癌作为一种常见的恶性肿瘤，严重威胁女性的生命和健康。近年来我国乳腺癌的发病率明显增高，
目前，我国乳腺癌发病率为42.55 /10万，居女性恶性肿瘤的第一位。目前，乳腺癌的治疗方法有多种，如手术、放疗、化疗及生物治疗等，其中以乳腺癌手术切除为主要治疗措施，但术后复发和转移已成为阻碍患者生存期提高的主要原因。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，由于自然或侵袭性医源性因素，癌细胞可从原发灶脱落形成循环肿瘤细胞，但是目前的检测方法灵敏度及特异性较低，不能检测到微量的癌细胞，这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，休眠的癌细胞就有可能被激活，从而导致了乳腺癌的复发和转移，循环肿瘤细胞的数量与乳腺癌的进展及患者生存期等密切相关。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过RT-PCR技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mＲNA的检测方法，通过检测人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）mＲNA的表达以判断循环乳腺肿瘤细胞的存在。
人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）是一种特异性的在乳腺癌中选择性表达的基因，其定位于人类染色体10q23，DNA长度约5kb。BCSG1基因编码合成1条含127个氨基酸的蛋白，其在乳腺癌组织中特异性表达，在正常乳腺或良性乳腺病变中几乎不表达，是一种与乳腺癌进展有关的肿瘤标记物。BCSG1基因的表达与肿瘤分期、淋巴结浸润、肿瘤体积及转移等密切相关，在III / IV期乳腺癌中BCSG1的阳性率为71. 4% 或81% ，I / II患者中阳性率为26.8%或15%，BCSG1阳性的乳腺癌患者其生存期较BCSG1阴性患者明显缩短。正常人外周血BCSG1 mＲNA呈阴性；游离于细胞外的mＲNA很不稳定，极易被ＲNA酶解，故在外周血中若测得BCSG1 mＲNA，则提示血循环中存在有完整的乳腺癌细胞，但目前尚没有合适的阳性率高的检测技术。
由于目前通过实时荧光定量PCR技术检测人乳腺癌特异性基因1（BCSG1）mＲNA的表达以判断循环乳腺肿瘤细胞的阳性率低，不具有临床应用价值，因此，研制一种较高的特异性、灵敏性、准确性及质量控制的BCSG1 mＲNA实时荧光定量ＲT-PCＲ检测试剂盒是非常必要的。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本发明人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有较高的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为。
一种人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括红细胞裂解液、无ＲNA 酶水、ＲNA提取液、dNTP 混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液、PCR反应缓冲液、UNG酶储存液、引物对、探针、标准品、阳性质控品、阴性质控品。
所述红细胞裂解液是由pH7.6 0.01 mol/L Tris-HCl、0.01mol/L NaCl和0.005 mol / L MgCl2组成。
所述引物为包含BCSG1基因的上游引物和正常的下游引物，序列分别如下：
上游引物：5’- GGGTGAGGCATCCAA AGAGA -3 ’；
下游引物：5’- TGGGCAGCCGCATGTC-3’。
所述探针由通常的核苷酸引物合成仪合成，序列如下：扩增BCSG1基因的引物序列如下：5’-FAM-AGA GGA AGTGGCAGA GGAGGCCCA-TAMＲA-3’。
所述阳性质控品为含有 BCSG1 mＲNA的总ＲNA。
所述阴性质控品为不含 BCSG1 mＲNA的总ＲNA。
所述标准品采用BCSG1质粒使用 TE溶液溶解，浓度为 2 × 107拷贝数/μL。
本发明的有益效果：
（1）本发明优化了试剂盒中的引物、探针、定值标准品、设立阳性、阴性质控品提高了试剂盒的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等性能，本发明试剂盒的特异度及准确性均为 95% 以上，灵敏度为100拷贝/m L(全血)，稳定性较好，在-20℃中保存12个月其性能未发生变化。
（2）本发明试剂盒对外周血标本中 BCSG1 mＲNA的检测结果表明，12 例临床确诊已转移的乳腺癌患者检测结果均为阳性，21 例临床未确诊转移的乳腺癌患者中 12 例为阳性，其余9例为阴性; 15 例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性，未检测到BCSG1 mＲNA的表达，临床确诊已转移的乳腺癌患者外周血中BCSG1 mＲNA表达量和阳性率明显高于未确诊转移的乳腺癌患者、乳腺良性疾病患者及正常人。由此可推测外周血样品中BCSG1 mＲNA的表达量与患者的临床分期等密切相关，是一项较好的血源性乳腺癌细胞的监测指标，可作为乳腺癌患者诊疗过程中的重要监测指标。本发明试剂盒检测乳腺癌患者血中的BCSG1 mＲNA的表达量，对判断乳腺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。
附图说明
图1本发明试剂盒检测外周血BCSG1 mＲNA的定量检测结果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
1、本发明人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒
本发明试剂盒包括红细胞裂解液（由pH7.6 0.01 mol/L Tris-HCl、0.01mol/L NaCl和0.005 mol / L MgCl2组成）、无ＲNA 酶水、ＲNA提取液、dNTP 混合物、逆转录酶储存液、反转录缓冲液、PCR反应缓冲液、UNG酶储存液、引物对、探针、标准品（采用BCSG1质粒使用 TE溶液溶解，浓度为 2 × 107拷贝数/μL）、阳性质控品（含有 BCSG1 mＲNA的总ＲNA）、阴性质控品（不含 BCSG1 mＲNA的总ＲNA）。
所述引物为包含BCSG1基因的上游引物和正常的下游引物，序列分别如下：
上游引物：5’- GGGTGAGGCATCCAA AGAGA -3 ’；
下游引物：5’- TGGGCAGCCGCATGTC-3’。
所述探针由通常的核苷酸引物合成仪合成，序列如下：扩增BCSG1基因的引物序列如下：5’-FAM-AGA GGA AGTGGCAGA GGAGGCCCA-TAMＲA-3’。
2、本发明人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒实验步骤如下：
第一步外周血有核细胞分离
采静脉血 3 m L 于5 m L EDTA抗凝管中，使用红细胞裂解液裂解红细胞，4℃，450 g，离心10 min，收集有核细胞，备用。
第二步总ＲNA提取
外周血有核细胞、K562 细胞( 阴性对照) 和 SK-BＲ-3 细胞( 阳性对照) 的总ＲNA均按Trizol试剂盒方法提取。
第三步实时荧光定量RT-PCR
（1）RT反应：总体积为10μL，包括反转录反应液3.5μL、总ＲNA溶液5.0μL、无ＲNA酶的水1.5μL。反应条件为：37℃，20 min：95℃，5 min。反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上，备用。
（2）标准品的处理：将标准品储存液（2 × 107拷贝数/μL）梯度稀释为 2 × 106，2 × 105，2 × 104，2 × 103，2 × 102，2 × 101拷贝数/μL，备用。
（3）荧光定量PCR反应：在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增；反应体系为：模板5.0μL、PCR反应液15.0μL、水 5.0μL，其中，模板分别为实验组样品反转录产物、对照组样品反转录产
物、阳性及阴性质控品反转录产物和标准品；反应条件为：37℃，10 min→95℃，15 min→( 95℃，15 s→60℃，1 min) 。括号内条件共重复45个循环。
3、本发明试剂盒的临床研究
收集乳腺癌患者外周血标本33份（由安徽省立医院、安徽医科大学第一附属医院及合肥市第一人民医院提供，患者知情，经临床诊断结果如图1），其中12份为临床上已确诊远端转移的标本；乳腺增生及乳腺炎患者外周血标本15份；正常人外周血标本10份。用实施例2中的人乳腺癌特异性基因1mＲNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其检测方法对以上乳腺癌患者外周血标本进行检测。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。