KCTD20基因作为早期诊断帕金森症的新型标志物的制作方法

本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于帕金森症诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-KCTD20基因在制备诊断帕金森症的产品中的应用。

背景技术：

帕金森病(Parkinson Disease,PD)又称震颤麻痹，为中老年神经系统常见病。我国流行病学调查，50岁以上人群中PD的患病率为1％(罗毅原发性帕金森病药物治疗的探讨解放军保健医学杂志，2006,8(1):1-5)，男女发病无明显差异。国内外统计结果相似。随着社会的老龄化，据估计到2040年的PD发病率将增加4倍。PD产生的运动功能障碍主要有静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓和姿势异常等。疾病后期，常出现神经心理障碍；或者一系列运动并发症。晚期残障严重，生活不能自理，给社会和家庭带来沉重负担。然而,引起PD的确切病因和发病机理迄今仍不清楚。目前认为，是受遗传因素、环境因素共同影响，并在年龄老化等作用下的结果(Schrag A,Ben-Shlomo Y,Quinn NP.Cross sectional prevalence survey of idiopathic Parkinson's disease and Parkinsonism in London[J].British Medical Journal.2000,321:21-2；Warner T,Schapira A H.Genetic and environmental factors in the cause of Parkinson's disease[J].Annals of Neurology.2003,53(13):16-23)。它的主要病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元大量丧失，而存活的神经细胞内有称为路易氏体的包涵体形成。路易氏体包含许多积聚的蛋白质和脂类，其中α-syn为主要成份(CooksonMR.The biochemistry of Parkinson's disease[J].Annu Rev Biochem.2005,74:29-52)。临床上，诊断帕金森病主要依据是患者的临床症状和医师的经验，尚无帮助确定诊断帕金森病的生化指标。目前，国内外的研究热点转移到研究此类退行性疾病的生物标志物上，希望发现稳定性和重复性均佳的生物标志物来帮助临床早期诊断。对于疾病而言，生物标志物一般是指可供客观测定和评价的一个普通生理、病理或治疗过程中的某种特征性的生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。现已越来越多的研究发现特异基因能够成为诊断帕金森的生物标志物，如以下申请号的专利公开的：201510713527.3、201510464905.9、201510463593.X、201510463617.1、201510809837.5。大部分疾病都是多基因调控的疾病，为了提高疾病的诊断准确率，将大量基因联合诊断成为必然，因此需要发掘更多与帕金森病相关的分子比标志物以便临床应用。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于帕金森症早期诊断的分子标志物。相比传统的帕金森症的诊断方法，使用基因标志物来诊断帕金森症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测KCTD20基因表达的产品在制备诊断帕金森症的工具中的应用。

进一步，上面所提到的检测KCTD20基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测KCTD20基因表达水平以诊断帕金森症的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增KCTD20基因的引物；所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增KCTD20基因的引物；所述用免疫检测诊断帕金森症的产品包括：与KCTD20蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断帕金森症的产品包括：与KCTD20基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断帕金森症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KCTD20蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KCTD20基因的核酸序列杂交的探针。

在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增KCTD20基因的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测KCTD20基因表达的产品可以应用于该平台实现对KCTD20基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知KCTD20基因的异常与帕金森症相关也属于KCTD20基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断帕金森症的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KCTD20基因转录水平的针对KCTD20基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KCTD20蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括KCTD20基因在内的多个基因(例如，与帕金森症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括KCTD20蛋白在内的多个蛋白质(例如与帕金森症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与帕金森症的标志物同时检测，可大大提高帕金森症诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KCTD20基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KCTD20蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测KCTD20基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对KCTD20基因的引物和/或探针。根据KCTD20基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测KCTD20基因表达水平的引物和探针。

与KCTD20基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

所述高通量测序平台包括检测KCTD20基因表达水平的试剂。

所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测KCTD20基因的转录水平。

进一步，所述KCTD20蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述KCTD20蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KCTD20蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对KCTD20基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。

用于诊断帕金森症的KCTD20基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断帕金森症的KCTD20基因及其表达产物的来源是血液。

在本发明的上下文中，“KCTD20基因”包括KCTD20基因以及KCTD20基因的任何功能等同物的多核苷酸。KCTD20基因(Chromosome 6,NC_000006.12(36442767..36491143))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。

在本发明的上下文中，KCTD20基因表达产物包括KCTD20蛋白以及KCTD20蛋白的部分肽。所述KCTD20蛋白的部分肽含有与帕金森症相关的功能域。

“KCTD20蛋白”包括KCTD20蛋白以及KCTD20蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括KCTD20蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与KCTD20的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是KCTD20蛋白的融合蛋白。对于与KCTD20蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留KCTD20蛋白的生物学活性即可。

在本发明的上下文中，“诊断帕金森症”既包括判断受试者是否已经患有帕金森症、也包括判断受试者是否存在患有帕金森症的风险。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了KCTD20基因表达与帕金森症相关，通过检测受试者中KCTD20的表达，可以判断受试者是否患有帕金森症、或者判断受试者是否存在患有帕金森症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-KCTD20基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现帕金森症的早期诊断，从而降低帕金森症的死亡率。

附图说明

图1显示利用基因芯片检测KCTD20基因在帕金森症患者和正常人中的表达差异；图2显示利用QPCR检测KCTD20基因在帕金森症患者和正常人中的表达差异。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选帕金森症患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

收集原发性PD患者10例，男5例，女5例，年龄32-85岁，病程5个月-20年。PD入组标准：诊断标准均符合PD临床诊断标准(参考“蒋雨平，王坚，丁正同，等，原发性帕金森病的诊断标准，2005，中国临床神经科学，2006，14:40”)。排除标准：(1)特发性震颤；(2)继发性帕金森综合征；(3)严重痴呆、构音障碍者；(4)患有其他精神疾患者。此项研究己通过医院伦理委员会批准且所有患者签署知情同意书。

正常组：选取年龄32-80岁的健康志愿者10例，男女各5例。

两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10)，具有可比性。

2、血液中总RNA的提取

(1)匀浆处理(Homogenization)

直接取新鲜的血液(外周血)，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。

(2)分层(Phase Separation)

a.样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

b.每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

(3)RNA沉淀(RNAPrecipitation)

a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。

b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

(4)RNA漂洗(RNA Wash)

a.RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。

b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。

(5)溶解RNA(Redissolving the RNA)

沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

3、RNA质量和纯度检测

RNA质量：通过RNA完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。

RNA纯度：OD260/OD280比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA样品，OD260/OD280值(10mM Tris,pH7.5)在2.0左右。

4、基因芯片杂交及扫描

总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。

5、芯片数据处理与分析

杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。

6、统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。

7、结果

结果显示(如图1所示)，与正常人相比，帕金森症患者血液中KCTD20基因的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2 QPCR实验验证帕金森症患者和正常人中差异表达的基因

1、研究对象：

筛选标准同实施例1，帕金森症患者和正常人各50例。

2、血液中总RNA的提取

步骤同实施例1。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、QPCR

(1)引物设计

根据Genbank中KCTD20基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

KCTD20基因：

正向引物为5’-GCTGCTTAGTGGATGATAC-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-AGATTATGAGGACCAGATGA-3’(SEQ ID NO.2)，

GAPDH基因：

正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃10s，60℃40s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图2所示，与正常人相比，帕金森症患者血液中KCTD20基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果同基因芯片实验。

实施例3免疫印迹实验验证帕金森症患者和正常人中差异表达基因的表达产物

1、临床对象：同实施例2。

2、单核细胞分离

帕金森症患者和正常人取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na₂HPO₄ 0.132g，KH₂PO₄ 0.06g，KCl 0.4g，酚红1ml，NaHCO₃ 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×10⁶个/ml备用。

3、单核细胞总蛋白质提取

将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×10⁶个/ml)室温1 000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。

4、Western blot检测

细胞总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。

5、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果显示，以正常人组血液中的蛋白相对表达水平为1，帕金森症组血液中KCTD20蛋白水平为5.87±1.45，显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> KCTD20基因作为早期诊断帕金森症的新型标志物

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgcttagt ggatgatac 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agattatgag gaccagatga 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttaactctg gtaaagtgga tat 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20