本发明涉及体外诊断检测
技术领域：
，具体涉及到血液肿瘤融合基因的高通量检测的试剂盒及检测方法。
背景技术：
：血液肿瘤主要包括各类白血病、多发性骨髓瘤以及恶性淋巴瘤。急性白血病占常见恶性肿瘤的第八位，淋巴瘤也是在前十位，并且发病率逐年升高，多发性骨髓瘤的整个发病率在血液恶性肿瘤里面占10％。融合基因(fusiongene)，是血液肿瘤的分子生物学特异性标志。近年来，由于分子生物学技术的发展，对血液肿瘤细胞的分子遗传学改变的了解也不断深入。已经认识到大部分的血液肿瘤中存在着染色体结构畸变，包括缺失、重复、倒位、易位等，导致原癌基因及抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。有些基因是调控细胞增殖、分化和凋亡的转录因子，当基因发生变异，直接影响了下游信号传递途径，导致细胞增殖能力增强、凋亡障碍，分化障碍等，产生血液肿瘤表型。迄今报道血液肿瘤涉及的融合基因近千种，其中一些基因涉及到的融合种类多达数十种，如已知的MLL融合就高达135种，与ETV6融合的基因41种。一些典型的融合基因是某种血液肿瘤的特异性分子诊断标志，如BCR-ABL融合基因，可出现在95％以上的慢性粒细胞白血病中(CML)。患者预后效果的好坏，与融合基因的类型有一定关系，如急性早幼粒细胞白血病(APL)特有的PML-RARa融合基因，对APL患者用全反式维甲酸(ATRA)诱导缓解治疗，其预后非常好，复发率低。而有些基因，如MLL相关融合基因，预后差，死亡率高。当前对于血液病融合基因检测，大都只能针对某些明确融合基因进行检测，通量小，无法覆盖全部的融合基因，因此存在漏检情况。目前应用较多的包括染色体核型分析、荧光原位杂交和PCR方法。染色体核型分析依据的是不同物种的染色体都有各自特定的形态结构(包括染色体的数目、长度、着丝点位置、臂比、随体大小等)特征，而且这种形态特征是相对稳定的。经染色或荧光标记的染色体，通过一定的光学或电化学显色设备就可以清晰而直观的观察到染色体的具体形态结构，再与正常核型进行对比寻找差异，进而确定染色体的缺失、重复和倒置等现象。但染色体核型分析中白血病细胞体外培养难以捕捉到长度适中的染色体中期分裂相，使一些微小易位、小片段缺失、重复或倒位无法检出。即使是很有经验的实验室也常有5％－10％的病例染色体培养失败。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)是通过根据已知的基因序列合成探针，并分别标上不同的荧光。这个探针就可以根据基因的序列去寻找它在染色体上的位置，并与之结合。由于每条探针上标记很多个荧光分子，在荧光显微镜下就可以看到明亮的信号。如果两个基因分别标上红色和绿色荧光，在这两个基因形成融合基因的条件下，红色和绿色荧光跑到一起，就变成了黄色的荧光，即融合信号。但FISH检测中，需要先确定检测的目的，选择不同基因的探针，并且只能对特定的基因进行分析。其对于未知染色体异常病例，常需多种探针进行筛选，成本高，周期长，不适合常规检测。聚合酶链式反应(PCR)是检测白血病相关融合基因较为有效敏感的方法，除常规PCR外，巢式RT-PCR，实时荧光PCR技术已应用于白血病相关融合基因的检测。PCR方法的特定的基因检测方案，只能在已知融合相关的两基因以及融合位置这三个条件下，才能设计针对性的引物进行检测。如BCR-ABL1融合主要存在P210(e14a2)，P190(e1a2)以及P230(e19a2)，占全部BCR-ABL1融合类型的92％。常规方法需要4对特异性引物才能将这3种主要融合类型检测出来。对于其余的融合类型有8％的漏检情况。目前很多技术与专利集中在多重PCR方法进行融合基因检测，随着引物设计的增加，反应体系的要求也越来越高，同时对于新的融合断点以及新的融合依旧无法检测。对于覆盖所有报道的融合基因、融合伙伴基因众多的融合基因检测、新发融合基因检测以及新的融合断点形成的融合基因的检测，目前尚未有较好的检测方法。目前主流手段均存在一定缺陷。公开于该
背景技术：
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。技术实现要素：本发明的目的在于提供血液肿瘤融合基因的高通量检测试剂盒及检测方法，以解决现有融合基因检测技术中覆盖不全、无法检测新发融合断点的融合类型、无法检测新发融合以及融合伙伴基因众多的问题。为实现上述目的，本发明提供了一种血液肿瘤融合基因的高通量检测试剂盒，包括靶向血液肿瘤融合基因的寡聚核苷酸链、具有链酶亲和素标记的磁珠和缓冲溶液。上述高通量检测试剂盒以基因为单位，可检出该基因的全部融合基因，一次可以同时检测近千种融合基因，同时基于寡聚核苷酸的互补配对原理，可以实现相关基因的新发融合以及新发融合断点的检测。上述高通量检测试剂盒中的寡聚核苷酸链用以富集待测cDNA中的目的序列以及融合信号序列。上述高通量检测试剂盒在另一种实施方式中，所述寡聚核苷酸链为RNA或DNA序列。上述高通量检测试剂盒在另一种实施方式中，所述寡聚核苷酸链为RNA序列。上述高通量检测试剂盒在另一种实施方式中，所述寡聚核苷酸链带有生物素标记或链酶亲和素磁珠标记，优选的，所述寡聚核苷酸链带有生物素标记。上述高通量检测试剂盒在另一种实施方式中，所述寡聚核苷酸链的长度为80-120bp。上述寡聚核苷酸链的序列与人参考基因组序列一致，以基因为单位进行设计，以每个基因的转录本序列为基础，通过叠瓦式的切割，得到每一条寡聚核苷酸链，再通过反向比对，将可以比对到多个位置的序列去除，得到最终的用于富集的寡聚核苷酸链。本发明所涉及的上述高通量检测试剂盒中的链酶亲和素标记的磁珠用于从混合物中钓出特异性寡核苷酸诱饵-DNA杂合体。本发明所涉及的上述高通量检测试剂盒中的缓冲溶液用于将寡聚核苷酸链与富集前文库进行孵育。上述高通量检测试剂盒在另一种实施方式中，所述寡聚核苷酸链包括核酸序列为SEQIDNO.1-40的寡聚核苷酸序列。本发明所涉及的上述高通量检测试剂盒可同时对覆盖基因的全部相关融合基因进行检测，其中所述全部相关融合基因包括已知融合基因和新的融合基因，并且运用该试剂盒还可以确定已知基因发生断裂融合的新的伙伴基因，可以检测到复杂的断裂融合类型，最大程度的降低漏检率，提高检出率。进一步的，应用该试剂盒可以对检测到的融合基因进行半定量检测，并实现高通量检测。上述高通量检测试剂盒在另一种实施方式中，所述具有链酶亲和素标记的磁珠用于与目标片段结合，用以纯化富集目标序列。本发明还提供了高通量检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：设计并合成靶向血液肿瘤融合基因的寡聚核苷酸链；对于待检样本进行RNA提取、反转录、片段化、末端修复、加A及添加高通量测序接头形成富集前文库；将合成的寡聚核苷酸链与富集前文库进行共同孵育，并加入缓冲溶液，通过链酶亲和素标记的磁珠，以及强磁铁从混合物中钓出特异性寡核苷酸链诱饵-富集前文库DNA杂合体，洗脱磁珠，将没有结合的非目的片段进行洗脱，得到富集后文库；将富集后文库通过测序平台进行高通量测序，从而得到富集后文库中的序列信息；通过对所测序列的生物信息分析，得到支持融合的潜在序列，分析测序结果得到融合基因检测的结果。上述检测方法在另一种实施方式中，待检样本可通过DNA提取，通过片段化、末端修复，加A以及添加高通量测序接头以形成富集前文库。本发明的上述检测方法中，测序平台为Illumina测序平台。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.经过十余年的快速发展，第二代高通量基因测序技术已经发展出成熟的检测平台，并且成为近年来分子诊断技术进展的重点，本发明利用高通量技术测序检测融合基因，对血液病的诊断具有重要的临床意义；2.不受传统PCR引物设计的影响，本发明利用寡核苷酸链的互补配对特性，完成半特异性富集，从而实现在不知道B基因情况下进行融合序列的富集，本发明试剂盒中是针对人参考基因组序列外显子区域设计合成的寡聚核苷酸链，本发明所涉及检测方法，不存在寡聚核苷酸序列间的相互影响，中具有很强的灵活性以及可拓展性；3.本发明以基因为单位，设计寡居核苷酸链，从转录组片段中富集目的片段，从而大幅度降低测序费用的同时，能够精确检测基因融合；该技术应用到癌症融合基因研究中，提高了癌症研究中RNA测序的效率，是在肿瘤cDNA文库中寻找新融合基因的重要工具，现对于前临床上融合基因检测技术，其检测范围也就是同时检测已知的几十种融合。本发明在保证同时覆盖全部已知融合的检出范围下，可以精确的检测具体的融合基因及其断裂点，实现了大范围与高精准的检测，同时，通过寡聚核苷酸序列富集，将其检测成本也控制在了临床可以接受的范围之内；4.融合基因断裂位点以及“伙伴”因存在着多样性与复杂性，因可以与不同的伙伴基因及相同伙伴基因的不同断裂位点形成许多种不同的融合基因，本发明适用于这种特殊融合形式的融合基因的检测；5.本发明可以筛选到新的融合基因，发现与已知基因发生断裂融合的新的伙伴基因。具体实施方式下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例11.融合相关寡聚核苷酸链设计与合成本发明试剂盒通过检索权威文献和数据库(Atlas、fusion、Cosmic、Pubmed)以及临床指南、专家共识等对血液肿瘤报道的相关融合进行了全面调研，在全部的937种融合中，经过优化设计选择最优的225个基因进行设计。对于每个基因的转录序列进行叠瓦式切割，得到每一条寡聚核苷酸链，其序列与人参考基因组序列一致。核苷酸的序列长度在80-120bp不等。设计好的探针与NCBI等数据库进行Blast比对,并且要确保探针的特异性，将多比对的或存在回文序列等特殊结构的核苷酸序列剔除，得到最终的融合相关的寡聚核苷酸链。将设计出的寡聚核苷酸链通过PCR扩增后，得到核苷酸序列富集库，需要注意的是使用生物素与UTP结合形成Biotin-UTP，以Biotin-UTPATP、CTP、GTP为底物进行扩增，从而完成带有生物素标记的寡聚核苷酸链富集库的合成。以MLL基因为例，其富集的探针序列见基因序列表SEQIDNO.1-40。实施例2以基因为单位的血液肿瘤融合基因检测方法1.TRizol法提取骨髓样本的总RNA1)将样本加入3倍体积的Trizol中，震荡，室温静置5min，使其充分裂解，13000rpm离心5min，然后将管中的上清转移至新2.0mlEP管；2)按照Trizol：氯仿＝5:1的比例加入氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀15s，室温静置2-3min，使其自然分相；3)4℃，13000rpm离心5min，混合物会分成三层：下层红色为苯酚－氯仿有机相，中间层和无色上层水相，RNA主要集中在水相；4)将上清转入一新2.0mlEP管(注意不要吸到中间层和下层)，加入等体积氯仿，漩涡振荡器上振荡混匀15s，室温静置2-3min，使其自然分相，4℃，13000rpm离心5min；5)将上层水相转入新的1.5mlEP管(约500-600μl，注意不要取到下层液体)，离心管上标明项目名称、样品名称和日期，加入等体积的异丙醇，混匀后，-80℃或干冰放置20min；6)4℃，13000rpm离心10min，弃掉上清；7)向RNA沉淀中加入1ml75％乙醇，颠倒混匀5s，4℃，13000rpm离心5min，弃上清；8)重复步骤7)；9)4℃，13000rpm离心1min，用枪头小心吸弃多余液体；10)将RNA沉淀置于超净工作台吹干，约1-2min(不易太干，否则RNA很难溶解)，用适量无RNA酶的双蒸H2O溶解RNA沉淀。2.对提取的RNA进行扩增2.1第一链cDNA的合成2.1.1在微量离心管中配制下述反应液，全量10μl。试剂使用量RNA500ngdNTP混合物1μlOligo(dT)18引物2μl无RNA酶水总体积至10μl2.1.265℃温育5min后，放入冰中急冷。2.1.3配制以下反应液10ul加入到3.1.2冷却后的反应液中。试剂使用量5×第一链缓冲液4μlRNA酶抑制剂(RNaseInhibitor)1μl逆转录酶(PrimeScriptRTase)1μl无RNA酶水4μl2.1.4轻柔搅拌混匀。2.1.542℃反应1小时。2.1.6反应结束后置于冰中冷却2分钟。2.2第二链cDNA合成反应2.2.1在第一链cDNA合成反应后的微量离心管中按下列顺序配制合成cDNA第二条链的反应液，全量为142μl。试剂使用量5×第二链缓冲液30μldNTP混合物3μl无RNA酶水89μl2.2.216℃反应2小时。2.3用AgencourtAMPureXP磁珠(Beckman，A63882)纯化DNA样本2.3.1让AMPureXPbead在室温放置至少30min。2.3.2充分混匀AMPureXPbead悬浮液，直至悬浮液颜色均一。不要冷冻。2.3.3在1.5ml新管中加入262.8ul混匀的AMPureXPbead悬浮液和双链cDNA文库(～146ul)。涡旋混匀，室温放置2min。2.3.4将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。2.3.5在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。2.3.6在磁力架上，在每个管中分加200ul80％乙醇。用新鲜现配的乙醇可以获得更好的效果。2.3.7静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。2.3.8重复步骤3.3.6、3.3.7一次。2.3.9室温放置数分钟，至管中残留的乙醇完全蒸发。注：不要等到磁珠表面出现裂纹，磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降。2.3.10加入30ul无核酸酶水，涡旋混匀，室温放置2min。2.3.11将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。2.3.12吸取大约30ul上清到一个新的1.5ml管中。在此步可以丢弃磁珠。如果不进行后续步骤，将样本保存在-20℃冰箱。3.富集前文库构建：将第二链已经合成好的cDNA全长采用Covaris(S220)打断成150-200bp，以20ng-100ng起始量建库；3.1、Covaris剪切(提前四十分钟开机)3.1.1设置covaris：a)在covaris水缸中加入去离子水，水位达到刻度左“15”；b)检查水位是否能没过管子的玻璃部分；c)将冷却温度设为2-5℃，冷却至5℃；d)可选。加入乙二醇(ethyleneglycol)至总体积的20％，防止结冰。e)按下控制板上的“Degas”按钮。使用之前Degas至少30min。3.1.2在1.5mlEP管中，用1XLowTE缓冲液分别将10ng和30ngcDNA稀释到130μl。3.1.3将CovarismicroTube装到covaris上。3.1.4用锥形枪头小心地吸取130μlcDNA样本，加入到CovarismicroTube管中。(小心操作，不要使管子底部出现气泡)3.1.5按照下表1设置Covaris参数，进行DNA破碎。破碎产物的主峰在150-200bp。表13.1.6用锥形枪头小心地将破碎后的DNA样本吸到一个新的1.5mlEP管中。3.2浓缩2000rpm，45゜C，27-30min，缩到小于32μl。3.3末端修复和加腺苷酸A3.3.1按如下体系配置末端修复和加A的反应体系：3.3.2轻柔混匀，瞬时离心，PCR仪上按照如下程序进行反应：22℃20min72℃20min4℃结束。3.3.3反应结束后立刻放置冰上，立即进入下一步接头连接反应。3.4接头的连接3.4.1反应体系：NEXTflexTM接头：5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(即，SEQIDNO.41)5'GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(即，SEQIDNO.42)3.4.2轻柔混匀，瞬时离心。20℃放置30min。3.5、用1X的AMPureXP磁珠纯化DNA样本3.5.1充分混匀AMPureXPbead悬浮液，直至悬浮液颜色均一。3.5.2在1.5mL新管中加入100μL混匀的AMPureXPbead悬浮液和末端加了adaptor的DNA文库。涡旋混匀5s，室温放置5min。3.5.3短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约3min至溶液变澄清。3.5.4在磁力架上小心地吸除管中的上清，枪头不要碰到磁珠。3.5.5在磁力架上，在每个管中分加200μL80％乙醇。3.5.6静置1min让磁珠沉降后，吸除乙醇。3.5.7重复步骤5、6一次。3.5.8室温晾干，直至管中残留的乙醇完全挥发(磁珠过干会导致洗脱的效率显著下降)。3.5.9加入37μLnuclease-freewater，涡旋混匀5s，室温放置5min。3.5.10短暂离心，将管子放在磁力架上，静置大约2min至溶液变澄清。3.5.11吸取36μL上清到一个新的PCR管中，进行下一步操作。此步可以丢弃磁珠。3.6PCR富集3.6.1在上述产物中加入：引物1：5'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(即，SEQIDNO.43)引物2：5'CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(即，SEQIDNO.44)3.6.2轻柔混匀，PCR仪上进行反应：3.7PCR产物纯化(等体积纯化一次)3.7.1涡旋混匀AMPureXP磁珠。3.7.2按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入50μL(等体积)重悬好的AMPureXP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步PCR产物加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。3.7.3置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。3.7.4加入200μL80％乙醇漂洗，置于磁力架上，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。3.7.5重复步骤3.7.4一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。3.7.6敞开盖子15min让乙醇尽量挥发干净，至磁珠干燥。3.7.7加入22.5μL无RNA酶H2O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μL枪头小心吸取21μl上清至干净的离心管内。3.7.8取1μl进行Qubit定量。记下文库浓度，写上文库编号。4.融合序列富集及洗脱4.1取富集前文库于一个新的离心管中，用真空抽干机进行浓缩直至文库的体积为6.4ul。使用安捷伦公司的QXT试剂盒(Agilent，G9681B)进行融合序列富集和洗脱。富集过程中务必保证管盖盖紧，最小化减少杂交混合液体积的蒸发，否则将会影响富集效果。富集程序如下：4.2PCR扩增在冰上按照下表体系配制PCR反应液：4.3确认将含有磁珠的反应液混匀后，将管子放入PCR仪中进行扩增，反应程序如下表所示：4.4用1.8倍体积的AMPureXP磁珠纯化PCR扩增后的产物，20ul无核酸酶的水洗脱。5.库检上机文库库检合格后上机，上机平台选择illumina平台的nexseq500测序仪，测序策略为PE。6.数据分析6.1通过高通量测序仪，得到样本的测序序列信息6.2通过脚本过滤掉测序接头，测序质量值较低及无法区分碱基比率较高的测序序列。6.3将得到干净的测序序列通过比对软件比对到人类参考基因组上(hg19版本)。6.4然后对得到的比对结果进行解析，找比对多不同基因上面的伴侣测序序列作为候选融合位点。6.5对未比对到人参考基因组的序列提取出来，通过自写脚本将测序序列分割成连续的长度大于25bp的段片段，然后重新比对到参考基因组。6.6通过单端的测序序列寻找融合基因断裂位点，通过统计断裂位点熵变去过滤假阳性位点。表2本发明检测结果上表为测试了16个已知阳性的标本，均检测阳性，经过试验证明方案可行有效，另外包括标准品测试、人工混样测试、检测灵敏度测试、回顾性临床样本测试等30余次测试，证明本发明的确实可行，并且确实可以发现临床上漏检的融合基因，且该部分融合基因对于临床医生了解患者病情存在切实的帮助。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。序列表<110>北京优讯医学检验所有限公司深圳豪石生物科技有限公司<120>血液肿瘤融合基因的高通量检测试剂盒及检测方法<130>P162730DD1F<160>44<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.1)<400>1agcactctctgccccaggactcatggctctgctgtgccttccatcctgggctcccttctc60tcctgtgaccttaagaactttgtctggtggctttgctggaacattgtcactgttttcact120<210>2<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.2)<400>2tcctgtgaccttaagaactttgtctggtggctttgctggaacattgtcactgttttcact60gtcatgcagggagcccagcactgtggccaggatggcagagacttccttgtcatcatggag120<210>3<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.3)<400>3gtcatgcagggagcccagcactgtggccaggatggcagagacttccttgtcatcatggag60aagtgccagcaggggactgggaaaagcactctacccagacctcacctcccttcctccttt120<210>4<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.4)<400>4aagtgccagcaggggactgggaaaagcactctacccagacctcacctcccttcctccttt60tgcccatgaacaagatgcagtggccctaggggttccactagtgtctgctttcctttatta120<210>5<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.5)<400>5tgcccatgaacaagatgcagtggccctaggggttccactagtgtctgctttcctttatta60ttgcactgtgtgaggtttttttgtaaatccttgtattcctattttttttaaagaaaaaaa120<210>6<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.6)<400>6ttgcactgtgtgaggtttttttgtaaatccttgtattcctattttttttaaagaaaaaaa60aaaaaccttaagctgcatttgttactgaaatgattaatgcactgatgggtcctgaattca120<210>7<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.7)<400>7aaaaaccttaagctgcatttgttactgaaatgattaatgcactgatgggtcctgaattca60ccttgagaaagacccaaaggccagtcagggggtggggggaactcagctaaatagacctag120<210>8<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.8)<400>8ccttgagaaagacccaaaggccagtcagggggtggggggaactcagctaaatagacctag60ttactgccctgctaggccatgctgtactgtgagcccctcctcactctctaccaaccctaa120<210>9<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.9)<400>9ttactgccctgctaggccatgctgtactgtgagcccctcctcactctctaccaaccctaa60accctgaggacaggggaggaacccacagcttccttctcctgccagctgcagatggtttgc120<210>10<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.10)<400>10accctgaggacaggggaggaacccacagcttccttctcctgccagctgcagatggtttgc60cttgcctttccaccccctaattgtcaaccacaaaaatgagaaattcctcttctagctcag120<210>11<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.11)<400>11cttgcctttccaccccctaattgtcaaccacaaaaatgagaaattcctcttctagctcag60ccttgagtccattgccaaattttcagcacacctgccagcaacttgggggaataagcgaag120<210>12<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.12)<400>12ccttgagtccattgccaaattttcagcacacctgccagcaacttgggggaataagcgaag60gtttccctacaagagggaaagaaggcaaaaacggcacagctatctccaaacacatctgag120<210>13<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.13)<400>13gtttccctacaagagggaaagaaggcaaaaacggcacagctatctccaaacacatctgag60ttcatttcaaaagtgaccaagggaatctccgcacaaaagtgcagattgaggaattgtgat120<210>14<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.14)<400>14ttcatttcaaaagtgaccaagggaatctccgcacaaaagtgcagattgaggaattgtgat60gggtcattcccaagaatcccccaaggggcatcccaaatccctgaggagtaacagctgcaa120<210>15<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.15)<400>15gggtcattcccaagaatcccccaaggggcatcccaaatccctgaggagtaacagctgcaa60acctggtcagttctcagtgagagccagctcacttatagctttgctgctagaacctgttgt120<210>16<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.16)<400>16acctggtcagttctcagtgagagccagctcacttatagctttgctgctagaacctgttgt60ggctgcatttcctggtggccagtgacaactgtgtaaccagaatagctgcatggcgctgac120<210>17<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.17)<400>17ggctgcatttcctggtggccagtgacaactgtgtaaccagaatagctgcatggcgctgac60cctttggccggaacttggtctcttggctccctccttggccacccaccacctctcgcacag120<210>18<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.18)<400>18cctttggccggaacttggtctcttggctccctccttggccacccaccacctctcgcacag60cccctctgtttttacaccaataacaagaattaagggggaagccctggcagctatacgttt120<210>19<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.19)<400>19cccctctgtttttacaccaataacaagaattaagggggaagccctggcagctatacgttt60tcaaccagactcctttgccgggacccagcccgccaccctgctcgcctccgtcaaaccccc120<210>20<211>119<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.20)<400>20tcaaccagactcctttgccgggacccagcccgccaccctgctcgcctccgtcaaaccccc60ggccaatgcagtgagcaccatgtagctcccttgatttaaaaaaaataaaaaataaaaaa119<210>21<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.21)<400>21acacacaaaaataaaaaaaatattctaatgaatgtatctttctaaaggactgacgttcaa60tcaaatatctgaaaatactaaaggtcaaaaccttgtcagatgttaacttctaagttcggt120<210>22<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.22)<400>22tcaaatatctgaaaatactaaaggtcaaaaccttgtcagatgttaacttctaagttcggt60ttgggattttttttttttaatagaaatcaagttgtttttgtttttaaggaaaagcgggtc120<210>23<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.23)<400>23ttgggattttttttttttaatagaaatcaagttgtttttgtttttaaggaaaagcgggtc60attgcaaagggctgggtgtaattttatgtttcatttccttcattttaaagcaatacaagg120<210>24<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.24)<400>24attgcaaagggctgggtgtaattttatgtttcatttccttcattttaaagcaatacaagg60ttatggagcagatggttttgtgccgaatcatgaatactagtcaagtcacacactctggaa120<210>25<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.25)<400>25ttatggagcagatggttttgtgccgaatcatgaatactagtcaagtcacacactctggaa60acttgcaactttttgtttgttttggttttcaaataaatataaatatgatatatataggaa120<210>26<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.26)<400>26acttgcaactttttgtttgttttggttttcaaataaatataaatatgatatatataggaa60ctaatatagtaatgcaccatgtaacaaagcctagttcagtccatggcttttaattctctt120<210>27<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.27)<400>27ctaatatagtaatgcaccatgtaacaaagcctagttcagtccatggcttttaattctctt60aacactatagataaggattgtgttacagttgctagtagcggcaggaagatgtcaggctca120<210>28<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.28)<400>28aacactatagataaggattgtgttacagttgctagtagcggcaggaagatgtcaggctca60ctttcctctgattcccgaaatggggggaacctctaaccataaaggaatggtagaacagtc120<210>29<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.29)<400>29ctttcctctgattcccgaaatggggggaacctctaaccataaaggaatggtagaacagtc60cattcctcggatcagagaaaaatgcagacatggtgtcacctggatttttttctgcccatg120<210>30<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.30)<400>30cattcctcggatcagagaaaaatgcagacatggtgtcacctggatttttttctgcccatg60aatgttgccagtcagtacctgtcctccttgtttctctatttttggttatgaatgttgggg120<210>31<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.31)<400>31aatgttgccagtcagtacctgtcctccttgtttctctatttttggttatgaatgttgggg60ttaccacctgcatttaggggaaaattgtgttctgtgctttcctggtatcttgttccgagg120<210>32<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.32)<400>32ttaccacctgcatttaggggaaaattgtgttctgtgctttcctggtatcttgttccgagg60tactctagttctgtctttcaaccaagaaaatagaattgtggtgtttcttttattgaactt120<210>33<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.33)<400>33tactctagttctgtctttcaaccaagaaaatagaattgtggtgtttcttttattgaactt60ttaacagtctctttagtaaatacaggtagttgaataattgtttcaagagctcaacagatg120<210>34<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.34)<400>34ttaacagtctctttagtaaatacaggtagttgaataattgtttcaagagctcaacagatg60acaagcttcttttctagaaataagacattttttgacaactttatcatgtataacagatct120<210>35<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.35)<400>35acaagcttcttttctagaaataagacattttttgacaactttatcatgtataacagatct60gttttttttccttgtgttcttccaagcttctggttagagaaaaagagaaaaaaaaaaaag120<210>36<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.36)<400>36gttttttttccttgtgttcttccaagcttctggttagagaaaaagagaaaaaaaaaaaag60gaaaatgtgtctaaagtccatcagtgttaactccctgtgacagggatgaaggaaaatact120<210>37<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.37)<400>37gaaaatgtgtctaaagtccatcagtgttaactccctgtgacagggatgaaggaaaatact60ttaatagttcaaaaaataataatgctgaaagctctctacgaaagactgaatgtaaaagta120<210>38<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.38)<400>38ttaatagttcaaaaaataataatgctgaaagctctctacgaaagactgaatgtaaaagta60aaaagtgtacatagttgtaaaaaaaaggagtttttaaacatgtttattttctatgcactt120<210>39<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.39)<400>39aaaagtgtacatagttgtaaaaaaaaggagtttttaaacatgtttattttctatgcactt60ttttttatttaagtgatagtttaattaataaacatgtcaagtttattgctgcacatggtt120<210>40<211>120<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.40)<400>40ttttttatttaagtgatagtttaattaataaacatgtcaagtttattgctgcacatggtt60aagcttccttttggctttggttggagagggtggagaaaagcgggaggggcatggcctgtg120<210>41<211>58<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.41)<400>41aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>42<211>62<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.42)<400>42gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccgatgtatctcgtatgccgtcttctgc60tt62<210>43<211>29<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.43)<400>43aatgatacggcgaccaccgagatctacac29<210>44<211>24<212>DNA<213>人工序列(SEQIDNO.44)<400>44caagcagaagacggcatacgagat24当前第1页1 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