一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法。

背景技术：

2006年以来，核酸测序技术取得了革命性的突破，第二代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)能够快速测定数百万个序列，在技术上实现了对一个物种的转录组和基因组进行全貌分析。特别是高通量的转录组测序技术(RNA-seq)的产生。转录组测序(RNA-seq)是利用NGS技术进行测序，全面快速地获取某一物种或特定器官、组织在某一状态下的几乎所有转录本，分析个体、组织或细胞中的全转录组、小RNA含量或基因表达谱，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

将基于微流控技术的超高重PCR(mmPCR)与高通量测序技术相结合而产生超高重PCR测序(mmPCR-seq)是发明人于2014年在斯坦福大学发展的测序新技术，该技术能够同时扩增多达48个样本的960个位点，使这些位点的基因表达水平均一化，甚至对低含量的RNA样本都能准确定量其等位基因比例。mmPCR-seq填补了传统RNA-seq的靶向测序技术空白，该技术可用于研究转录组的等位基因变化、RNA修饰和RNA表观遗传组学研究，这一技术的发展通过降低成本而极大的扩展RNA-seq的应用领域。

但是目前的mmPCR-seq主要适用于有效构建mRNA文库测序，对于miRNA文库的构建效果不太好。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法。所述方法能够高效并完整地构建小鼠pri-miRNA上的miRNA前体区域转录组文库，极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，以及RNA靶向测序文库的均一性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本。

本发明的目的是提供一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种靶向扩增小鼠miRNA前体区域的探针，其特征在于，所述探针共563对，其序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:1126所示。

本发明自主合成的特异性探针可对miRNA进行靶向扩增，扩增区域包括pri-miRNA上覆盖miRNA前体(pre-miRNA)的区域，是下一步结合mmPCR-seq技术发展新技术的前提

因此，上述探针在小鼠miRNA测序中的应用亦在本发明保护范围内。

具体地，所述应用为上述探针在构建小鼠miRNA高通量测序文库中的应用。

一种构建小鼠miRNA测序文库进行高通量测序的方法，包括如下步骤：

S1.提取小鼠总RNA，反转成cDNA；

S2.以步骤S1所述cDNA为模板，将上述563对探针混合在一起成为1个pool，进行超高重PCR预扩增；

S3.再以预扩增产物为模板，将上述563对探针随机分为48个pool，每个pool包含8～12对探针，进行超高重PCR扩增样品中的miRNA，同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头；

S4.将步骤S3的mmPCR产物连接标签序列；

S5.将加上标签序列的样品进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化电泳产物，即构建好miRNA文库；

S6.将得到的多个miRNA文库混合，利用二代测序技术进行高通量测序；

本发明以自主设计的特异性靶向小鼠miRNA前体区域的探针为引物，先通过一轮超高重PCR预扩增，再以预扩增的产物为模板进行超高重PCR扩增，使RNA表达水平均一化，从而保证RNA靶向测序文库的均一性。极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本。

优选地，步骤S2所述超高重PCR预扩增的反应体系为KAPA 2G(2×)5μL，cDNA模板>100ng，50uM探针2.5～4μL，超纯水补充至10μL；反应程序为95℃变性10min，95℃15sec，65℃4min循环两次，95℃15sec，72℃4min循环13次。

优选地，步骤S3所述超高重PCR扩增反应体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array Loading Reagent 0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃2min，70℃20min，95℃10min；第2步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环15次；第3步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第4步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第5步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第6步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第7步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环5次。

优选地，步骤S2所述mmPCR预扩增与步骤S3所述mmPCR分别在特定区段富集捕获系统的两个不同部分中完成。

优选地，步骤S1所述RNA在提取过程中及逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品。

优选地，步骤S1所述RNA样品于65℃变性，使用随机引物将RNA逆转录合成cDNA，并使用磁珠纯化cDNA。

优选地，步骤S2所述超高重PCR预扩增产物在进行下一轮超高重PCR之前进行纯化，优选为磁珠纯化。

优选地，步骤S5所述回收纯化为割胶回收纯化200bp～500bp的电泳产物。

优选地，步骤S6所述高通量测序包括但不限于Illumina测序技术，优选为Illumina NextSeq 500测序仪、Illumina Miseq测序仪或Illumina Hiseq 2500测序仪。

更优选地，所述测序仪为Illumina NextSeq 500测序仪。

上述高通量测序获得的数据可基于标签序列区分不同的miRNA样品，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的序列片段比对靶基因，得到miRNA的修饰和编辑信息，定位和定量RNA修饰信息。

因此，上述方法在定位和定量RNA修饰信息方面的应用亦在本发明保护范围内。

同时，本发明还提供一种用于构建小鼠miRNA高通量测序文库的试剂盒，，所述试剂盒包括权利要求要求所述的563对探针，RNA抽提试剂，逆转录试剂，mmPCR所需试剂，Access Array Loading Reagent，高保真聚合酶，磁珠纯化试剂盒以及凝胶回收试剂盒。

具体的，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(1)小鼠总RNA提取

提取小鼠总RNA，RNA浓度和纯度用Nanodrop 2500光度计进行分析；在提取总RNA的过程中及下一步逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品以消除残留的基因组DNA。

(2)RNA逆转录成cDNA

将步骤(1)的RNA样品于65℃变性，按照逆转录试剂盒说明书，使用随机引物，将总RNA逆转录成cDNA，按照磁珠纯化试剂盒说明书纯化cDNA。

(3)mmPCR预扩增

把小鼠的563对特异性扩增探针混合在一起成为1个pool，对cDNA进行超高重PCR预扩增，预扩增反应体系为：2×KAPA 2G 5μL，cDNA模板>100ng，50uM探针2.5～4μL，超纯水补充至10μL；反应程序为：95℃变性10min，95℃15sec，65℃4min循环两次，95℃15sec，72℃4min共13个循环；磁珠纯化mmPCR预扩增产物。

(4)mmPCR

以预扩增产物为模板，将563对特异性扩增探针分为30个pool，每个pool包含8～12对探针，使用所有探针pool对miRNA进行超高重PCR(mmPCR)；芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array LoadingReagent 0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃2min，70℃20min，95℃10min；第2步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环15次；第3步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第4步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第5步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第6步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第7步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环5次；反应的同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头。

(5)Barcoding PCR

将超高重PCR产物稀释100倍，对mmPCR产物进行Barcoding PCR使每一个样品加上特有的标签序列(Barcode)。

(6)miRNA文库产物混合与纯化

将Barcoding PCR产物按比例混合进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收纯化200bp～500bp长度的产物，即构建好miRNA文库，测定miRNA文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测文库质量。

(7)Illumina测序

将得到的多个miRNA文库混合，进行高通量测序。

在本发明采用了超高重PCR(mmPCR)扩增法结合Illumina NextSeq 500高通量测序的建库测序方法，该方法以miRNA转录组为模板，使用自主合成的miRNA特异性探针pool，通过mmPCR原理对miRNA进行靶向扩增，扩增区域包括pri-miRNA上覆盖miRNA前体(pre-miRNA)的区域。扩增产物连接标签序列，进行Illumina测序文库制备和测序。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明基于mmPCR扩增技术，利用小鼠miRNA的序列信息特异性地设计出大量探针，能够特异性地靶向pri-miRNA上miRNA前体区域。

(2)本发明将自主设计的探针结合最新发展的mmPCR-seq高通量测序技术，发展出适用于构建miRNA文库的miR-mmRNA-seq高通量测序技术，能够高效并完整地构建小鼠pri-miRNA上的miRNA前体区域的转录组文库，极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，以及RNA靶向测序文库的均一性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本。

附图说明

图1为随机挑选的16对miRNA探针PCR测试结果电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为一系列片段大小为100bp～180bp的一条带，其中泳道M为分子量标记物，泳道1～16分别为16个miRNA探针的PCR产物电泳结果。电泳结果探针测试通过，可以用于mmPCR预扩增和mmPCR扩增。

图2为提取小鼠总RNA后检测RNA质量的电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示6个样本来源的总RNA，分别为片段大小1500bp～4700bp的两条带，其中泳道M为分子量标记物，泳道1～6分别为提取自6个样本的总RNA电泳结果。RNA质量合格即可进行下一步逆转录及之后的mmPCR-seq文库构建。

图3为Agilent BioAnalyzer 2100分析mmPCR扩增产物的结果示意图，显示文库片段大小为200bp～350bp。

图4为Barcoding PCR扩增产物电泳示意图。琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为一系列片段大小300bp～400bp的单一条带，其中泳道M为分子量标记物，泳道1～16为16个随机挑选的mmPCR产物通过Barcoding PCR分别连接了特定barcode后的电泳结果。之后通过磁珠纯化即基本完成了mmPCR-seq测序文库制备。

图5为miRNA文库Illumina NextSeq 500高通量测序结果示意图。Y轴为测序质量quality，测序质量高低以≥Q30的比例来衡量，越高质量越好。结果显示测序结果质量≥Q30的比例为100％。

图6为测序的覆盖深度和覆盖率示意图。X轴为测到的miRNA的数目，Y轴为每一个miRNA测到的read数。显示所有miRNA平均覆盖深度达到300×，所有miRNA覆盖率为90％。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 特定靶向小鼠中microRNA(miRNA)的探针及使用此批探针构建miRNA测序文库进行高通量测序的方法

1、设计探针

设计特异性扩增miRNA的超高重PCR探针，所述探针特异性靶向扩增小鼠pri-miRNA上覆盖的miRNA前体(pre-miRNA)的区域，所述探针共563对，其引物序列如表1所示，大部分探针扩增产物长度都在160～300bp。

表1靶向扩增小鼠miRNA前体区域的探针序列表

2、总RNA提取

提取小鼠总RNA，RNA浓度和纯度用Nanodrop 2500光度计进行分析；在提取总RNA的过程中及下一步逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品以消除残留的基因组DNA，提取的总RNA作为miR-mmPCR-seq建库的起始模板。

3、RNA逆转录成cDNA

将RNA样品于65℃变性，按照Superscript III试剂盒说明书、使用随机引物，将总RNA逆转录成cDNA。逆转录反应在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)上完成。按照AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)试剂盒说明书使用磁珠纯化逆转录产物cDNA。

4、mmPCR预扩增

把所有的miRNA特异性扩增探针混合在一起成为1个pool，按照KAPA 2G PCR Kits及Access Array Loading Reagent(Fluidigm)试剂盒说明书，对cDNA进行超高重PCR预扩增，预扩增反应体系为2×KAPA 2G 5μL，cDNA模板>100ng，50uM Pre-Primer 2.5～4μL，超纯水补充至10μL；反应参数为95℃变性10min，95℃15sec，65℃4min循环两次，95℃15sec，72℃4min共13个循环；mmPCR扩增反应在Fludigm Access Array特定区段富集捕获系统(Fluidigm)上完成。按照AxyPrep Mag PCR Clean-up(Axygen)试剂盒说明书使用磁珠纯化mmPCR预扩增产物。

5、mmPCR

把小鼠的特异性扩增探针随机分为48个pool，每个pool包含8～12对探针，按照KAPA 2G PCR Kits及Access Array Loading Reagent(Fluidigm)试剂盒说明书，使用所有探针pool对miRNA进行超高重PCR(mmPCR)，反应的体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array Loading Reagent0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃2min，70℃20min，95℃10min；第2步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环15次；第3步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第4步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第5步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环2次；第6步，95℃15sec，60℃30sec，72℃1min，循环8次；第7步，95℃15sec，80℃30sec，60℃30sec，72℃1min，循环5次。mmPCR反应在Fludigm Access Array特定区段富集捕获系统(美国Fluidigm公司)上完成。反应的同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头。

7、Barcoding PCR

将超高重PCR产物稀释100倍，按照Phusion试剂盒说明书，对mmPCR产物进行Barcoding PCR使每一个样品加上特有的标签序列(Barcode)，PCR反应在Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪(美国ABI公司)上完成。

8、miRNA文库产物混合与纯化

将Barcoding PCR产物按比例混合进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，按照Zymoclean Gel DNA Recovery Kit(Zymo)试剂盒说明书割胶回收纯化200bp～500bp长度的产物，即构建好miRNA文库。使用Qubit 3.0测定miRNA文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测文库质量。

9、Illumina测序

将得到的多个miRNA文库混合，使用Illumina测序试剂盒，按照试剂盒说明书，进行高通量测序。测序反应在Illumina NextSeq 500高通量测序仪(美国Illumina公司)上完成，输出数据。

10、数据分析

采用Illumina bcl2fastq软件进行测序原始数据提取。通过BWA软件将原始序列比对到基因组，通过samtools软件进行RNA编辑位点的提取。

结果如图6所示，显示5例样本测序的覆盖深度和覆盖率，显示所有miRNA平均覆盖深度达到300×，所有miRNA覆盖率为90％。表1显示每个样本能测到的miRNA种类达到80％。

通过本发明检测了5例小鼠样本，发现和定量了多个编辑位点得到的编辑位点与Sanger测序的结果是一致的，说明本发明的方法可行。