一种肺癌FGFR1基因的检测试剂盒及探针的制作方法

文档序号:14590163发布日期:2018-06-02 06:31阅读:370来源:国知局

本发明涉及疾病相关基因检测技术领域,具体是指一种肺癌FGFR1基因扩增的FISH检测方法和相关检测探针及试剂盒。



背景技术:

肺癌是发病率和死亡率增长最快,对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高,男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位,女性发病率占第二位,死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确,大量资料表明,长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。

根据肺癌的生长、侵犯及转移速度和范围以及对化疗药物和放射治疗的敏感性,临床将肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)及非小细胞肺癌(NSCLC),后者占肺癌发病率80%左右。只有合理应用手术、放疗、化疗、靶向治疗等方法,才能获得较好控制率,延长生存期。

在过去的几十年里,虽然科学家们不断地探索非小细胞肺癌(NSCLC)化疗和放疗的方法,但取得的成果仍不能令人满意,例如晚期肺癌患者的平均生存时间仍未超过一年,疗效不确定,部分患者会出现一些毒副反应,如恶心、呕吐等胃肠道反应,影响了生活质量,甚至中断治疗。传统的细胞毒性化学药物可比作是“杀敌一千,自损八百”,因而许多患者对此是谈之色变,而靶向治疗正是科学家们几十年来致力于分辨癌细胞与正常细胞之间分子生物学差异的临床研究成果。

所谓靶向治疗,就是通过基因或分子的选择,有针对性地杀死恶性肿瘤细胞,而几乎不影响正常细胞。这一划时代的生物肿瘤疗法的特点可以总结为4个字:“高效低毒”。一方面,靶向治疗大大提高了肿瘤治疗的疗效;另一方面,靶向治疗减少患者在治疗中的副作用,提高生活质量。

靶向治疗是指在分子生物学诊断的基础上,利用肺癌细胞和正常细胞之间存在的差异,有针对性地抑制肺癌细胞生长和增殖,例如,采用拮抗受体、抑制肿瘤生长所需的血管和阻断肿瘤生长的信号传导通路等方法来抑制肺癌细胞生长和增殖,从而达到治疗目的。

原癌基因(proto-oncogene)是细胞内与细胞增殖相关的基因,是维持机体正常生命活动所必须的,在进化上高度保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异,基因产物增多或活性增强时,使细胞过度增殖,从而形成肿瘤。FGFR1是一种和肺癌发病密切相关的位于人类8号染色体的原癌基因。FGFR1基因的扩增,对于肺癌的靶向治疗具有重要指导意义。

目前,市场上检测FGFR1基因扩增主要用PCR方法,由于检测的是肿瘤和正常细胞的混合物,因此结果不够准确,而市场上亦迫切需要一种更为准确的检测方法。



技术实现要素:

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足,提供一种肺癌FGFR1基因扩增的FISH检测方法,探针及试剂盒。该法设计周全,操作简单,特异性和敏感性高,可以快速,准确,直观地测出肺癌FGFR1基因的扩增,检测结果准确可靠,从而可作为医师对肺癌进行分子病理分型的参考依据,适用于大规模推广应用。

本发明采用的技术方案为:

一种肺癌相关FGFR1基因扩增的FISH检测的一组双色FISH探针,所述一组双色探针是(1)标记为红色的FGFR1基因探针(2)标记为绿色的8号染色体中心粒探针。其中FGFR1:Entrez Gene ID:2260。

本发明还提供了一种肺癌相关FGFR1基因扩增的FISH检测试剂盒,包括一组双色FISH探针,所述一组双色探针是(1)标记为红色的FGFR1基因探针(2)标记为绿色的8号染色体中心粒探针。其中FGFR1:Entrez Gene ID:2260。。

本发明还提供了一种肺癌FGFR1基因扩增的FISH检测方法,包括如下步骤:对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理,然后采用一组双色探针进行原位杂交,根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关基因的扩增;所述一组双色探针是(1)标记为红色的FGFR1基因探针(2)标记为绿色的8号染色体中心粒探针;其中FGFR1:Entrez Gene ID:2260。

本发明的有益效果在于:

本发明的肺癌FGFR1基因扩增FISH检测方法通过对肺癌组织石蜡切片进行常规预处理,然后采用一组双色探针进行原位杂交,根据检测到的荧光信号判断是否存在所述肺癌相关基因的扩增状态。本法设计周全,操作简单,特异性和敏感性高,可以快速,准确,直观地检测出肺癌相关FGFR1基因的扩增状态,检测结果准确可靠,从而可作为医师对肺癌进行精确分子病理分型的参考依据,适于大规模推广应用。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容,下面结合具体实施例作进一步说明。下列具体实施例采用的主要试剂,仪器和操作步骤如下:

实施例1

一、探针DNA的获取

1)划线接种:将携带有FGFR1基因和8号染色体中心粒的BAC菌种划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上,37℃培养过夜(约14小时)。

2)初始培养:次日挑取生长状态良好的单克隆菌种,接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中,放入37℃摇床,设置摇床速度约200rpm,培养6-8小时。

3)过夜培养:每1ml菌液转移至200ml培养体系,放置于37℃摇床,转速200rpm,培养过夜(约14-8小时)。

4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。

二、探针标记

1.酶切DNA:

1)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切

37℃孵育1小时,加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)(PH 7.5)终止反应,混匀,瞬时离心。

2)沉淀DNA:加入1/10体积的3M乙酸钠,2倍体积100%乙醇(-20℃),混匀,瞬时离心,-70℃,沉淀约2小时。

3)离心14000rpm,4℃,20分钟。用枪尖小心吸弃上清,加入100ul 70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。

4)用枪尖小心吸弃上清,干燥沉淀10分钟。用10μl的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时,转速800,将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。

2.连接反应:

采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记。

方法如下:

取避光的EP管,先加入水,最后加入DNase(10ng/μl)和DNA polymerase(酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液:

混匀,瞬时离心,14℃孵育过夜(9-12小时)。

次日加入5ul的0.5M的EDTA(PH 7.5)终止反应,混匀,瞬时离心,连接好的DNA放在-20℃避光保存。

3.沉淀DNA:

1)对标记好的DNA探针进行沉淀:加去离子水至总体积为300μl,再加入3M的乙酸钠(1/20总体积),再加入100%乙醇(-20℃)混匀,瞬时离心,-20℃,沉淀过夜。

2)次日离心14000rpm,4℃,20分钟。用枪尖小心吸弃上清,加入100ul的70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。用枪尖小心吸弃上清,室温避光干燥沉淀10分钟。

3)加入10ul的杂交缓冲液,在振荡器上连续震荡至少6小时,转速800,将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验。

4)将3)制作好的探针从4℃中拿出,放入56℃中孵育1小时,室温离心14000rpm,20分钟,将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中,4℃中保存,若长期不用探针应保存于-20℃。

三、杂交反应

1.肺癌组织石蜡切片预处理程序:

1)将载玻片浸入2%3-氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中5分钟。随后在丙酮及蒸馏水中漂洗,自然干燥载玻片。

2)从福尔马林固定石蜡包埋的肺癌组织中获取多块4微米切片,分别置于以上经氨基丙基三乙氧基硅烷处理过的载玻片上。

3)将组织片置于65℃下过夜烘烤

4)将组织切片浸入二甲苯中室温脱蜡2次。每次10分钟。随后浸入100%乙醇中5分钟。

5)将组织切片依次室温下置于100%乙醇,85%乙醇,70%乙醇中各2分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水3分钟,用无绒纸巾试干。

6)50C下用30%(w/v)酸性亚硫酸钠(Sodium bisulfite)处理组织切片20-30分钟。

7)室温下于2XSSC溶液中漂洗2次,每次5分钟。

8)取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 2XSSC得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)。将组织切片浸入蛋白酶K工作液中37℃孵育20-30分钟。

9)组织切片经蛋白酶K处理后,于2XSSC中漂洗2次,每次5分钟。

10)将组织切片浸入0.1M HCL中室温浸泡5-10分钟。于2XSS溶液中漂洗2次,每次5分钟。

11)将组织切片玻片依次浸入-20℃预冷的70%,85%,100%乙醇中各2分钟脱水。

12)将组织切片室温浸入丙酮溶液2分钟。

13)自然干燥玻片。

14)加热玻片至56℃。

2.杂交:

将玻片放入杂交仪中,84-90℃变性5分钟,47℃杂交过夜。

3.洗涤:

将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。

4.梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度。

5.放入己烷:异丙醇(60:40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟。

6.空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。

7.镜检:

在荧光显微镜下观察,利用蓝色滤镜观察绿色信号,利用绿色滤镜观察红色信号,利用双通道滤镜观察红绿融合的黄色信号。选择背景干净,杂交信号强烈,细胞核大小均一无重叠,核边界清晰,DAPI染色均一的区域拍照记录。

结果判断:

计数30个细胞,统计比值(比值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。常见异常类型:FGFR1位点扩增。

正常细胞:单个间期细胞中红色及绿色信号各2个。

FGFR1基因扩增异常细胞:单个间期细胞核中红色信号大于2,且绿色信号不少于2个。参考范围:FGFR1/CEN8(8号中心粒)两种探针,在中期染色体与间期核上均能杂交产生明亮的信号。FGFR1DNA探针杂交到人类8号染色体长臂,荧光信号为橘红色(Cy3),对照探针为CEN8,探针杂交信号位于人类8号染色体8p11.1-q11.1,覆盖整个着丝粒区域,荧光信号为绿色(FITC)。

比值《1.8为阴性结果,提示该样本无FGFR1基因扩增。

比值》2.2为阳性结果,提示样本中FGFR1基因发生扩增。

检测结果的解释:计数30个细胞,统计比值(比值=30个细胞中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数。比值《1.8为阴性结果,提示该样本无FGFR1基因扩增。比值》2.2为阳性结果。提示样本中FGFR1基因发生扩增。比值在1.8-2.2之间时,可以选择增加计数细胞至100个,或重做FISH实验来判断最终结果。

在此说明书中,本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是,很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此,说明书应被认为是说明性的而非限制性的。

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