本发明属于微藻生化工程技术领域，具体涉及一种利用亚临界水从螺旋藻湿藻泥中提取γ-亚麻酸的方法及其应用。
背景技术：
γ-亚麻酸(gamma-linolenicacid,gla)首次于1919年从柳叶菜科植物月见草中发现，为全顺式6,9,12-十八碳三烯酸，分子式c18h30o2，属ω-6系列多不饱和脂肪酸。常温条件下呈无色或淡黄色油状液体，不溶于水，易溶于石油醚、乙醚、正己烷等非极性溶剂。在空气中不稳定，尤其在高温条件下易发生氧化反应，在碱性条件下易发生双键位置及构型异构化反应，形成共轭多烯酸。gla是组成人体各组织生物膜的结构材料，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、降血脂、抗粥样动脉硬化、降血压、改善糖尿病并发症、减肥等广泛的药理作用，被誉为“21世纪功能性食品的主角”。1993年联合国粮农组织和世界卫生组织联合发表声明：鉴于gla的重要性和人类普遍缺乏的现状，决定在世界范围内专项推广gla及其代谢物。90年代以来美国、法国、日本等国家均立法规定，在指定的食品中必须添加gla及代谢物方可进行销售。
自然界中gla极其有限，其主要来源月见草油中，gla含量只在7%-10%，但月见草种子的产量和含油量随气候等外界条件的改变波动较大，远不能满足市场的需求。螺旋藻是一种多细胞的丝状蓝藻，主要生长在盐水湖中，属于蓝藻门、颤藻科、节旋藻属，在地球上已经存在35亿年，是最早的光合生物之一。螺旋藻营养丰富，除含有大量的蛋白质、多种维生素和矿物质外，多不饱和脂肪酸含量也很高，其gla含量占其脂肪酸的8%-25%，是很有前途的gla来源。
现有的螺旋藻gla的提取技术包括：低温尿素结晶法、超临界co2法、有机溶剂萃取法等。这些提取技术多停留在实验室阶段，存在工艺复杂、设备投资高、能耗高、有机物残留等问题，极大得限制了其工业化的应用。目前采用最多的是干藻粉的溶剂萃取法，而螺旋藻细胞中水含量高达60%以上，仅干燥过程的能耗就使螺旋藻生产出的gla附加值极低。因此，需要开发一种工艺简单，能耗较低，切实可行的从螺旋藻中提取gla的方法。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种螺旋藻γ-亚麻酸提取物的制备方法及其应用，本发明利用水作为萃取介质和水解反应剂，避免了有机溶剂的使用和回收，且本发明直接利用高含水的微藻细胞，省去微藻离心、干燥等高耗能环节。
经过大量试验和不懈努力，发明人最终获得了如下的技术方案：一种螺旋藻γ-亚麻酸提取物的制备方法，将微藻的湿藻泥加入至反应釜中，加入水作为提取介质并通入氮气，设置反应釜压力为15-25mpa，温度为250-300°c，反应时间10-30min，使水保持亚临界状态，所得提取物经真空冷冻干燥，可得到粉末状的螺旋藻γ-亚麻酸提取物，便于储藏和再加工；
所述微藻湿藻泥与提取介质水的最终体积比为1:1-20。
优选地，如上所述的一种螺旋藻γ-亚麻酸提取物的制备方法，所述湿藻泥含水量为40-90%。
优选地，如上所述的一种螺旋藻γ-亚麻酸提取物的制备方法，所述湿藻泥是通过预先离心或过滤培养介质获得。
一种螺旋藻γ-亚麻酸提取物的应用，可用于缓解和治疗pm2.5所致气道炎症。
与现有技术相比，本发明的优点为：
1、螺旋藻gla以细胞壁磷脂形式存在，本发明利用较为剧烈的亚临界条件，以期破坏螺旋藻的细胞壁和亚细胞壁，使细胞壁磷脂脱离并水解生成gla，实现快速高效的从螺旋藻湿藻细胞中提取gla。
2、亚临界水即作为溶剂也作为水解反应剂，环境友好度极高。提取原料可直接利用高含水的螺旋藻细胞，无需藻细胞的干燥环节，节省了大量干燥能耗。本发明gla提取率高、分离简单、易于放大。
3、经气相色谱进行定量测定，得到的γ-亚麻酸产率为9.0g/kg(gla/干重)。
附图说明
图1是小鼠肺组织分级评分
图2是小鼠肺泡灌洗液炎性细胞分类计数
图3是小鼠肺泡灌洗液细胞因子含量，其中图3-a为小鼠肺泡灌洗液il-4含量，图3-b为小鼠肺泡灌洗液il-5含量，图3-c为小鼠肺泡灌洗液ifn-γ含量，图3-d为小鼠肺泡灌洗液il-10含量。
图4是小鼠raw264.7细胞培养液中tnf-α和il-6含量。
图5是小鼠raw264.7细胞nfκb通路情况。
具体实施方式
为能清楚说明本发明方案的技术特点，下面结合具体实施例，对本发明进行阐述。但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
称取螺旋藻湿藻泥100g（含水量50%，初始总脂含量7.7%，初始gla含量1.2%），微藻与水之比为1:1，置于反应釜中密封，向反应釜中通入n2至1.5mpa，加热到260℃，加压到15mpa，反应时间20min，分离釜收集产物，gla得率0.9%，转化率75%。
螺旋藻湿藻泥通过预先经过离心处理所得，离心条件为3000rpm，20min。（补充）
实施例2
称取螺旋藻湿藻泥100g（含水量60%，初始总脂含量6.5%，初始gla含量1.1%，），加水140ml，微藻泥与水的体积比为1:5，置于反应釜中密封，向反应釜中通入n2至1.5mpa，加热到300°c，加压到20mpa，反应时间15min，分离釜收集产物，gla得率0.87%，转化率79%。
湿藻泥通过过滤培养介质获得，过滤方法为减压抽滤。
对实施例1制备的样品进行动物实验，证实螺旋藻亚临界水提取物拮抗pm2.5所致气道炎症的药理作用，具体方法和结果如下：
将雌性babl/c小鼠随机分为空白对照组、pm2.5对照组、螺旋藻亚临界水提取物小、中、大剂量组和地塞米松阳性对照组，连续处理12周，观察螺旋藻亚临界水提取物对pm2.5所致气道炎症的抑制作用。结果如下：
(1)螺旋藻亚临界水提取物抑制了pm2.5诱导的气道炎症
如图1所示，根据“肺组织炎症病理学分级评分标准”，观察小鼠肺组织分级评分。与空白对照组相比，模型组小鼠肺组织炎症评分显著提高（p<0.01）；螺旋藻亚临界水提取物小、中、高剂量组和地塞米松治疗组显著地降低了炎症评分（p<0.01，p<0.05）。
（2）螺旋藻亚临界水提取物抑制了pm2.5诱导的炎性细胞浸润
如图2所示，与空白对照组相比，pm2.5模型组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞含量明显升高（p<0.01），与pm2.5模型组对照组相比，螺旋藻亚临界水提取物可剂量依赖性降低炎症细胞总数及嗜酸性粒细胞数目（p<0.01），螺旋藻亚临界水提取物大剂量组可降低中性粒细胞、巨噬细胞（p<0.01,p<0.05）。
(3)螺旋藻亚临界水提取物可调节小鼠哮喘模型肺泡灌洗液中th1和th2细胞因子含量
如图3所示，与空白对照组相比，pm2.5模型组小鼠肺泡灌洗液中il-4、il-5、il-10和ifn-γ含量均显著升高（p＜0.01）。与pm2.5模型组相比，地塞米松组各细胞因子含量均显著降低（p＜0.01），螺旋藻亚临界水提取物剂量依赖性地降低了小鼠肺泡灌洗液中th2细胞因子il-4、il-5含量（p＜0.01，p＜0.05），升高th1细胞因子il-10、ifn-γ含量（p＜0.01）。
对实施例1制备的样品进行细胞试验，证实螺旋藻亚临界水提取物可改善lps所致细胞炎性反应，具体方法和结果如下：
将小鼠单核巨噬细胞raw264.7分为空白对照组、lps对照组、螺旋藻亚临界水提取物小、中、大剂量组，观察lps刺激下，螺旋藻亚临界水提取物对细胞的保护作用。结果如下：
(1)螺旋藻亚临界水提取物降低胞培养液中tnf-α和il-6含量
如图4所示，与空白对照组相比，lps模型组细胞培养液中tnf-α和il-6含量显著升高（p＜0.01）；与lps模型组相比，螺旋藻亚临界水提取物中、高剂量组降低细胞培养液中tnf-α（p＜0.01），微藻脂提物高剂量组降低细胞培养液中il-6含量（p＜0.01）。
(2)螺旋藻亚临界水提取物抑制细胞nfκb通路活化
如图5所示，与空白对照组相比，lps模型组p-ikk表达显著升高（p＜0.01），iκb表达显著降低（p＜0.01）；与lps模型组相比，螺旋藻亚临界水提取物高剂量组显著降低p-ikk表达（p＜0.01），螺旋藻亚临界水提取物高剂量组显著升高iκb表达（p＜0.01）。