单向式羊膜脱细胞方法与流程

本发明涉及组织工程技术领域，尤其是涉及一种单向式羊膜脱细胞方法。

背景技术：

羊膜，即人胎盘粘膜，为胎膜的最内层，与绒毛膜相贴紧密，正常羊膜厚为0.02-0.5mm，光滑，半透明薄膜，具有一定的韧性，无血管、神经和淋巴管，由单层上皮细胞层、致密的基底膜以及无血管的基质等成份组成。羊膜基质中含有大量的胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白等成份，由于其含有生长因子、极低的免疫原性、抗菌、减轻炎症、抗纤维化、抑制新生血管形成等特性，在医疗领域有100多年的应用历史，其主要用途有眼表疾病修复、鼓膜损伤修补、烧伤后表面覆盖等。

目前临床上使用的羊膜主要为新鲜羊膜、深冷保存羊膜和脱细胞羊膜(也称羊膜脱细胞基质)。国外多采用深低温(-80℃)保存的含有上皮细胞的羊膜，国内已有在临床应用的干燥常温保存的含上皮细胞的羊膜，但技术工艺要求复杂，且由于羊膜上皮细胞的存在，在眼科，羊膜植片可能会发生植片排斥反应、植片脱落、移位溶解、感染等并发症，其安全性存在一定的风险。羊膜脱细胞基质不含羊膜上皮细胞，保留了羊膜基底膜与基质层，它的主要成分是ⅲ、ⅳ及ⅴ型胶原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白，是一种天然的细胞外基质，是良好的组织工程生物载体材料。但作为同种异体生物组织支架材料，应用于临床的主要问题在于要克服其内在细胞所带来的免疫原性。

常用的羊膜脱细胞处理方法是采用表面活性剂或表面活性剂结合机械力刮除，胰酶酶解及物理方法。

公开号为cn103114073b的中国专利公开了一种人羊膜的脱细胞方法，其采用表面活性剂tritonx-100结合胰脂酶和dna酶，用浸泡震荡方式脱除羊膜中的细胞，但由于羊膜较薄，在溶液中极易卷曲(或扭曲)形成空泡，漂浮在溶液上表面而无法有效接触处理溶液，不能达到完全脱细胞效果，且对羊膜基质的力学和化学等性能有不同程度的损伤。

公开号为cn1594555a的中国专利公开了羊膜3d基质组织工程支架羊膜平铺固定完全脱细胞方法及装置，其采用先用胰蛋白酶浸泡对羊膜脱细胞处理，再将浸泡后的羊膜平铺在固定装置上，通过旋转体使胰蛋白酶溶液旋动进而再次脱细胞。胰蛋白酶对细胞外基质有破坏作用且不易去除，制备过程中可能会产生二次污染，并且该发明采用先浸泡酶处理再平铺酶处理，过度酶解会破坏羊膜基质的蛋白结构及韧性。此外，该固定装置复杂，不利于大规模生产。

公开号为cn107233623a的中国专利公开了一种可用于组织工程皮肤生物支架的脱细胞羊膜的制备方法。首先对羊膜进行漂洗消毒，然后浸泡于dmem和甘油中-80℃保存6个月；然后将浸泡的羊膜从-80℃到37℃反复冻融2～4次，随后将dmem和甘油洗去在trypsin-edta中过夜孵育；然后用含有血清的dmem对孵育的羊膜进行终止消化，之后用pbs冲洗，冻干后获得脱细胞羊膜。将反复冻融的物理脱细胞方法和胰酶消化的化学脱细胞方法相结合，并调整各工艺步骤相适应，促使羊膜中的细胞被高效彻底地去除且避免机械性损伤，同时保留了羊膜中较多的细胞因子。但是该专利公开的方法周期太长，步骤繁琐。

羊膜的主要细胞位于羊膜上皮层，而基底膜无细胞，基质层只有极少量细胞，而采用单纯的浸泡震荡处理，虽然去除了羊膜上皮面的细胞，但基质层也同样遭受脱细胞试剂的处理，这对基底膜和基质层的结构和成分产生明显损伤。脱细胞处理不只是简单选取脱细胞方法，更应该结合所用组织的结构特点进行无损基质的处理方式。怎样只去除羊膜上皮细胞和保护羊膜基底膜及基质层结构，现有技术中都没有给出解决方案。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种单向式羊膜脱细胞方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种单向式羊膜脱细胞方法，包括以下步骤：

a)新鲜羊膜的剥离和清洗；

b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；

c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；

d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；

e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜，即人羊膜细胞外基质支架材料。

在本发明的一个实施方式中，所述新鲜羊膜是健康的人胎盘粘膜。

所述健康是指乙肝病毒、丙肝病毒、衣原体、人免疫缺陷病毒、梅毒检测均为阴性。

在本发明的一个实施方式中，所述剥离是指将羊膜和绒毛膜与胎盘分离，再将绒毛膜剥离去除，并用无菌镊子去除残留凝胶状物质。

将羊膜和绒毛膜与胎盘分离，再将绒毛膜剥离去除，并用无菌镊子去除残留凝胶状物质可以采用常规的生物学方法。

在本发明的一个实施方式中，步骤a)所述清洗指用无菌的0.9％氯化钠注射液在4-37℃条件下对剥离后的羊膜进行清洗，直至羊膜无血丝、呈透明状。

在本发明的一个实施方式中，步骤b)所述将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上的方法为：将羊膜平铺在支撑体的平面上，用弹性圈将平铺后羊膜的边缘固定在支撑体侧面的凹槽中。

所述弹性圈指医用弹性圈，包括但不限于弹性医用橡皮圈、或医用橡皮筋、或医用乳胶管等。

所述支撑体形状包括长方体、正方体、梯形体、圆柱体、圆台、椭球体等，

所述支撑体优选为没有棱角的形状，若所述支撑体为含有棱角的形体，将棱角由直角变为弧形。

所述支撑体材质为医用级塑料或医用级不锈钢。

在本发明的一个实施方式中，将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上时，将羊膜毛面(即羊膜的基质层)向下平整铺在支撑体表面。

在本发明的一个实施方式中，将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理，可选用的实施方式包括：将b)步骤处理后平铺在支撑体上的羊膜放入含脱细胞溶液的带盖容器内处理，带盖容器为医用级塑料或医用级不锈钢。处理时需要连同支撑体一起放入脱细胞溶液中，支撑体的目的是保证羊膜呈平铺状态，且保证羊膜毛面(即羊膜的基质层)不直接与溶液接触，而溶液仅仅有少量通过羊膜上皮层渗透到羊膜的基质层。

在本发明的一个实施方式中，所述脱细胞溶液包括主成分及配制溶液，所述主成分选择tryple^tmselectenzyme(一种胰蛋白酶替代物)、胰蛋白酶、中性蛋白酶、非离子型去污剂、两性离子去污剂中的一种或多种的组合；

所述配制溶液为无菌的0.9％氯化钠注射液、磷酸盐缓冲液、d-hanks溶液或hepes溶液。

所述非离子型去污剂选择tritonx-100、tween-80等。

所述两性离子去污剂选择3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(chaps)、十二烷基二甲基羟丙基磺基甜菜碱等。

本发明中，脱细胞剂主成分包括tryple^tmselectenzyme(一种胰蛋白酶替代物)、胰蛋白酶、中性蛋白酶、非离子型去污剂、两性离子去污剂等，这些成分都能去除细胞，其脱除细胞原理都是通过破坏细胞膜结构而脱除细胞(酶类的作用是水解膜蛋白，破坏细胞膜与组织基质之间连接而去除细胞，去污剂类的作用是破坏细胞膜上蛋白质-蛋白质、蛋白质-脂质、脂质-脂质之间的连接，将细胞膜蛋白、脂质等包裹起来形成胶团而去除细胞)。

在本发明的一个实施方式中，将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理的条件为：在4-37℃下震荡处理1min-48h。脱细胞处理时震荡的目的是保证溶液的充分混匀和溶液与组织的充分接触。

在本发明的一个实施方式中，将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理，可选用的实施方式包括：将在脱细胞溶液处理后，仍然平铺在支撑体上的羊膜放入含核酸酶溶液的带盖容器内处理。带盖容器为医用级塑料或医用级不锈钢。

在本发明的一个实施方式中，所述核酸酶溶液是全能型核酸酶溶液或广谱型核酸酶溶液，或dna酶和rna酶的混合溶液，

全能型核酸酶溶液或广谱型核酸酶溶液选自supernuclease、benzonasenuclease、biolonasenuclease等。

本发明中，核酸酶溶液包括全能型核酸酶溶液或广谱型核酸酶溶液，或dna酶和rna酶的混合溶液等，这些核酸酶的作用相同，都是分解细胞释放的dna和rna。

脱细胞试剂的作用是破坏组织中的细胞膜及细胞内的其他膜结构，断裂细胞膜与组织基质之间连接，使细胞内成分释放出来。核酸酶溶液的作用是分解细胞释放出来的dna和rna。本发明所选脱细胞试剂均为温和型试剂，对组织的基底膜和基质层的损伤极小，基底膜结构致密而基质层结构相对松散，采用单向处理方式更进一步保护了基质层的结构和成分。核酸酶为靶向酶，只消化dna和rna这种特定底物，不对基底膜和基质层的结构和成分产生损伤。

脱细胞剂与核酸酶溶液的浓度是一个重要的指标，tryple^tmselectenzyme浓度为0.001％-5％(v/v)，优选0.005％-0.25％(v/v)；胰蛋白酶浓度为0.001％-5％(v/v)，优选0.005％-0.25％(v/v)；中性蛋白酶浓度为0.001％-5％(v/v)，优选0.005％-0.25％(v/v)；非离子型去污剂(如tritonx-100，tween-80等)浓度为0.001％-5％(v/v)，优选0.005％-0.5％(v/v)；两性离子去污剂(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(chaps)，十二烷基二甲基羟丙基磺基甜菜碱等)浓度为0.001％-5％(v/v)，优选0.005％-0.5％(v/v)。全能型(或广谱型)核酸酶溶液浓度为0.1-2000u/ml，优选1-200u/ml；dna酶和rna酶的混合溶液浓度为50-10000u/ml，优选200-8000u/ml。

在本发明的一个实施方式中，将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理的条件为：在37℃环境中下震荡处理1-48小时。

在本发明的一个实施方式中，步骤d)与步骤e)中的洗涤条件为：用无菌的0.9％氯化钠注射液在4-37℃环境下对处理后的羊膜进行震荡清洗。

步骤e)洗涤处理后的羊膜需要从支撑体上取下来，具体保存方式有多种，如冷冻干燥保存、甘油中-80℃或2-8℃保存、培养基中-80℃保存等。

本发明第二方面，提供一种单向式羊膜脱细胞处理辅助支撑体，所述支撑体包括一作为支撑面的平面，以及位于支撑面侧面的凹槽，所述凹槽用于通过弹性圈将平铺后羊膜的边缘固定在支撑体侧面的凹槽中。

所述支撑体形状包括长方体、正方体、梯形体、圆柱体、圆台、椭球体等，

所述支撑体优选为没有棱角的形状，若所述支撑体为含有棱角的形体，将棱角由直角变为弧形。

所述支撑体材质可以采用医用级塑料或医用级不锈钢。

所述弹性圈指医用弹性圈，包括但不限于弹性医用橡皮圈、或医用橡皮筋、或医用乳胶管等。

本发明提供的支撑体使用时，将羊膜平铺在支撑体的平面上，用弹性圈将平铺后羊膜的边缘固定在支撑体侧面的凹槽中。

对于支撑体，其材质不限于如医用级塑料或医用级不锈钢这种刚性物体，也可以是软性的医用级薄膜材料，将羊膜平铺在这种材料表面上，采用缝线将组织边缘固定或刚性条(或磁条)加压固定组织边缘的方式。

本发明第三方面，提供一种人羊膜细胞外基质支架材料，所述人羊膜细胞外基质支架材料采用本发明第一方面的单向式羊膜脱细胞方法获得。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)结合了羊膜结构特点，采用单向式脱细胞方法，将羊膜基质层保护起来，使羊膜平铺展开，上皮面充分接触脱细胞溶液，有利于彻底脱出羊膜上皮细胞，而基质层极少量的细胞则由于组织的渗透性只接触少量脱细胞溶液而被脱除。

(2)该脱细胞方法采用平铺方式更有利于羊膜上皮细胞的脱除，有针对性地保护了基底膜和基质层结构，且采用了温和型脱细胞试剂，更大程度上保存了羊膜成分和结构。

(3)该脱细胞方法操作简单、方便，保证了工艺的稳定性，有利于大规模生产。

附图说明

图1为单向式羊膜脱细胞处理辅助支撑体结构示意图。

图2是新鲜羊膜组织的he染色图片(200倍)。

图3是经过脱细胞处理后的羊膜组织的he染色图片(200倍)，图中显示经过本发明处理后，羊膜上皮面细胞被完全去除，基质结构无明显损伤。

具体实施方式

本发明用单向式脱细胞装置使羊膜脱细胞更彻底、大大提高批次生产的稳定性，克服了传统上采用简单浸泡震荡带来的不充分脱细胞和损伤基质的缺点。

本发明单向式羊膜脱细胞方法，包括以下步骤：

a)新鲜羊膜的剥离和清洗；

b)将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上；

c)将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理；

d)将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理；

e)将d)步骤处理的羊膜洗涤后得到人脱细胞羊膜，即人羊膜细胞外基质支架材料。

所述新鲜羊膜是健康的人胎盘粘膜。所述健康是指乙肝病毒、丙肝病毒、衣原体、人免疫缺陷病毒、梅毒检测均为阴性。

所述剥离是指将羊膜和绒毛膜与胎盘分离，再将绒毛膜剥离去除，并用无菌镊子去除残留凝胶状物质。

步骤a)所述清洗指用无菌的0.9％氯化钠注射液在4-37℃条件下对剥离后的羊膜进行清洗，直至羊膜无血丝、呈透明状。

步骤b)所述将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上的方法为：将羊膜平铺在支撑体的平面上，用弹性圈将平铺后羊膜的边缘固定在支撑体侧面的凹槽中。所述弹性圈指医用弹性圈，包括但不限于弹性医用橡皮圈、或医用橡皮筋、或医用乳胶管等。所述支撑体形状包括长方体、正方体、梯形体、圆柱体、圆台、椭球体等，所述支撑体优选为没有棱角的形状，若所述支撑体为含有棱角的形体，将棱角由直角变为弧形。所述支撑体材质为医用级塑料或医用级不锈钢。

将步骤a)所得羊膜平铺固定在具有平面的支撑体上时，将羊膜毛面(即羊膜的基质层)向下平整铺在支撑体表面。

将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理，可选用的实施方式包括：将b)步骤处理后平铺在支撑体上的羊膜放入含脱细胞溶液的带盖容器内处理，带盖容器为医用级塑料或医用级不锈钢。

所述脱细胞溶液包括主成分及配制溶液，所述主成分选择tryple^tmselectenzyme(一种胰蛋白酶替代物)、胰蛋白酶、中性蛋白酶、非离子型去污剂、两性离子去污剂中的一种或多种的组合；

所述配制溶液为无菌的0.9％氯化钠注射液、磷酸盐缓冲液、d-hanks溶液或hepes溶液。

所述非离子型去污剂选择tritonx-100、tween-80等。

所述两性离子去污剂选择3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(chaps)、十二烷基二甲基羟丙基磺基甜菜碱等。

将b)步骤处理的羊膜放入脱细胞溶液中处理的条件为：在4-37℃下震荡处理1min-48h。

将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理，可选用的实施方式包括：将在脱细胞溶液处理后，仍然平铺在支撑体上的羊膜放入含核酸酶溶液的带盖容器内处理。带盖容器为医用级塑料或医用级不锈钢。

所述核酸酶溶液是全能型核酸酶溶液或广谱型核酸酶溶液，或dna酶和rna酶的混合溶液，全能型核酸酶溶液或广谱型核酸酶溶液选自supernuclease、benzonasenuclease、biolonasenuclease等。

核酸酶溶液包括全能型核酸酶溶液或广谱型核酸酶溶液，或dna酶和rna酶的混合溶液等。

将c)步骤处理的羊膜洗涤后放入核酸酶溶液中处理的条件为：在37℃环境中下震荡处理1-48小时。

步骤d)与步骤e)中的洗涤条件为：用无菌的0.9％氯化钠注射液在4-37℃环境下对处理后的羊膜进行震荡清洗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

取健康产妇胎盘，从胎盘上剥取羊膜，在生物安全柜中用0.9％生理盐水多次清洗，用无菌医用镊子剥离去除残留绒毛膜物质，并除去血液成分。将羊膜平铺在无菌正方形体单向式脱细胞装置(20x20x2cm，图1所示，图1中1指的是平面，2指的是侧面的凹槽)上(基质层向下)，并用无菌弹性医用乳胶管将羊膜边缘裹在装置凹槽上固定，用无菌医用剪刀沿凹槽处剪除未固定的羊膜。将固定好的羊膜放入tryple^tmselectenzyme溶液中，37℃震荡处理2h。用无菌生理盐水震荡清洗5次后，再将固定好的羊膜放入supernuclease溶液中，37℃震荡处理3h。最后用无菌生理盐水震荡清洗5次得到人羊膜细胞外基质支架材料。

检测评价：

(1)he染色：采用常规的he组织学病理切片对新鲜羊膜和脱细胞羊膜进行检测，结果显示新鲜羊膜上皮层含有一排细胞(图2所示)，而本发明处理羊膜则无细胞残留(图3所示)。

(2)dna残留量检测：称取适量重量羊膜样品，按照dneasyblood&tissuekit提纯dna，再用picogreendsdnaassaykit测定dna残留量。经检测新鲜羊膜dna含量为296.15±21.37ng/mg，而经过本发明处理后的羊膜的dna残留量为6.92±0.56ng/mg，具有显著性差异。

(3)拉伸强度测定：将新鲜羊膜和脱细胞处理羊膜裁成板材状，在万能材料试验机上将将其拉断，计算羊膜材料的拉伸强度。经测定，新鲜羊膜拉伸强度为8.71±1.55mpa，经过本发明处理后的羊膜的拉伸强度为7.33±1.86mpa。经过本发明处理后羊膜的拉伸强度没有显著改变。

(4)胶原蛋白含量测定：羊膜用含有1mg/ml胃蛋白酶的0.5m醋酸溶解羊膜，按照sircolsolublecollagenassaykit测定羟脯氨酸含量，最后计算胶原蛋白含量。经检测，新鲜羊膜胶原蛋白含量为59.61±0.64％，经过本发明处理后羊膜胶原蛋白含量为78.53±0.88％。脱细胞处理去除了细胞蛋白、脂类等成分，而保留了羊膜纤维的主体成分，提高了胶原蛋白的纯度，故胶原蛋白含量有提高。

(5)透明度测定：在光下用肉眼观察羊膜透明性。本发明方法制备得到的脱细胞生物羊膜外观呈半透明性薄膜。

实施例2：

取健康产妇胎盘，从胎盘上剥取羊膜，在生物安全柜中用0.9％生理盐水多次清洗，用无菌医用镊子剥离去除残留绒毛膜物质，并除去血液成分。将羊膜平铺在无菌圆柱体形单向式脱细胞装置(直径为15cm，高为2cm)上(基质层向下)，并用无菌弹性医用橡皮圈将羊膜边缘裹在装置凹槽上固定，用无菌医用剪刀沿凹槽处剪除未固定的羊膜。将固定好的羊膜放入中性蛋白酶溶液中，37℃震荡处理30min。用无菌生理盐水震荡清洗5次后，再将固定好的羊膜放入supernuclease溶液中，37℃震荡处理1h。最后用无菌生理盐水震荡清洗5次得到人羊膜细胞外基质支架材料。

检测评价：he染色显示经过本发明处理后的羊膜无细胞残留，外观呈半透明状，dna含量、胶原蛋白含量和拉伸强度结果如下：

经过本发明处理的羊膜核酸残留较低，较好的保留了羊膜基质的力学性能和主要结构成分。

实施例3：

取健康产妇胎盘，从胎盘上剥取羊膜，在生物安全柜中用0.9％生理盐水多次清洗，用无菌医用镊子剥离去除残留绒毛膜物质，并除去血液成分。将羊膜平铺在无菌长方形体单向式脱细胞装置(20x15x3cm)上(基质层向下)，并用无菌弹性医用橡皮圈将羊膜边缘裹在装置凹槽上固定，用无菌医用剪刀沿凹槽处剪除未固定的羊膜。将固定好的羊膜放入chaps溶液中，37℃震荡处理12h。用无菌生理盐水震荡清洗5次后，再将固定好的羊膜放入benzonasenuclease溶液中，37℃震荡处理8h。最后用无菌生理盐水震荡清洗5次得到人羊膜细胞外基质支架材料。

检测评价：he染色显示经过本发明处理后的羊膜无细胞残留，外观呈半透明状，dna含量、胶原蛋白含量和拉伸强度结果如下：

经过本发明处理的羊膜核酸残留较低，较好的保留了羊膜基质的力学性能和主要结构成分。

实施例4：

取健康产妇胎盘，从胎盘上剥取羊膜，在生物安全柜中用0.9％生理盐水多次清洗，用无菌医用镊子剥离去除残留绒毛膜物质，并除去血液成分。将羊膜平铺在无菌方形体单向式脱细胞装置(10x10x3cm)上(基质层向下)，并用无菌弹性医用橡皮筋将羊膜边缘裹在装置凹槽上固定，用无菌医用剪刀沿凹槽处剪除未固定的羊膜。将固定好的羊膜放入tryple^tmselectenzyme和tritonx-100的混合溶液中，37℃震荡处理1h。用无菌生理盐水震荡清洗5次后，再将固定好的羊膜放入dna酶和rna酶的混合溶液中，37℃震荡处理24h。最后用无菌生理盐水震荡清洗5次得到人羊膜细胞外基质支架材料。

检测评价：he染色显示经过本发明处理后的羊膜无细胞残留，外观呈半透明状，dna含量、胶原蛋白含量和拉伸强度结果如下：

经过本发明处理的羊膜核酸残留较低，较好的保留了羊膜基质的力学性能和主要结构成分。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。