本发明涉及生物工程中早发冠心病相关基因相关技术领域，是一种早发冠心病致病基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒，所述体外检测早发冠心病致病基因的试剂在制备用于体外检测早发冠心病致病基因的制剂或试剂盒中的应用。
背景技术：
目前研究表明，冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是一种多基因疾病，它的遗传基础不是一对等位基因，而是多对等位基因。这些等位基因的相互作用促成了冠心病易感性的个体差异。但是对于家族性早发冠心病（男性<55岁，女性<65岁)，有学者认为可能是一种单基因遗传病。如aryamani1etal.在一个早发冠心病家系中发现lrp6基因突变是该家族中早发冠心病的致病基因，并呈现常染色体显性遗传规律。该基因突变在其他400例冠心病患者中均未被检测到（其研究成果发表在science杂志上）。2014年，keramatiar等人又发现dyrk1b基因突变为家族性代谢综合征以及早发冠心病的致病基因，该基因的错义突变（r102c）导致代谢综合征以及早发冠心病家系中患病个体基因表达及相应蛋白功能异常，从而导致代谢综合征的发生并增加早发冠心病的易感性，并呈常染色体显性遗传规律（研究结果发表在newenglandjournalofmedicine上）。我们前期的研究也发现recql5基因为早发冠心病的致病相关基因，该基因的一个新的移码突变在所有的患病个体中均可以检测到，但是在未患病的个体中均未发现该突变位点。因此基于家系的连锁分析更有助于发现冠心病新的致病相关基因。
基因位于10q24.3，有8个外显子及7个内含子，主要在肾上腺及性腺表达。cyp17a基因编码p450c17蛋白，该酶属于细胞色素p450超家族酶之一，催化许多反应，包括药物代谢及胆固醇、类固醇和其他脂类的合成，它含有17α-羟化酶和17,20-碳链裂解酶两种酶活性，是肾上腺及性腺类固醇激素(包括性激素)合成的关键酶之一。
技术实现要素：
本发明提供了一种早发冠心病致病基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的：一种早发冠心病致病基因，即c.987c/del位点突变的cyp17a基因，c.987c/del位点突变的cyp17a基因的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的：一种体外检测技术方案之一所述的早发冠心病致病基因的试剂，该试剂用于检测cyp17a基因c.987c/del位点的突变，该试剂包括如下引物：
上游引物：5’taggggacatctttggggctg3’；
下游引物：5’tcactgatagttggtgtgcggc3’。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进：
上述该试剂用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的：一种含有技术方案之二所述的体外检测早发冠心病致病基因的试剂的制剂或试剂盒，其特征在于该制剂或试剂盒包含pcr扩增酶及相应缓冲液。
本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的：一种体外检测早发冠心病致病基因的试剂在制备用于体外检测早发冠心病致病基因的制剂或试剂盒中的应用。
下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进：
上述该制剂或试剂盒包含pcr扩增酶及相应缓冲液。
本发明公开了早发冠心病相关基因以及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用，该体外检测早发冠心病相关基因的制剂或试剂盒除了可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性外，还可以用于检测、预防、诊断或治疗早发冠心病，从而降低冠心病的发生率，对预防和治疗冠心病具有重大的意义。
附图说明
附图1为本发明的c.987c/del位点的测序图谱，其显示待测个体c.987c/del位点的基因型为gc/gc纯合子。
附图2为本发明的c.987c/del位点的测序图谱，其显示待测个体的c.987c/del位点为gc/g-杂合子。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明，实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。除非特别说明，本发明中的%均为质量百分数；除非特别说明，制备过程在常温、常压状态下进行；除非特别说明，本发明中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，本发明中采用的试验条件为本技术领域常规试验条件；除非特别说明，本发明中所用试剂均为市购；除非特别说明，本发明中的水为去离子水；除非特别说明，本发明中的溶液均为溶剂为水的水溶液，例如，若未做特别说明，盐酸溶液为盐酸水溶液。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行：如sambrook等人所著的《分子克隆：实验手册》(newfork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1，一种早发冠心病相关基因即c.987c/del位点突变的cyp17a基因，c.987c/del位点突变的cyp17a基因的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示。
含有cyp17a的基因的待测样品可以从来自实验者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发、活组织检查和尸体解剖材料的细胞，优选来自血液。
实施例2，一种体外检测早发冠心病致病基因的试剂，该试剂用于检测cyp17a基因c.987c/del位点的突变，该试剂包括如下引物：
上游引物（如序列表seqidno：2所示）：5’taggggacatctttggggctg3’；
下游引物（如序列表seqidno：3所示）：5’tcactgatagttggtgtgcggc3’。
本领域普通技术人员已知，本发明所述的突变位点为单核苷酸多态性（snp）位点，即基因组序列中单核苷酸发生改变；核苷酸酸序列的差异可以体现在dna水平上或者rna水平上，所以，本发明的早发冠心病相关基因可以体现在dna水平，rna水平上，优选dna水平，更优选基因组dna。
由于早发冠心病是一种单基因疾病，因此常常采用家系连锁分析的方法。所以本发明采用家系连锁分析研究。所述家系连锁分析就是在采用收集的典型早发冠心病家系汇总检测该基因的突变位点。
本发明在一个早发冠心病家系中经过大量的实验，最后以确凿的证据证明了具有本发明的c.987c/del位点的cyp17a基因为早发冠心病的致病基因，携带该突变型等位基因的个体均在较早的年龄患冠心病。
本实施例2所述的体外检测早发冠心病致病基因的试剂能够用于体外检测具有本发明的c.987c/del位点的cyp17a基因。
实施例3，作为上述实施例2的优选，该试剂为用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。
实施例4，一种含有体外检测早发冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，该制剂或试剂盒包含pcr扩增酶及相应缓冲液。
本发明检测c.987c/del位点的早发冠心病相关基因的制剂或试剂盒可以用于体外检测早发冠心病相关基因的多态性；c.987c/del位点突变的冠心病相关基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病；体外检测早发冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。
实施例5，一种体外检测早发冠心病致病基因的试剂在制备用于体外检测早发冠心病致病基因的制剂或试剂盒中的应用。
本发明检测c.987c/del位点突变的早发冠心病相关基因的制剂或试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的突变；c.987c/del位点突变的早发冠心病相关基因的制剂或试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗早发冠心病；体外检测早发冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗早发冠心病。
实施例6，作为上述实施例5的优选，试剂盒还包含pcr扩增酶及相应缓冲液。
实施例7，研究对象选取1个早发冠心病家系的三代成员，其中早发冠心病患者11例，均在50岁之前患冠心病。对照者为该家系中未患病的个体，共24例。
采用聚合酶链反应-直接测序的方法检测本发明的早发冠心病相关基因c.987c/del位点的突变。
方法：pcr反应体系(50μl)：基因组模板dna50ng(来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的dna用苯酚-氛仿法或者用盐析法提取出来即可)、2*powdertaqpcrmastermix25ul,21ulof去离子水，上、下引物各1ul,在96孔pcr自动循环仪上进行pcr反应，pcr循环参数：96℃预变性5分钟；经94℃30秒，61.0℃30秒，72℃1分钟；循环35周后于72℃延伸10分钟。引物如下:
上游引物：5’taggggacatctttggggctg3’；
下游引物：5’tcactgatagttggtgtgcggc3’。
扩增产物长度为157碱基，将扩增直接在测序仪上进行测序。测序条件参见生产厂家的操作手册。
测序结果：如图1、2所示，其中野生型个体显示c.987c/del位点的基因型为gc/gc纯合子；突变型显示待测个体的c.987c/del位点为gc/g-杂合子。
实施例8，体外检测早发冠心病相关基因即cyp17a基因的试剂盒，
该试剂盒包含:
1）扩增c.987c/del位点的引物：
上游引物：5’taggggacatctttggggctg3’；
下游引物：5’tcactgatagttggtgtgcggc3’；
2）pcr扩增酶及相应缓冲液；
3）测序相应的图谱。
综上所述，本发明公开了早发冠心病相关基因以及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用，该体外检测早发冠心病相关基因的制剂或试剂盒除了可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性外，还可以用于检测、预防、诊断或治疗早发冠心病，从而降低冠心病的发生率，对预防和治疗冠心病具有重大的意义。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
序列表
<110>新疆医科大学第一附属医院
<120>早发冠心病致病基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用
<130>
<160>3
<170>
<210>1
<211>1801
<212>mrna
<213>人类（homosapiens）
<400>1
atgtgggagctcgtggctctcttgctgcttaccctagcttatttgttttggcccaagaga60
aggtgccctggtgccaagtaccccaagagcctcctgtccctgcccctggtgggcagcctg120
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ggccccatctattcggttcgtatgggcaccaagactacagtgattgtcggccaccaccag240
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atcggtgagtttgctgtggacaagggcacagaagttatcatcaatctgtgggcgctgcat1200
cacaatgagaaggagtggcaccagccggatcagttcatgcctgagcgtttcttgaatcca1260
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tcctgtataggtgagatcctggcccgccaggagctcttcctcatcatggcctggctgctg1380
cagaggttcgacctggaggtgccagatgatgggcagctgccctccctggaaggcatcccc1440
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gaagcccaggctgagggtagcacctaaaggctgtaactcacagcccctgtccaccctatg1560
tggccccacaacacagatttagagatacaaccccccacccttctccgccattcttcccta1620
ctcccaacccactctgccttctttttcagcttgtggcaatgccagtgatgtgcataaaca1680
gtttttttttttccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1740
aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1800
a1801
<210>2
<211>21
<212>mrna
<213>人工序列
<400>1
taggggacatctttggggctg21
<210>3
<211>22
<212>mrna
<213>人工序列
<400>1
tcactgatagttggtgtgcggc22