屈曲指致病基因的检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种屈曲指致病基因的检测试剂盒及其应用，其中检测试剂盒包括引物，该引物根据TLN2基因所有外显子及其外显子-内含子交界区序列设计，引物用于PCR扩增，PCR扩增的产物包括TLN2基因外显子及其外显子-内含子交界区的核苷酸序列。检测试剂盒可应用于屈曲指致病基因的检测，通过检测试剂盒检测人的TLN2基因编码区序列是否存在突变，确定所述TLN2基因为屈曲指致病基因，检测方便、准确率高。
【专利说明】屈曲指致病基因的检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测【技术领域】，尤其涉及一种屈曲指致病基因的检测试剂盒，还 涉及该检测试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002] 屈曲指（camptodactyly，MIM114200)是指先天性或发育中出现的1或2个第5指 在近指端关节的永久性弯曲挛缩的手指畸形，其他手指可能受累，但一般应涉及小指。该畸 形对手指的进一步弯曲没有影响，掌指和指节间远端不受影响，但不能完全伸展。其中2/3 的患者屈曲指是双侧的，但其弯曲程度不一定对称。屈曲指与外伤、系统性疾病或神经性异 常无关，但感染、外伤和烧伤等环境因素可产生拟表型。一般先天性畸形中1%患者伴有屈 曲指，而先天性手畸形中5%患者伴有屈曲指，普通人群中屈曲指患病率为0. 1%?0.2%。 其中大部分患者无明显功能性损伤，一般可不进行治疗。约20%屈曲指患者由于无明显功 能性损伤而未就诊，该病实际发生率可能会更高。屈曲指病理学基础并不清楚，涉及近指端 关节周围的各个结构。引起屈曲指的因素很多，蚓状肌止点异常是最常见的原因。其他因 素包括指屈肌腱短缩、伸肌腱的中心性滑动、骨间肌、指伸肌腱发育缺陷、指掌侧皮肤、关节 囊、侧副韧带和掌板挛缩等。一般认为肌力不平衡是发生屈曲指的常见原因。指浅屈肌短 缩或异常附着、蚓状肌异常附着于指浅屈肌腱鞘、掌指关节囊或邻近指伸肌腱的扩张部，丧 失其屈掌指关节、伸指间关节作用，指伸肌腱发育缺陷而不能伸指，这种肌力不平衡造成指 屈肌占优势，引起近指端关节屈曲畸形，其他软组织挛缩则均为继发性改变。
[0003] 屈曲指可表现为一种独立的遗传病（非综合征型）或作为其他疾病或综合征的体 征之一，超过60种综合征伴随屈曲指表型。Benson等将屈曲指分为3种类型：1类畸形最 常见，仅限于小指，在婴儿期间变化明显，男女发病率相同；II类屈曲指青春期前（7?10 岁）并不明显，女孩发病多于男孩，此型有发展成严重弯曲畸形的可能；III类畸形更严重， 包括四肢的多个指头，通常和多种综合征相关。前两种类型可归为非综合征型，为独立的常 染色体显性遗传的畸形，后者则伴有多种其他临床表现称综合征型。非综合征型屈曲指是 一种常染色体显性遗传病，经常伴随指节垫表型，而指节垫是一种近指间关节背部上的皮 下结节。其屈曲指通常表现为散发，但对患者亲属行临床检查表明这是一种具有可变的外 显率和表现度的常染色体显性遗传病，少数病例外显不全，屈曲指在家系成员中严重程度 变化范围较大。屈曲指畸形的病因是多因素的，目前病因学尚不完全明确，遗传机制较为复 杂，治疗主要针对致畸因素及其严重性，目前以保守治疗为主，手术疗效有一定差异。
[0004] 屈曲指作为众多疾病的多向性临床表现的一种，可能出现在常染色体显性、隐性 遗传或性染色体连锁遗传的疾病中。其遗传机制复杂，具有临床及遗传异质性。超过60种 综合征伴随屈曲指表型,在OMIM数据库中至少有48种伴屈曲指体征的遗传性疾病具有已 定位的染色体位点，如掌挛缩病、远端关节挛缩、屈曲指-关节炎-髋内翻-心包炎综合征、 眼齿指发育不良、Guadalajara屈指综合征。虽在综合征型屈曲指中取得了一些分子遗传 学研究进展，如染色体15q24_26. 3重复、22qll缺失、llq24. 1缺失及2pl5-16. 1微缺失等 染色体异常或FGFR3基因p.R62IH等基因突变与屈曲指表型相关，但现仅由Malik等报道 一个疾病位点（CAMPDl) 3qll. 2-13. 12与非综合征型屈曲指相关，尚未鉴定出相关的致病 基因及突变。
[0005] 由于屈曲指遗传机制复杂，具有临床及遗传异质性，目前缺乏快速、准确的检测技 术应用于屈曲指疾病致病基因的检测。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于屈曲指致病基因 的检测试剂盒，还提供了该试剂盒的应用。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种屈曲指致病基因的检测试剂盒，该检 测试剂盒包括引物，前述引物为根据TLN2基因所有外显子及其外显子-内含子交界区序列 设计的引物，前述引物用于PCR扩增，前述PCR扩增的产物包括TLN2基因外显子及其外显 子-内含子交界区的核苷酸序列。
[0008] 进一步的，前述引物的核苷酸序列为以下引物对中的至少一对：SEQIDNO. 1和 SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 和SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 5 和SEQIDNO. 6、SEQIDNO. 7 和 SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9 和SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11 和SEQIDNO. 12、SEQIDNO. 13 和SEQIDNO. 14、SEQIDNO. 15 和SEQIDNO. 16、SEQIDNO. 17 和SEQIDNO. 18、SEQID NO. 19 和SEQIDNO. 20、SEQIDNO. 21 和SEQIDNO. 22、SEQIDNO. 23 和SEQIDNO. 24、 SEQIDNO. 25 和SEQIDNO. 26、SEQIDNO. 27 和SEQIDNO. 28、SEQIDNO. 29 和SEQID NO. 30、SEQIDNO. 31 和SEQIDNO. 32、SEQIDNO. 33 和SEQIDNO. 34、SEQIDNO. 35 和 SEQIDNO. 36、SEQIDNO. 37 和SEQIDNO. 38、SEQIDNO. 39 和SEQIDNO. 40、SEQID NO. 41 和SEQIDNO. 42、SEQIDNO. 43 和SEQIDNO. 44、SEQIDNO. 45 和SEQIDNO. 46、 SEQIDNO. 47 和SEQIDNO. 48、SEQIDNO. 49 和SEQIDNO. 50、SEQIDNO. 51 和SEQID NO. 52、SEQIDNO. 53 和SEQIDNO. 54、SEQIDNO. 55 和SEQIDNO. 56、SEQIDNO. 57 和 SEQIDNO. 58、SEQIDNO. 59 和SEQIDNO. 60、SEQIDNO. 61 和SEQIDNO. 62、SEQID NO. 63 和SEQIDNO. 64、SEQIDNO. 65 和SEQIDNO. 66、SEQIDNO. 67 和SEQIDNO. 68、 SEQIDNO. 69 和SEQIDNO. 70、SEQIDNO. 71 和SEQIDNO. 72、SEQIDNO. 73 和SEQID NO. 74、SEQIDNO. 75 和SEQIDNO. 76、SEQIDNO. 77 和SEQIDNO. 78、SEQIDNO. 79 和 SEQIDNO. 80、SEQIDNO. 81 和SEQIDNO. 82、SEQIDNO. 83 和SEQIDNO. 84、SEQID NO. 85 和SEQIDNO. 86、SEQIDNO. 87 和SEQIDNO. 88、SEQIDNO. 89 和SEQIDNO. 90、 SEQIDNO. 91 和SEQIDNO. 92、SEQIDNO. 93 和SEQIDNO. 94、SEQIDNO. 95 和SEQID NO. 96、SEQIDNO. 97 和SEQIDNO. 98、SEQIDNO. 99 和SEQIDNO. 100、SEQIDNO. 101 和 SEQIDNO. 102、SEQIDNO. 103 和SEQIDNO. 104、SEQIDNO. 105 和SEQIDNO. 106、SEQ IDNO. 107和SEQIDNO. 108、SEQIDNO. 109和SEQIDNO. 110、SEQIDNO. 111和SEQID NO. 112。
[0009] 在本发明的检测试剂盒中，优选的检测试剂盒还包括用于PCR的DNA扩增酶和缓 冲液。
[0010] 在本发明的检测试剂盒中，前述用于PCR的DNA扩增酶优选为TaqDNA聚合酶。但 在本发明中任何用于PCR扩增的酶均可与设计的引物进行PCR扩增，并能达到相同或相似 的技术效果。
[0011] 进一步的，前述TaqDNA聚合酶的酶活为5U/μ1时，具有较好的技术效果。
[0012] 在本发明的检测试剂盒中，前述缓冲液优选为PCRBuffer、MgCljPdNTPMix。进 一步的，前述MgCl2的浓度为25mM、前述dNTPMix的浓度为IOmM时，具有较好的技术效果。 但在本发明中任何用于PCR扩增的缓冲液均可应用于前述引物的PCR扩增，并能达到相同 或相似的技术效果。
[0013] 进一步的，前述引物、DNA扩增酶和缓冲液的体积比为2 : 0. 15 : 4. 82时，具有 较好的技术效果。
[0014] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述检测试剂盒在屈曲指致病基因 检测中的应用，前述应用方法为：通过试剂盒检测人的TLN2基因序列是否存在突变，确定 前述TLN2基因是否为屈曲指致病基因。
[0015] 进一步的，前述应用方法为：
[0016]Sl、将待测DNA样品加入检测试剂盒中进行PCR反应得到PCR反应产物；
[0017]S2、将前述PCR反应产物经纯化后进行Sanger测序得到序列，将前述序列与TLN2 基因标准序列比对，确定是否存在TLN2基因突变，确定屈曲指致病基因是否为突变基因。
[0018] 本发明的创新点在于：
[0019] 本发明通过对屈曲指家系进行外显子测序及Sanger测序分析，鉴定了一个新的 非综合征型屈曲指致病基因--TLN2,该基因定位于15q22. 2(命名为CAMPD2)区间内，针 对其编码区序列设计诊断引物，发明检测试剂盒应用于PCR体外扩增DNA，结合Sanger测 序，检测屈曲指致病基因TLN2基因的突变，应用于临床基因诊断。
[0020] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0021] (1)本发明利用外显子测序技术发现屈曲指致病的相关基因，通过设计屈曲指致 病基因TLN2所有外显子及其外显子-内含子交界区序列的引物，提供了一种用于屈曲指致 病基因的检测试剂盒，该试剂盒检测方便、便捷，准确率达到100%。
[0022] (2)本发明采用屈曲指致病基因的检测试剂盒应用于屈曲指致病基因的检测，有 利于明确屈曲指患者的分子诊断及分型，用于开展基因诊断和遗传咨询，应用于屈曲指家 系患者子代产前诊断，指导优生优育。此外，新的屈曲指致病基因的克隆，结合遗传或表观 遗传修饰因素调节基因表达及构建相应的动物模型将为揭示屈曲指的发病机理提供重要 线索，进一步阐明人类肢体发育异常的病理机制，有助个体化诊断及治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0024] 图1为非综合征型屈曲指家系图，其中M表示定位在15号染色体上TLN2基因 c.C1016T(p.S339L)突变，N表示正常（normal)。
[0025] 图2为屈曲指家系成员15号染色体上TLN2基因测序结果图；其中A表示正常者 (IV:2)测序图；B表示患者（IV:1)测序图示c.C1016T(p.S339L)突变。
[0026] 图3为TLN2基因同源性比较分析（BLAST结果）示339位丝氨酸（S)在多个物种 中高度保守。
【具体实施方式】
[0027] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0028] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0029] 本发明采集到一个四代常染色体显性遗传的非综合征型屈曲指家系（图1)的外 周静脉血样本l〇ml，经枸橼酸钠抗凝，常规苯酚-氯仿法提取基因组DNA，将提取得到的基 因组DNA经分光光度计测DNA浓度和OD值后稀释至IOOng/μ1，用于后续外显子组测序。
[0030] 本次共采集了家系内23名成员（9名患者和14名正常者）的血液样本及相关详 细临床资料，家系内绝大部分患者为双侧屈曲指，部分患者为单侧，伴或不伴有心血管异常 (窦性心律不齐、窦性心动过缓），详细临床表现列于表1中。
[0031] 表I:TLN2p.S339L突变患者或携带者屈曲指表型及心脏相关特征
【权利要求】
1. 一种屈曲指致病基因的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括引物，所述引 物为根据TLN2基因所有外显子及其外显子-内含子交界区序列设计的引物，所述引物用于 PCR扩增，所述PCR扩增的产物包括TLN2基因外显子及其外显子-内含子交界区的核苷酸 序列。
2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为以下引 物对中的至少一对：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、 SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、 SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41 和 SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43 和 SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45 和 SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47 和 SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49 和 SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51 和 SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53 和 SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55 和 SEQ ID NO. 56、SEQ ID NO. 57 和 SEQ ID NO. 58、SEQ ID NO. 59 和 SEQ ID NO. 60、 SEQ ID NO. 61 和 SEQ ID NO. 62、SEQ ID NO. 63 和 SEQ ID NO. 64、SEQ ID NO. 65 和 SEQ ID 勵.66、5￡〇10恥.67和5￡〇10恥.68、5￡〇10勵.69和5￡〇10勵.70、5￡〇10从).71和5￡〇 ID NO. 72、SEQ ID NO. 73 和 SEQ ID NO. 74、SEQ ID NO. 75 和 SEQ ID NO. 76、SEQ ID NO. 77 和 SEQ ID NO. 78、SEQ ID NO. 79 和 SEQ ID NO. 80、SEQ ID NO. 81 和 SEQ ID NO. 82、SEQ ID NO. 83 和 SEQ ID NO. 84、SEQ ID NO. 85 和 SEQ ID NO. 86、SEQ ID NO. 87 和 SEQ ID NO. 88、 SEQ ID NO. 89 和 SEQ ID NO. 90、SEQ ID NO. 91 和 SEQ ID NO. 92、SEQ ID NO. 93 和 SEQ ID NO. 94、SEQ ID NO. 95 和 SEQ ID NO. 96、SEQ ID NO. 97 和 SEQ ID NO. 98、SEQ ID NO. 99 和 SEQ ID NO. 100、SEQ ID NO. 101和 SEQ ID NO. 102、SEQ ID NO. 103 和 SEQ ID NO. 104、SEQ ID NO. 105和 SEQ ID NO. 106、SEQ ID NO. 107和 SEQ ID NO. 108、SEQ ID NO. 109和 SEQ ID NO. 110、SEQ ID NO. Ill 和 SEQ ID NO. 112。
3. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括用于PCR的 DNA扩增酶和缓冲液。
4. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述用于PCR的DNA扩增酶为Taq DNA聚合酶。
5. 根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶的酶活为5U/ U 1〇
6. 根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为PCR Buffer、MgCl2和 dNTP Mix。
7. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述MgCl2的浓度为25mM、所述 dNTP Mix的浓度为10mM。
8. 根据权利要求3至7任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物、DNA扩增酶 和缓冲液的体积比为2 : 0.15 : 4.82。
9. 一种权利要求1至8任一项所述检测试剂盒在屈曲指致病基因检测中的应用，其特 征在于，所述应用方法为：通过所述检测试剂盒检测人的TLN2基因序列是否存在突变，确 定所述TLN2基因是否为屈曲指致病基因。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用方法为： 51、 将待测DNA样品加入检测试剂盒中进行PCR反应得到PCR反应产物； 52、 将所述PCR反应产物经纯化后进行Sanger测序得到序列，将所述序列与TLN2基因 标准序列比对，确定是否存在TLN2基因突变，确定屈曲指致病基因是否为突变基因。
【文档编号】C12Q1/68GK104357575SQ201410682484
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】邓昊, 谌于蓝, 袁腊梅, 邓晟, 徐洪波, 管李萍, 宋治, 张建国 申请人:中南大学湘雅三医院, 深圳华大基因科技有限公司