用于检测大肠杆菌o157:h7的显色培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公布了一种用于检测大肠杆菌O157：H7与其他肠道菌群的显色培养基，培养基含有琼脂、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，还含有山梨醇、肌醇、性红、β-半乳糖苷酶显色底物、4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，牛胆盐、亚碲酸钾、头孢克肟。本发明公布的显色培养基能快速简便地从大肠菌群中鉴别出大肠杆菌O157：H7。
【专利说明】用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物检测的培养基，尤其涉及一种用于检测大肠杆菌0157:H7 的显色培养基。
【背景技术】
[0002] 出血性大肠杆菌（enterohemorrhage E. Coli，EHEC)是大肠杆菌的一个亚型,EHEC 分为157、26、111血清型，主要致病菌株为0157:H7,可引起感染性腹泻，因能引起人类的出 血性肠炎而得名。
[0003] EHEC 0157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏 菌基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义。EHEC0157:H7虽然有UidA 基因，但其编码的β -葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷 (MUG)产生荧光，S卩MUG阴性。
[0004] EHEC 0157:Η7的显色培养基利用原理为大肠杆菌0157:Η7不发酵或2天内不发 酵山梨醇以及表达β-半乳糖苷酶，在基础培养基中添加山梨醇和β-半乳糖苷酶的显色 底物；在这种显色培养基中，大肠杆菌菌落显示发酵山梨醇的色泽，而EHEC 0157:Η7呈现 β-半乳糖苷酶显色底物中显色基团的颜色。
[0005] 研究发现，大肠杆菌中存在不发酵山梨醇，β -葡萄糖醛酸酶阳性，但 EHEC0157:H7血清也不凝集的菌株，给EHEC 0157:Η7的显色培养造成假阳性。目前，还没有 将用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基。
[0007] 本发明的所采用的技术方案为：
[0008] -种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化钠5-10g，还含有山梨醇10-20g、肌醇4-7g、 性红0. 005-0. 03g、β -半乳糖苷酶显色底物0. 05-3g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸 0. 1-0. 2g、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g，牛胆盐l-5g、亚締酸钾l-5mg、头孢 克月亏 0· Ol-O. 06mg。
[0009] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖。
[0010] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖在IOOOmL培 养基中的含量为〇. lg。
[0011] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物为邻硝基苯_β -D-半乳糖苷。
[0012] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物邻硝基苯_β-D-半乳糖苷在IOOOmL培养基中 的含量为2g。
[0013] 优选的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培养基中的含量为 0. 05-0. 2g。
[0014] 优选的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培养基中的含量为0. 15g。
[0015] 优选的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培养基中的含量为0. lg。
[0016] 优选的，用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼 脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、性红0. Olg、邻硝基 苯-β -D-半乳糖苷2g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸0. lg、异丙基-β -D-硫代批喃半 乳糖苷〇. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏0. 04mg。
[0017] 优选的，用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有 琼脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、性红0. Olg、 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖0. lg、4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸0. lg、异丙 基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克厢0. 04mg。
[0018] 本发明在培养基中添加了山梨醇和中性红，除大肠杆菌0157 :H7外的大肠菌群发 酵山梨醇产酸，在pH指示剂中性红作用下显示出红色色泽，而大肠杆菌0157 :H7不利用山 梨醇而呈现无色菌落。
[0019] 本发明在培养基中添加了 β -半乳糖苷酶显色底物I和β -半乳糖苷酶显色底物 II，大肠菌群在β -半乳糖苷酶作用下分解底物，游离出显色剂，使菌落呈现出显色剂的色 泽。
[0020] 胆盐可抑制样品中大部分的革兰氏阳性球菌，包括牛胆盐、猪胆盐、三号胆盐、去 氧胆酸钠和混合胆盐。本发明在培养基中添加了胆盐。
[0021] 本发明在培养基中添加了，可抑制样品中部分的革兰氏阴性杆菌如大肠菌群以及 容易扩散生长的变型杆菌的抗生素亚碲酸钾和头孢克肟。
[0022] 本发明的显色培养基能快速简便地从大肠菌群中鉴别出大肠杆菌0157 :Η7。
【具体实施方式】
[0023] -种用于检测大肠杆菌0157 :Η7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化钠5-10g，还含有山梨醇10-20g、肌醇4-7g、 性红0. 005-0. 03g、β -半乳糖苷酶显色底物0. 05-3g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸 0. 1-0. 2g、异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g，牛胆盐l-5g、亚締酸钾l-5mg、头孢 克月亏 0· Ol-O. 06mg。
[0024] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖，在IOOOmL 培养基中的含量为〇. lg。
[0025] 优选的，β -半乳糖苷酶显色底物为邻硝基苯-β -D-半乳糖苷，在IOOOmL培养基 中的含量为2g。
[0026] 优选的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培养基中的含量为 0. 05-0. 2g。
[0027] 优选的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培养基中的含量为0. 15g。
[0028] 优选的，4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸在IOOOmL培养基中的含量为0. lg。
[0029] 本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌0157 :H7的方法，包括如下步骤：
[0030] (1)制备显色平板：每IOOOmL去离子水中加入上述显色培养基除亚碲酸钾、头孢 克肟外的原料，搅拌，加热煮沸至完全溶解，待冷至约50°C，加入过滤除菌的亚碲酸钾、头孢 克肟，混匀，倒平板，备用；
[0031] (2)接种培养：将样品或含样品的增菌液接种到显色平板上，37°C培养22?26h ;
[0032] (3)结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1?3mm、蓝绿色的菌落，且菌 落在366nm下无蓝白色荧光，说明该样品存在大肠杆菌0157 :H7,其它肠道菌或被抑制或为 显示红色或显色蓝绿色但在366nm下呈现蓝白色荧光。
[0033] 本发明的显色培养基用于检测大肠杆菌0157 :H7的方法，包括如下步骤：
[0034] (1)制备显色平板：每IOOOmL去离子水中加入上述显色培养基除β -半乳糖苷酶 显色底物邻硝基苯-D-半乳糖苷、亚締酸钾、头孢克厢外的原料，搅拌，加热煮沸至完全 溶解，待冷至约50°C，加入过滤除菌的邻硝基苯-β-D-半乳糖苷、亚碲酸钾、头孢克|亏，混 勾，倒平板，备用；
[0035] (2)接种培养：将样品或含样品的增菌液接种到显色平板上，37°C培养22?26h ;
[0036] (3)结果分析：若显色平板上出现光滑、略突起、直径1?3mm、黄色的菌落，且菌落 在366nm下无蓝白色荧光，说明该样品存在大肠杆菌0157 :H7,其它肠道菌或被抑制或为显 示红色或显色黄色但在366nm下呈现蓝白色荧光。
[0037] 下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
[0038] 实施例1
[0039] -种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼 脂l〇g、蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化钠5g，还含有山梨醇15g、肌醇5g、性红0. lg、 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖0. lg、4-甲基扇型酮-β-D-葡萄糖苷酸0. lg、异丙 基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. Ig,牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏0. 04mg。
[0040] 实施例2
[0041] 一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每IOOOmL培养基含有琼脂10g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化钠5g，还含有山梨醇15g、肌醇5g、性红0. lg、邻硝基 苯-β -D-半乳糖苷2g、4-甲基扇型酮-β -D-葡萄糖苷酸0. lg、异丙基-β -D-硫代批喃半 乳糖苷〇. lg，牛胆盐I. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏0. 04mg。
[0042] 实施例3特异性实验
[0043] 将 E. coli 0157:H7NCTC12900、E. coli 0157:H7882364、E. coli 0157:H7ATCC43895、E.coli 0157:H7ATCC43888、E.coli ATCC8739、E.coli CMCC(B)44102、 E. coli CMCC(B)44103、P. vulgaris CMCC(B)49027等8种标准菌株分别制成适当浓度的标 准菌悬液（浓度为108?109cfu/mL)，分别划线接种到用实施例1显色培养基制成的平板 上，37°C培养18?24h。特异性实验结果见表1。
[0044] 表1大肠杆菌E. coli 0157:H7显色培养基的特异性显色试验结果
[0045]
【权利要求】
1. 一种用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，每lOOOmL培养基含有琼脂15-20g、 蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化钠5-10g，其特征在于，还含有山梨醇10-20g、肌醇 4_7g、性红0. 005-0. 03g、0 -半乳糖苷酶显色底物0. 05-3g、4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄 糖苷酸〇. 1-0. 2g、异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷0. 05-0. 2g，牛胆盐l-5g、亚碲酸钾 l-5mg、头孢克肟 0? 01-0. 06mg。
2. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -半乳糖。
3. 根据权利要求2所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 5_溴-4-氯-3-吲哚-P -半乳糖在lOOOmL培养基中的含量为0. lg。
4. 根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶显色底物为邻硝基苯-3 -D-半乳糖苷。
5. 根据权利要求4所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于，邻 硝基苯-D-半乳糖苷在1000mL培养基中的含量为2g。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征 在于，所述4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸在1000mL培养基中的含量为0. 05-0. 2g。
7. 根据权利要求6所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于，所 述4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸在1000mL培养基中的含量为0. 15g。
8. 根据权利要求6所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于，所 述4-甲基扇型酮-0-D-葡萄糖苷酸在1000mL培养基中的含量为0. 10g。
9. 根据权利要求8所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于，每 1000mL培养基含有琼脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、 性红0. 01g、邻硝基苯-0 -D-半乳糖苷2g、4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸0. lg、异丙 基-0 -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐1. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏0. 04mg。
10. 根据权利要求8所述的用于检测大肠杆菌0157 :H7的显色培养基，其特征在于，每 1000mL培养基含有琼脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g，山梨醇15g、肌醇5g、性 红0? 01g、5-溴-4-氯-3-卩引哚-半乳糖0? lg、4-甲基扇型酮-0 -D-葡萄糖苷酸0? lg、 异丙基-D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛胆盐1. 5g、亚締酸钾2mg、头孢克月亏0. 04mg。
【文档编号】C12Q1/10GK104388525SQ201410682521
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】金京勋 申请人:苏州嘉禧萝生物科技有限公司