从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法和生产γ-氨基丁酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法和生产γ-氨基丁酸的方法，其中，从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法包括以下步骤：(1)取米糠500g，破碎仪破碎成粉末状；(2)米糠：pH5.5-6.0的磷酸缓冲液的重量比为1:2-1:3，4℃过夜浸提；(3)4000rpm/min离心，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4)40-60％硫酸铵沉淀粗提液，静置4h，4000-6000 rpm/min离心，弃上清，得到谷氨酸脱羧酶沉淀固体；50-100mL pH5.5-6.0的磷酸缓冲液溶解沉淀，得到谷氨酸脱羧酶液。利用所得谷氨酸脱羧酶液生产γ-氨基丁酸转化效率高，反应体积变小，操作简便。
【专利说明】从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法和生产Y-氨基丁酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品生物【技术领域】，涉及从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法，本发明还涉及一种生产Y-氨基丁酸的方法。
【背景技术】
[0002]Y -氨基丁酸(GABA)存在于哺乳动物脑、脊髓中，是一种抑制性神经传递物质，由谷氨酸脱羧酶(GAD)催化谷氨酸得到。GABA具有调节血压与心律、营养神经细胞、促进精神安定、促进脑部供血、促进长期记忆、促进激素分泌、肾功能活化等作用。
[0003]目前，GABA主要是微生物发酵法和富集法，微生物发酵将底物谷氨酸钠或谷氨酸转化成GABA，可以安全应用于食品，但是生产周期长，转化率较低，下游分离难度较大，大规模生产设备成本较高等缺点。富集法主要是通过原料内在的谷氨酸脱羧酶催化生成GABA，有自然富集法和添加底物富集法。添加底物富集法可以目前主要在米胚、茶叶、大豆中应用较多，且可使原料中GABA含量提高100倍左右，但无法制得GABA纯品。自然富集法采用天然单一材料进行富集，工艺流程相对简单，但底物需依赖材料本身的谷氨酸，GABA富集量受到底物谷氨酸量的限制，一般限制很少采用。
[0004]江苏丘陵地区镇江农业科学研究所从葡萄皮中提取GAD，提取步骤中涉及壳聚糖，提取成本高，不宜推广应用。且提纯后的粗提液体积大，不易进行后续催化反应。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法和生产Y-氨基丁酸的方法，解决现有技术中提纯成本高，粗提液体积过大的技术问题，同时为米糠的深加工提供一种新的方法。
[0006]本发明的所采用的技术方案为:
[0007]从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法，包括以下步骤:(1)取米糠500g，破碎仪破碎成粉末状；(2)米糠:pH5.5-6.0的磷酸缓冲液的重量比为1:2-1:3，4°C过夜浸提；
(3)4000rpm/min离心，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4) 40-60%硫酸铵沉淀粗提液，静置4h以上,4000-6000rpm/min离心,弃上清,得到谷氨酸脱羧酶沉淀固体；50_100mL pH5.5-6.0的磷酸缓冲液溶解沉淀，得到谷氨酸脱羧酶液。
[0008]优选的，本发明提供的从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法中pH5.5-6.0的磷酸缓冲液进一步含有l_5mmol巯基乙醇，l-3mmol EDTA_2Na, 5% -10%甘油。
[0009]优选的，本发明提供的从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法中，硫酸铵沉淀的浓度为 40-50%。
[0010]优选的，本发明提供的从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法中，硫酸铵沉淀的浓度为 45%。
[0011]本发明还提供从上述方法提取到的谷氨酸脱羧酶。
[0012]本发明还提供一种用上述方法得到的谷氨酸脱羧酶生产Y-氨基丁酸的方法，具体为5-20mg/mL谷氨酸为底物，加入0.lg/L的维生素B6，反应ρΗ5.5，37°C反应30_60min，得到GABA产品；酶反应中谷氨酸脱羧酶液、谷氨酸底物、维生素B6的体积比为1:200:100。
[0013]优选的，本发明提供的生产Y-氨基丁酸的方法底物浓度为100mg/mL，反应时间为 60mino
[0014]谷氨酸脱羧酶活采用比色法测定，I个GAD活力单位(U)定义为:在37°C，pH5.5条件下，每分钟每毫升酶液中催化谷氨酸脱羧酶发生脱羧反应生成I μ mol的GABA所需酶量。
[0015]目前还没有关于通过硫酸铵沉淀法从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的报道。本发明提取得到的谷氨酸脱羧酶液的活性高达100-250U/mL，利用此酶液生产GABA，谷氨酸转化率高达90%以上。
[0016]本发明的有益效果是:1、硫酸铵沉淀法大大降低了提取成本；2、得到的谷氨酸脱羧酶液体积小(粗提液体积的1/10 —1/20)活性高，方便后续催化反应的进行。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。
[0018]实施例1
[0019]磷酸缓冲液配方:50mmol磷酸缓冲液，pH5.5,2mmol巯基乙醇，2mmolEDTA-2Na, 5%甘油。
[0020]取米糠500g，破碎仪破碎成粉末状；按米糠:磷酸缓冲液的重量比为1:2，4°C过夜浸提；(3) 4000rpm/min离心，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4) 40 %硫酸铵沉淀粗提液，静置4h以上，4000rpm/min离心,弃上清,得到谷氨酸脱羧酶沉淀固体；50mL磷酸缓冲液溶解沉淀，得到谷氨酸脱羧酶液。
[0021]比色法检测谷氨酸脱羧酶液活性为185U/mL。
[0022]实施例2
[0023]磷酸缓冲液配方:50mmol磷酸缓冲液，pH5.5,2mmol巯基乙醇，2mmolEDTA-2Na, 5%甘油。
[0024]取米糠500g，破碎仪破碎成粉末状；按米糠:磷酸缓冲液的重量比为1:2，4°C过夜浸提；(3) 4000rpm/min离心，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4) 50 %硫酸铵沉淀粗提液，静置4h以上，4000rpm/min离心,弃上清,得到谷氨酸脱羧酶沉淀固体；50mL磷酸缓冲液溶解沉淀，得到谷氨酸脱羧酶液。
[0025]比色法检测谷氨酸脱羧酶液活性为263U/mL。
[0026]实施例3
[0027]磷酸缓冲液配方:50mmol磷酸缓冲液，pH5.5,2mmol巯基乙醇，2mmolEDTA-2Na, 5%甘油。
[0028]取米糠500g，破碎仪破碎成粉末状；按米糠:磷酸缓冲液的重量比为1:2，4°C过夜浸提；(3) 4000rpm/min离心，得到谷氨酸脱羧酶粗提液；(4) 45 %硫酸铵沉淀粗提液，静置4h以上，4000rpm/min离心,弃上清,得到谷氨酸脱羧酶沉淀固体；50mL磷酸缓冲液溶解沉淀，得到谷氨酸脱羧酶液。
[0029]比色法检测谷氨酸脱羧酶液活性为200U/mL。
[0030]实施例4
[0031]取pH为5.5、浓度为10mg/mL谷氨酸溶液，取0.lg/L的维生素B6，取实施例3中的谷氨酸脱羧酶液，使谷氨酸脱羧酶液、谷氨酸底物、维生素B6的体积比为1:200:100。370C反应60min，煮沸灭活谷氨酸脱羧酶活性，比色法测定反应液中的GABA浓度为4.5mg/mL,谷氨酸的转化率为95%。
【权利要求】
1.从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取米糠500g，破碎仪破碎成粉末状； (2)米糠:pH5.5-6.0的磷酸缓冲液的重量比为1:2-1:3，4°C过夜浸提； (3)4000rpm/min离心,得到谷氨酸脱羧酶粗提液； (4)40-60%硫酸铵沉淀粗提液，静置4h以上，4000-6000rpm/min离心，弃上清，得到谷氨酸脱羧酶沉淀固体；50-100mL、pH 5.5-6.0的磷酸缓冲液溶解沉淀，得到谷氨酸脱羧酶液。
2.根据权利要求1所述的从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液pH为5.5，还包含l-5mmol巯基乙醇，l-3mmol EDTA-2Na,5% -10%甘油。
3.根据权利要求1所述的从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀的浓度为40-50%。
4.根据权利要求3所述的从米糠中提取谷氨酸脱羧酶的方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀的浓度为45%。
5.一种生产Y-氨基丁酸的方法，利用权利要求1-4任一项方法提取的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，5-20mg/mL谷氨酸为底物，加入0.lg/L的维生素B6，反应pH5.5，37°C反应30-60min，得到GABA产品；酶反应中谷氨酸脱羧酶液、谷氨酸底物、维生素B6的体积比为1:200:100。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，谷氨酸底物浓度为10mg/mL，反应时间为60mino
【文档编号】C12P13/00GK104388414SQ201410682557
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】金京勋 申请人:苏州嘉禧萝生物科技有限公司