环介导等温扩增法检测b群链球菌的引物组及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒，该引物组包括一对特异性内引物和一对特异性外引物，该试剂盒中包括若干个内含18μL反应液的反应管、1管内含10μL GBS DNA的阳性对照管、1管内含100μL无菌超纯水的阴性对照管，本试剂盒针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因设计引物，采用环介导等温扩增技术(LAMP)进行扩增并检测，DNA提取过程简单，不需要任何化学试剂，只需要沸水浴10min后离心即可，避免引入化学试剂对后续核酸扩增的影响，而且对仪器设备及操作要求低，简化了操作过程，降低了检测成本。
【专利说明】环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] B群链球菌（Group B Streptococcus，GBS)，又称无乳链球菌，兼性厌氧，革兰阳性 链球菌，正常寄居于阴道和肠道，属于条件致病菌。GBS感染引起肺炎、泌尿系统感染、软组 织感染、败血症等。GBS可引起新生儿、孕妇和老年人感染，是新生儿败血症和脑膜炎最常 见的病原菌，以新生儿感染率最高。成年人的B链球菌群感染多发生于机体抵抗力低下时。 GBS寄居于母亲泌尿道和胃肠道的黏膜，孕妇带菌率4%?40%不等，可能在生产过程中传 递给他们的孩子。20世纪70年代，GBS感染成为导致新生儿早期死亡的主要原因，死亡率 高达50%。GBS感染的新生儿，幸存者中30% -50%有严重的神经系统后遗症，包括脑瘫、 脑积水、发育障碍、智力障碍、听力或智力受损。GBS除了会造成新生儿感染外，怀孕妇女感 染GBS会出现早产，早期破水、羊膜腔炎，产后子宫发炎，甚至流产、死产。GBS是围产期女性 泌尿生殖道感染和新生儿期重症肺炎、败血症和脑膜炎的常见病原菌。新生儿的GBS感染 具有发病迅速、病死率高的特点，是新生儿的主要死亡原因，已引起世界范围内广大学者的 深切关注。对孕妇进行GBS筛查可及早发现感染，及时治疗，有效控制GBS的危害。
[0003] 细菌培养是检测GBS的标准方法，但此菌营养要求较高，培养鉴定耗时较长，至少 2d，且阳性率较低，给门诊就医患者带来不便，尤其不能满足孕检筛查的需要。如何在感染 早期快速、准确、灵敏的检测GBS是临床诊断关注的要点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种环介导等温扩增法检测B群链球 菌的引物组及试剂盒。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组，包括，特异性外引物F3 :其核苷 酸序列如SEQ ID NO :1所示；特异性外引物B3 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示；特异 性内引物FIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；特异性内引物BIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :4 所示。
[0007] -种环介导等温扩增法检测B群链球菌的试剂盒，包括装有18 μ L反应液的反应 管，装有10 μ L GBS DNA的阳性对照管，装有100 μ L无菌超纯水的阴性对照管，所述反应液 内含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、显色液、外引物F3、外引物Β3、内引物FIP、内引物BIP ; 所述反应缓冲液各组分的浓度如下：400mM的Tris-Hcl，pH8. 8 ;20mM的氯化钾；20mM的硫 酸铵；16mM的硫酸镁和0. 2% Tween2Q、l. 6M的甜菜碱、2. 8mMX4种dNTP ;Bst DNA聚合酶的 活性含量为：160单位/18 μ L ;显色液为：锰离子鳌和型钙黄绿素，0.001 μ mol/18 μ L ;F3 : 4pmol/18 μ L，B3 :4pmol/18 μ L ;FIP :32pmol/18 μ L，BIP :32pmol/18 μ L。
[0008] 所述试剂盒中装有18 μ L反应液的反应管为8个，装有10 μ L GBS DNA的阳性对 照管1个，装有100 μ L无菌超纯水的阴性对照DNA管1个。
[0009] 所述试剂盒内还含20个适配1-10 μ 1移液器的Tip头。
[0010] 上述试剂盒的使用方法：将2 μ L待检DNA加入反应管内，混匀，同时设阴性对照和 阳性对照，阳性对照中加入GBS DNA，阴性对照中加入无菌超纯水，将反应管置水浴锅中进 行扩增，扩增条件为：60_65°C水浴恒温反应30-40min，观察颜色变化。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 1.本试剂盒针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因设计引物，采用环介导等 温扩增技术（LAMP)进行扩增并检测。因为扩增效率高，特异性好，对DNA质量和数量要求 不高，DNA提取过程简单，不需要任何化学试剂，只需要沸水浴IOmin后离心即可，避免引入 化学试剂对后续核酸扩增的影响，而且对仪器设备及操作要求低，简化了操作过程，降低了 检测成本；
[0013] 2.针对GBS基因中高度保守、特异的cAMP基因中的6个片段，自行设计并优选出 特异性高、反应迅速、包含有4条引物的引物组，使得反应可在30-40min内完成；
[0014] 3.将每个反应所需试剂预先混合并置于反应管中，检测时只需要在反应管中加入 样本DNA即可进行反应，避免因多次加样带来的污染及误差，对操作人员要求低；而且试剂 盒中包含取样所需移液器头（Tip头），不需要另外准备耗材，进一步降低污染，提高检测的 精确度和便捷度；
[0015] 4.与文献报道的反应体系不同：反应液包括2X反应缓冲液（200mMTris-Hcl， pH8. 8 ;100mM氯化钾；IOOmM硫酸铵；20mM硫酸镁和1% TritonX-100、甜菜碱、dNTP、超纯 水）、BstDNA聚合酶、引物组、荧光染料。反应液采用Tris-HCl缓冲体系，更加稳定；提高了 甜菜碱的浓度（I. 6M)，更好的保护Bst DNA聚合酶的活性，提高反应效率；降低引物浓度， 提高了反应的特异性，降低假阳性；
[0016] 5.用于结果判断的染料采用钙黄绿素，反应效率高，特异性好，只能检测到LAMP 反应而对常规PCR反应无效，避免因核酸扩增中的微弱PCR反应带来的假阳性；
[0017] 6.染料预先加到反应液，反应结束后不需要再打开反应管，避免了因形成气溶胶 产生的DNA污染，有效保护反应环境，避免后续检测中的假阳性；
[0018] 7.反应快速，40min内即可完成；设置结果判断的时间范围为30-40min，因为 40min以后可能产生假阳性，所以40min以后的结果不予判读，确保了检测结果的准确性。
[0019] 8.与同类试剂盒相比，本试剂盒更加方便、快捷、特异、精确，对仪器设备和操作人 员要求低，不具有高级实验室的基层医院也可以开展，而且病人当天就可拿结果，节约时间 和费用，为治疗争取宝贵时间。
[0020] 9.整个检测过程在恒温下完成，不需要复杂的变温设备；扩增效率更高，是一般 PCR扩增效率的10-100倍；耗时更少，一般PCR扩增需要花费2-3h，而LAMP扩增只需要 0. 5-lh即可完成；结果可目视，容易判断，无需电泳，节约时间，避免污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为LAMP法目视鉴定GBS结果，其中，1号管为阴性对照，2号管为阳性对照，3 号管为检测管；
[0022] 图2为LAMP法目视检测试剂盒灵敏性结果，其中，1-6号管中加入的为倍比稀释的 DNA，浓度依次为100、10、1、0· 1、0· 01、0· OOlng/μ 1，1-5号为阳性，6号为阴性；
[0023] 图3LAMP法目视检测试剂盒特异性结果，1-8管依次为：B群链球菌质控菌，B群链 球菌临床分离株，A群链球菌，F群链球菌，星座链球菌，草绿色链球菌，肺炎链球菌，粪肠球 菌，1、2号管为阳性，其它均为阴性；
[0024] 图4LAMP法目视检测临床样本结果，其中1，2，3为阳性，4-20为阴性。。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0026] I. DNA 提取
[0027] (1)培养细菌的DNA提取：用移菌环刮取固体平板上的菌落，置于含0. 2ml无菌双 蒸水的EP管中，沸水浴8-10min，8000-12000rpm离心2_5min，取上清转移至新的EP管中， 即为样本DNA，可直接用于LAMP反应。
[0028] (2)临床液体样本的DNA提取：液体样本10000-12000rpm离心5min，除去部分上 清液，留取下部分沉淀，沉淀与蒸馏水I : 1混合后置沸水中水浴8-lOmin后，8000-12000rpm 离心2-5min，取上清转移至新的EP管中，即为样本DNA，可直接用于LAMP反应。
[0029] (3)临床固体样本的DNA提取：固体样本置于1倍体积蒸馏水中，沸水浴8-10min， 8000-12000rpm离心2-5min，取上清转移至新的EP管中，即为样本DNA，可直接用于LAMP反 应。
[0030] (4)咽拭子等样本的DNA提取：将拭子置于Iml蒸馏水中，充分震荡，弃去拭子，按 照液体样本方法提取DNA。
[0031] 2.引物设计及筛选
[0032] 根据GBS的cAMP基因序列设计引物组，每组引物包括一对特异性内引物和一对特 异性外引物，根据反应时间及特异性对不同引物的反应进程和结果进行监测、筛选，确定反 应快、特异性高的最佳引物。最佳引物序列见表1。
[0033] GBS的cAMP基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5所示。
[0034] 表1引物序列
[0035]
【权利要求】
1. 一种环介导等温扩增法检测B群链球菌的引物组，其特征在于，包括，特异性外引物 F3 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示；特异性外引物B3 :其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所 示；特异性内引物FIP :其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；特异性内引物BIP :其核苷酸序 列如SEQ ID NO :4所示。
2. -种环介导等温扩增法检测B群链球菌的试剂盒，其特征在于，包括装有18 y L 反应液的反应管，装有10uL GBS DNA的阳性对照管，装有lOOiiL无菌超纯水的阴性 对照管，所述反应液内含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、显色液、外引物F3、外引物B3、内 引物FIP、内引物BIP ;所述反应缓冲液各组分的浓度如下：400mM的Tris-Hc 1，pH8. 8 ; 20mM的氯化钾；20mM的硫酸铵；16mM的硫酸镁和0. 2% Tween2Q、l. 6M的甜菜碱、2. 8mMX4 种dNTP ;Bst DNA聚合酶的活性含量为：160单位/18iiL ;显色液为：锰离子鳌和型钙 黄绿素，0? 001 ii mol/18 ii L ;引物 F3 :4pmol/18 ii L，引物 B3 :4pmol/18 ii L ;引物 FIP : 32pmol/18 u L，引物 BIP :32pmol/18 u L。
3. 如权利要求2所述试剂盒，其特征在于，装有18 yL反应液的反应管为8个，装有 10 ii L GBS DNA的阳性对照管1个，装有100 ii L无菌超纯水的阴性对照管1个。
4. 如权利要求2或3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内还含20个适配1-10 yl 移液器的Tip头。
5. 如权利要求2-4任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，将2 y L待检DNA加入 反应管内，混匀，同时设阴性对照和阳性对照，将反应管置水浴锅中进行扩增，扩增条件为： 6〇-65°C水浴恒温反应30-40min，观察颜色变化。
【文档编号】C12R1/46GK104328212SQ201410682430
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】杨炜华, 汪运山, 裴凤艳, 纪明宇, 曹翠明, 张芳, 田娟娟 申请人:济南市中心医院