冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物工程中冠心病相关基因相关【技术领域】，涉及一种冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用，该基因的核苷酸序列具有SEQIDNO:1所示的序列。本发明对冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用做了详细介绍，该体外检测冠心病相关基因的试剂盒除了可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性外，还可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病，从而降低冠心病的发生率，对预防和治疗冠心病具有重大的意义。
【专利说明】冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程中冠心病相关基因相关【技术领域】，涉及一种冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用。
【背景技术】
[0002]流行病学与临床研究表明，冠心病(coronary artery disease)是发达国家和大多数发展中国家成年人发病和死亡的主要原因。冠心病患病率和死亡率呈逐年增高的趋势已引起全球性关注。许多发展中国家，随着物质条件的富裕和生活方式的西方化，预计到21世纪20年代冠心病可能成为全球排名第一名的疾病。自上世纪60年代Frmainghma的研究结果公布以来，人们对冠心病的认识也有了很大的提高，已经认识到冠心病不只是一种单因素疾病，而是由多种内源性及外源性因素共同决定的复杂性疾病，除了高血压，糖尿病，吸烟，代谢综合征等环境因素外，遗传因素在冠心病发生发展过程中的作用也得到了逐步的更进一步的认识及得到了一定程度的重视在冠心病发生发展中遗传因素约占40%至60%。
[0003]胶原蛋白(collagen)是一种具有独特结构的,细胞外基质的一种结构蛋白，广泛存在于哺乳类动物组织中，约占总蛋白质的30%以上。胶原蛋白的种类较多，目前发现的种类至少有25种，其中结构与功能比较清楚的类型为I型、II型、III型、IV型，V型。不同类型胶原在体内的分布不同，I型胶原主要分布在筋腱、骨骼、牙齿和各种软组织器官中；II型胶原主要分布于透明软骨和弹性软骨中；III型胶原分布在各种软组织脏器内，与I型胶原分布大致相同；IV型胶原分布在各组织器官基底膜基膜内；V型胶原分布在细胞外周。
[0004]IV型胶原首次于1966年被Kefalides等人从肾小球基底膜中分离出来的，是基底膜的主要结构成分，约占基底膜成分的50%左右。IV型胶原的结构较特殊，由(α 1-α 6)六条链组成，编码这六条α链的基因以头对头的方式成对的位于3条不同的染色体上。这六条α链以a 1.a 1.α 2，α 3.α 4.α 4，α 5.α 5.α 6的方式构成异源三聚体,每一条α链均包含3个结构域:Ν端的7S结构域；中间的三螺旋胶原结构域，此区域含有重复的甘氨基-X -Y序列(XY —般为脯氨酸和羟脯氨酸或赖氨酸和羟赖氨酸)，此重复序列在胶原形成螺旋过程中起重要作用；C末端的非胶原结构域(NC1)，NCl富含半胱氨酸和赖氨酸。Rodriguez等发现，与IV型胶原蛋白异常有关的疾病主要是由于该蛋白质胶原结构域中甘氨酸的突变有关，可能的致病机理有以下几个:甘氨酸是分子量最小的一种氨基酸，是唯一一个能够进入IV型胶原三螺旋结构中心的氨基酸，甘氨酸突变可影响三螺旋结构的形成或者IV型胶原的分泌，从而影响基底膜结构的稳定性，另外甘氨酸的突变使三螺旋区的CB3区结构发生变化，隐藏的整合素蛋白结合位点暴露，使IV型胶原蛋白降解或变性，甚至这些位点的抗体可能会抑制血管新生。
[0005]在脉管系统中，IV型胶原分布于动脉壁中层的血管平滑肌细胞周围，是血管壁基底膜的主要成分。公所周知，血管壁的完整性和稳定性对于心血管系统来说至关重要，这种完整性及稳定性是通过血管壁基底膜、内皮细胞和周围平滑肌细胞等之间相互协调而获得的，如果这种协调作用由于某些原因受到破坏，会影响脉管系统，结果导致出血，水肿，炎症和组织缺血等严重后果，而这些都是冠心病发生发展的基础。除此之外，IV型胶原还对细胞的迁移、增殖、分化起重要作用。
[0006]IV型胶原蛋白基因α I (C0L4A1)，基因位于13q34，mRNA全长6549bp，编码IV型胶原α?链，包含52个外显子。C0L4A1基因是近期在一项有关冠心病的全基因组关联研究(GWAS)中发现的新基因，认为遗传多态性与冠心病之间存在关联。此外，Y Yamada等人首次研究表明，C0L4A1基因的多态性与心肌梗死的发生有关。近年来对于C0L4A1基因多态性及编码蛋白质在心血管系统发生发展过程中的作用逐渐引起了人们关注。临床上该蛋白质有可能被优先应用于冠心病患病风险的预测指标。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有技术在预防和治疗冠心病时效果不理想的问题。
[0008]本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的:一种冠心病相关基因即C0L4A1基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的序列。
[0009]本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的:一种体外检测根据权利要求1所述的冠心病相关基因的试剂，该试剂用于检测C0L4A1基因rs605143位点的多态性，该试剂包括如下引物:
上游引物:5’AAAGCCATTGCTACCTCA3’
下游引物:5’ CTGCTCCTGGTGACTCTG3’
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进:
上述试剂可为用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。
[0010]本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的:一种有体外检测冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，该试剂盒包含PCR扩增酶及相应缓冲液。
[0011]本发明的技术方案之四是通过以下措施来实现的:一种体外检测冠心病相关基因的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。
[0012]下面是对上述发明技术方案之四的进一步优化或/和改进:
上述试剂盒中可包含PCR扩增酶及相应缓冲液。
[0013]本发明对冠心病相关基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用做了详细介绍，该体外检测冠心病相关基因的试剂盒除了可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性外，还可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病，从而降低冠心病的发生率，对预防和治疗冠心病具有重大的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明中冠心病相关基因序列变异的筛查流程示意图。
[0015]图2为本发明的部分测序图谱。
[0016]图3为本发明的rs605143多态性位点的酶切图谱。 其中如泳道I和2显示待测个体rs605143位点的基因型为G/G纯合子；泳道3，4，6和7显示待测个体的rs605143位点为Α/G杂合子；泳道5显示待测个体的rs605143位点为A/A纯合子。
【具体实施方式】
[0017]为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明，实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行:如Sambrook等人所著的《分子克隆:实验手册》(New fork: Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0018]实施例1，一种冠心病相关基因即C0L4A1基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ IDNO:1所示的序列。含有C0L4A1的基因的待测样品可以从来自试验者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、胃液、头发、活组织检查和尸体解剖材料的细胞，优选来自血液。
[0019]实施例2，一种体外检测冠心病相关基因的试剂，该试剂用于检测C0L4A1基因rs605143位点的多态性，该试剂包括如下引物:
上游引物:5’AAAGCCATTGCTACCTCA3’ ;
下游引物:5’CTGCTCCTGGTGACTCTG3’ ;
所谓“基因多态性”指的是在人群中，各个体基因的核苷酸序列存在的差异。本领域普通技术人员已知，本发明所述的多态性位点为单核苷酸多态性(SNP)位点，即基因组序列中单核苷酸发生改变；核苷酸酸序列的差异可以体现在DNA水平上或者RNA水平上，所以，本发明的冠心病相 关基因可以体现在DNA水平，RNA水平上，优选DNA水平，更优选基因组DNA。
[0020]目前关于复杂性状疾病的研究有两种策略，连锁分析的方法和病例-对照研究。由于冠心病是一种多因素疾病，是由遗传和环境因素共同作用的结果，因而采用连锁分析较为困难。从遗传的角度分析，冠心病/心肌梗死属于复杂遗传性状疾病。对该疾病的发生起作用的因素中，除环境因素外，起作用的基因总数估计多达上百条，各个基因之间又存在着相互作用，基因又和环境之间存在相互作用。冠心病/心肌梗死的发生具有一定的家族聚集性，但更多的是一些散发病例。所以本发明采用病例对照研究。所述病例对照研究就是在采用随机挑选的两组人群中(病例和对照)比较某等位基因的频率。
[0021]本发明在新疆维维尔族人群中通过大样本的统计分析(471例冠心病患者和624例对照)，经过大量的实验，最后以确凿的证据证明了具有本发明的rs605143多态性位点的C0L4A1基因为冠心病相关基因，G等位基因的携带者患冠心病的危险性较A等位基因携带者增加了 1.4倍
实施例3，作为上述实施例的优选，该试剂为用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。试剂盒中检测rs605143位点的试剂根据检测方法的不同而不同，例如，采用聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合方法来检测rs605143多态性位点时，试剂盒中可以含有限制性内切酶和相应的酶切图谱，例如DraI限制性内切酶和相应的酶切图谱。
[0022]实施例4，一种有体外检测冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，其特征在于该试剂盒包含PCR扩增酶及相应缓冲液。本发明检测rs605143位点多态性的冠心病相关基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性；rs605143位点突变的冠心病相关基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病；体外检测冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。
[0023]实施例5，一种体外检测冠心病相关基因的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。本发明检测rs605143位点多态性的冠心病相关基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性；rs605143位点突变的冠心病相关基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病；体外检测冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。
[0024]实施例6，与上述实施例的不同之处在于，试剂盒还包含PCR扩增酶及相应缓冲液。
[0025]实施例7，研究对象的选取
冠心病组(CAD组)471例，选自2006年I月~2010年3月在新疆医科大学第一附属医院心脏中心住院患者，符合世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的命名和诊断标准。对照组624例，选择2006年至2011年新疆地区人群慢性病调查中无任何心脏疾病者。两组均为维吾尔族人群，年龄和性别构成比均匹配，具有均衡性。
[0026]纳入标准:CAD组:按照我院经皮冠状动脉造影证实至少有一支冠状动脉血管狭窄≥50%且无其他方面的心脏病疾患。对照组:选择2006年至2011年新疆地区人群慢性病调查中无任何心脏疾病者.两组在纳入研究前签署知情同意书。
[0027]剔除标准:CAD组:临床资料不全者及同时合并以下疾病之一者予以剔除。(如:主动脉夹层、风湿性心脏病、先天性心脏病者、多脏器功能衰竭以及具有精神障碍不能配合者)。对照组:1、2006年至2010年新疆地区人群慢性病调查中证实患有任何心脏疾病者2、有心血管病家族史者3、吸毒者4、精神障碍者，予以剔除。
[0028]整个冠心病相关基因序列变异筛查流程见图1，从病例组中随机挑选36例冠心病患者作为筛查对象，构成72条染色体，这个样本量可提供95%的把握度检测到少见等位基因频率大于1%的序列变异。所有个体均为维吾尔族，且无任何血缘关系。根据NCBI中公布的C0L4A1外显子序列，通过blast数据库比较获得C0L4A1基因序列。检测多态性的方法是利用PCR产物直接测序。利用Primer 5.0软件设计PCR引物，扩增C0L4A1基因rs605143多态性位点。引物序列为:
上游引物:5’AAAGCCATTGCTACCTCA3’ ;
下游引物:5’ CTGCTCCTGGTGACTCTG3’。
[0029]实施例8，冠心病相关基因序列变异筛查
PCR反应体系(50 μ I):基因组模板DNA 50ng (来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酹-氛仿法或者用盐析法提取出来即可)、2*powder Taq PCR master mix25ul, 21ul of去离子水，上，下引物各lul，在96孔PCR自动循环仪上进行PCR反应，PCR循环参数:96°C预变性5分钟；经940C 30秒，60°C 45秒，72°C I分钟；循环28周后于72°C延伸10分钟。PCR产物经常规纯化2遍后进行测序反应，以PCR引物作为测序引物。测序在ABI 3500测序仪上完成。图2显示部分测序图谱。引物序列见表1。
[0030]结果:以中国新疆维吾尔族为研究对象，通过一系列的实验手段，发现C0L4A1基因rs605143多态性位点与中国新疆维吾尔族人群冠心病之间存在关联。
[0031]实施例9，采用PCR-RFLP方法检测本发明的冠心病相关基因rs605143位点的多态性
方法:PCR反应体系(50 μ I):基因组模板DNA 50ng(来自血液标本，按照常规方法将白细胞内的DNA用苯酹-氛仿法或者用盐析法提取出来即可)、2*powder Taq PCR mastermix 25ul, 21ul of去离子水，上，下引物各lul，在96孔PCR自动循环仪上进行PCR反应，PCR循环参数:96°C预变性5分钟；经940C 30秒，60°C 45秒，72°C I分钟；循环28周后于72°C延伸10分钟。。引物如下:
上游引物:5’AAAGCCATTGCTACCTCA3’ ;
下游引物:5’CTGCTCCTGGTGACTCTG3’
扩增产物长度为582碱基，选用DraI限制性内切酶(立陶宛MBI公司)进行酶切。酶切条件参见生产厂家的操作手册。然后在3%的琼脂糖胶上电泳后用紫外透射仪观察长度。
[0032]结果:如图3所示，当582碱基长的PCR产物切割后产生了 362和220碱基两种长度的片段时，说明rs605143位点的等位基因为G，当只有258、220和104三种片段时说明rs605143位点的等位基因为A。由于图3所示的待测样品为来自待测个体的DNA，所以，如泳道I和2所示，产生两种片段，则该待测个体rs605143位点的基因型为G/G纯合子，携带G等位基因；如泳道3，4，6和7显示，有三个片段，该待测个体的rs605143位点为Α/G杂合子，携带A, G等位基因；如泳道5所示，产生3条片段，待测个体的rs605143位点为A/A纯合子，携带A等位基因
实施例10，利用PCR与直接测序法检测本发明的rs605143位点多态性方法:首先对rs605143位点进行PCR反应，具体条件及引物参见实施例3。对PCR产物在ABI 3500测序仪上直接读取序列。
[0033]结果:如图1和图2所示，为本发明的测序过程及部分测序图。其中图1的测序图中I至3分别显示本发明待测个体的rs605143多态性位点为，GG纯合子、Α/G杂合子及AA
纯合子。
[0034]实施例11，多态位点与冠心病的关联研究
为进一步从遗传的角度探讨IV型胶原蛋白基因α I和冠心病发病之间的关系，并为国内外已有的同类研究提供遗传流行病学的证据，运用PCR-RFLP的国际通行的基因分型方法，在收集到的471例冠心病患者和相应的624例对照中，体外检测来自待测个体的样品中rs605143位点的多态性，从而分析rs605143位点在冠心病患者和正常对照人群的分布差异。
首先运用Hardy-Weinberg平衡检验。Hardy-Weinberg平衡是一种群体遗传学的概念:主要是指一民族生活在某一地区、能相互随机杂交的一群人体，这个群体所具有的全部遗传信息称为该群体的基因库，它直接反映本地区，本民族的遗传特征。这些遗传信息的表达形式基因频率和基因型频率，在没有突变、迁移和遗传漂变的条件下，群体中基因频率和基因型频率遵守保持不变即为Hardy-Weinberg平衡。这样既有遗传多态性，又具备遗传的稳定性。
[0035] 对基因分型结果分析发现，基因分型结果符合Hardy-Weinberg平衡，因此可以排除实验误差，该基因分型结果比较可靠，分析结果见表2。
[0036]结论:单因素分析发现，多态位点rs605143的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异(p〈0.05)，A/G显隐性遗传模式进一步分析发现，G等位基因的携带者相对A等位基因的携带者在病例组和对照组中有显著差别(P〈0.05)，其中G等位基因的携带者患冠心病的危险性是A等位基因的携带者患冠心病的危险性的1.4倍。
[0037]结论:单因素分析发现，多态位点rs605143的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异(p〈0.05)，Α/G显隐性遗传模式进一步分析发现，G等位基因及GG基因型的分布在冠心病组里明显高于对照组(等位基因G的分布:病例组为0.59，对照组为
0.538 ;GG基因型的分布频率:冠心病组为37.2，对照组为30.0)，并且具有统计学意义(P值均小于0.05)。以上研究结果表明，携带G等位基因者患冠心病的风险性高于携带等位基因A者。
[0038]干扰病例-对照研究最严重的因素包括人群在遗传基础上的混杂、病例入选时因为标准不严格产生的疾病混杂等，在排除了以上几个混杂因素的基础上，发明人挑选了 624个研究样本和相应的对照，这在国际同类研究中属于比较大的研究样本，为了进一步分析rs605143位点是否是冠心病独立的危险因素并且观察此位点对冠心病危险度的贡献，在调整了年龄、性别、高血压、糖尿病，吸烟、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白，低密度脂蛋白等冠心病其它危险因素的影响后，进行多变量logistic回归模型分析。logistic回归模型分析是统计学上的一种普通的分析方法，它主要用于二分变量的分析，可以用来调整对整个分析造成混杂的因素。结果见表3。
[0039]结果:如表3所示，多变量logistics回归模型分析表明，调整了年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白，低密度脂蛋白等冠心病其它危险因素的影响后发现rs605143位点仍然是冠心病独立的危险因素[GG基因型与AA基因型相比，患冠心病的风险性明显增加，OR值=1.369，95%CI为(1.021至1.834)]，并且具有统计学意义(P=0.036)。
[0040]结论:说明多态位点rs605143突变的C0L4A1基因为冠心病相关基因，携带G等位基因个体患冠心病的危险性比携带A等位基因的个体患冠心病的危险性显著升高，并且此位点的改变是冠心病独立的危险因素，因此rs605143位点突变的冠心病相关基因的试剂盒在临床上可以用于检测，预防，诊断或`治疗冠心病。
[0041]实施例12，体外检测冠心病相关基因即C0L4A1基因的试剂盒 一种体外检测冠心病相关基因的试剂盒，该试剂盒包含:
1)扩增rs605143位点的引物:
上游引物:5’AAAGCCATTGCTACCTCA3’ ;
下游引物:5’CTGCTCCTGGTGACTCTG3’
2)PCR扩增酶及相应缓冲液。
[0042])EcoR I限制性内切酶和相应的酶切图谱。
【权利要求】
1.一种冠心病相关基因即C0L4A1基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ IDNO:1所示的序列。
2.—种体外检测根据权利要求1所述的冠心病相关基因的试剂，其特征在于该试剂用于检测C0L4A1基因rs605143位点的多态性，该试剂包括如下引物: 上游引物:5’AAAGCCATTGCTACCTCA3’ 下游引物:5’ CTGCTCCTGGTGACTCTG3’ 根据权利要求2所述的体外检测冠心病相关基因的试剂，其特征在于该试剂为用于聚合酶链式反应与限制性片段长度多态性分析相结合的试剂或用于聚合酶链式反应与直接测序法相结合的试剂。
3.一种有根据权利要求2或3所述的体外检测冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，其特征在于该试剂盒包含PCR扩增酶及相应缓冲液。
4.一种根据权利要求2或3所述的体外检测冠心病相关基因的试剂在制备用于体外检测冠状动脉粥样硬化性心脏病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。
5.根据权利要求5所述的应用，其特征在于试剂盒中包含PCR扩增酶及相应缓冲液。
【文档编号】C12N15/12GK103667301SQ201310402350
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】马依彤, 迪拉热·阿迪, 谢翔, 杨毅宁, 向阳, 付真彦, 李晓梅 申请人:新疆医科大学第一附属医院