不动杆菌CL04及其在村镇污水除磷处理中的应用的制作方法

本发明涉及一株新的菌种——不动杆菌cl04acinetobactersp.cl04，及利用该菌株去除污水中磷的应用。
背景技术：
随着人类活度加剧给生态环境带来了巨大的压力，特别是大量的工农业和生活污水不仅给污水处理带来了巨大的压力，更导致磷元素流向各类水体造成水体富营养化。当前污水处理中磷的处理主要有化学絮凝沉淀法除磷和微生物法除磷，微生物法除磷具有安全无毒，低成本，经济实用。化学法主要是加入铝盐、铁盐跟磷生产难溶沉淀，而微生物法主要是利于微生物吸收污水中的磷，通过排出菌泥沉淀达到除磷的效果，具有显著的应用价值以及环保意义。然而普通污水处理设备中聚磷菌的含量过低以及聚磷效果很差，不能有效繁殖成优势菌以及高效吸收污水溶液中的磷，出水磷严重超标。技术实现要素：本发明为了克服现有技术的至少一个不足，提供一株新的菌种——不动杆菌cl04acinetobactersp.cl04，及利用该菌株在污水中除磷的方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：不动杆菌cl04(acinetobactersp.cl04)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号cctccno:m2017541，保藏日期2017年09月25日。该新菌株特征如下：菌落形态：30℃在lb平板培养12h，菌落形态为浅黄色、不透明、菌落呈光滑圆形、中间隆起、湿润有光泽、较粘稠。直径2～3mm，饱满隆起，菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达4mm以上。细胞形态：16h培养物的细胞具有圆端的直杆菌或细胞呈杆状，无端生鞭毛，无荚膜结构，无芽孢结构，直径0.3-1.0μm。甲苯胺蓝染色油镜下胞内明显可见异染颗粒。生理生化特征：革兰氏阴性，兼性厌氧，化能异养，最适生长温度为30℃。菌株甲基红实验阴性、过氧化氢酶阳性、吲哚实验阴性、精氨酸双水解酶实验阳性、vp实验阴性、淀粉水解实验阴性、硝酸盐还原实验阳性、乳糖氧化发酵阴性、明胶液化实验阳性。利用细菌16srdna序列测序的方法对其进行种属鉴定，序列见核酸序列表seqidno:1。本发明还提供上述不动杆菌cl04acinetobactersp.cl04在污水除磷处理中的应用。优选的，不动杆菌cl04acinetobactersp.cl04在污水除磷处理中，污水的ph值调为6.0-8.0。此外，本发明还提供上述的不动杆菌cl04acinetobactersp.cl04的筛选方法，包括以下步骤：步骤a，富集培养：从河道淤泥中提取淤泥样品，加入lb液体培养基，培养一段时间后加入富集培养基中进行富集培养；步骤b，纯化：富集完成后将富集菌液梯度稀释至合适浓度涂布在lb平板，37℃培养12～24h；步骤c，粗筛：根据聚磷菌在好氧条件下会吸收磷形成多聚磷酸盐颗粒的特性，进行异染染色；挑单菌落进行异染染色，镜检选出了有异染颗粒的单菌落；步骤d，复筛：将粗筛过的菌株接种至复筛培养基，检测总磷，对比除磷率，除磷率最高的命名为cl04。进一步，富集培养基的成分为1000ml水中，乙酸钠5.0g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.2g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾分别为10mg、20mg、30mg、40mg，ph值7.2，121℃灭菌湿热灭菌20min。本发明的有益效果主要体现在：本发明筛选了一株高效聚磷并使之成为污水处理设备中的优势菌，大量吸收污水中的磷，在体内形成多聚磷酸盐，通过排出菌泥沉淀达到除磷目的。应用本发明的聚磷菌能够大量将污水中的磷转化为胞内的多聚磷酸盐，可以通过排污泥的形式达到高效的除磷效果。该菌株不但应用于村镇、城市生活污水的治理，还适用于河道、商业和工业方面污水和废水的治理。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，作详细说明如下。附图说明图1为实施例1中acinetobactersp.cl04的生长和聚磷曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例11.聚磷菌的筛选1.1取样：取浙江农林大学东湖校区河道淤泥5g。1.2富集培养：将样品加入100mllb液体培养基，37℃、200rpm摇床振荡60min。取振荡后的样品10ml加入100ml富集培养基，先接入含磷酸二氢钾浓度最低的富集培养基，37℃、200rpm摇床培养3天，培养结束后转接入磷酸二氢钾浓度更高的富集培养基按上述条件继续培养，依次进行富集直至4个浓度富集培养基都培养完成。1.3纯化：富集完成后将富集菌液梯度稀释至合适浓度涂布在lb平板，37℃培养12～24h。1.4粗筛：根据聚磷菌在好氧条件下会吸收磷形成多聚磷酸盐颗粒的特性，进行异染染色。挑单菌落共计58个进行异染染色，镜检选出了有异染颗粒的6个单菌落。1.5复筛：将粗筛过的菌株接种至复筛培养基，检测总磷，对比除磷率。将目前筛选的6株聚磷菌接入装有5mllb液体培养基的试管，30℃、200rpm培养24h。将上述培养液按千分之一的接种量接入200ml未经灭菌处理的浙江农林大学农村生环境研究所实训基地生活污水，30℃、200rpm培养2天，分别于0h、24h、48h取样，离心取上清液，测总磷含量。实验结果如表1所示。表1复筛时不同菌株的磷去除率比较。选出24h总磷去除率最高的4号初筛菌，作为复筛出的最佳聚磷菌，制作成25％甘油管-80℃冷藏，编号为cl04。其中所述富集培养基按下述比例配制：1000ml水中，乙酸钠5.0g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钙0.2g，硫酸铵2.0g，磷酸二氢钾分别为10mg、20mg、30mg、40mg，ph值7.2，121℃灭菌湿热灭菌20min。所述lb液体培养基按下述比例配制：1000ml水中，蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10.0g，ph7.2，121℃湿热灭菌20min。所述lb固体培养基在lb液体培养基的基础上加入2％(w/v)的琼脂。所述异染染色剂为：甲液：甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿0.2g，冰醋酸1ml，乙醇(95％)2ml，蒸馏水100ml。乙液：碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。所述异染染色方法为方法：按常规方法制片，用甲液染色5min，倾掉甲液，用乙液冲去甲液，并染色1min，水洗，吸干，备油镜镜检。异染颗粒呈黑色，菌体其他部分呈绿色。所述总磷检测按gb/t11893-1989《水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》进行。2、菌种鉴定对所筛选出来的cl04号菌进行16srdna测序方法：提取细菌基因组dna，设计引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’，1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’，rcr条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30循环，72℃延伸10min，12℃保温。测序结果如seqidno.1所示。测序结果与nibc数据库进行对比，与不动杆菌属(acinetobactersp.)的关系最近，有98％的同源度，系统发育进化分析也表明该菌株属于不动杆菌属，命名为不动杆菌cl04(acinetobactersp.cl04)。3、聚磷菌生长和聚磷曲线测定3.1将聚磷效果最好的不动杆菌cl04接入100mllb培养基，37℃，200rpm培养12h。3.2取上述培养基按10％体积比接入检测培养基，分别在0h，2h，4h，8h，10h，12h，14h、16h、18h、20h、22h、24h，26h、28h测培养基和上清液的总磷含量，测600nm下吸光度值，数据如表2所示。其中所述检测培养基按下述比例配制：1000ml水中，蛋白胨10.0g，酵母粉1.0g，nacl10.0g，ph7.0，121℃湿热灭菌20min。表2不同培养时间培养基和上清液的总磷含量根据上表绘制acinetobactersp.cl04生长和聚磷曲线，得到图1。4、最适ph值实验4.1培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉1，氯化钠10。用hcl和naoh溶液分别调节培养基ph值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。4.2将不动杆菌cl04接入上述培养基，37℃，200rpm培养，分别在0h、12h、24h测上清液的总磷含量，数据下图。ph值0h12h24h425.725.725.5525.622.715.9625.816.03.3725.815.94.2825.618.54.8925.620.712.6根据聚磷效果，ph值对本菌株的除磷效果有较大影响。不动杆菌cl04的最适ph值为6.0-8.0。因此在应用本菌株处理污水时，最好将污水ph调节至6.0-8.0。虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所要求保护的范围为准。当前第1页12