本申请要求2016年1月14日提交的美国临时申请第62/278722号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
本公开涉及肥大细胞(mc)调节剂，其制备方法，含有这些调节剂的药物组合物，以及它们在治疗与肥大细胞相关的疾病中的用途。
背景技术：
传统上，已知肥大细胞在过敏和过敏性反应中的作用，以及它们参与获得性和先天性免疫、细菌感染和自身免疫。参见例如respitorymedicine，第106卷，第1期，第9-14页(2012年1月)；proc.natlacad.sci.usa102(2005)1578–1583；nat.immunol.6(2005)135–142；nature432(2004)512–516；eur.j.immunol.40(2010)1843–1851；nat.rev.immunol.10(2010)440–452；autoimmun.rev.4(2005)21–27；和nat.immunol.11(2010)471–476。除了与过敏性炎症(例如哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎和眼部过敏性疾病)相关之外，目前的证据表明，肥大细胞与通过非过敏性触发因素的炎性疾病，以及纤维化、癌症、中枢神经系统疾病和代谢紊乱有关。参见，例如，biochimicaetbiophysicaacta,1822(2012)21-23；dnacellbiol.2013年4月32(4):206-18；cancermetastasisrev.2011年3月30(1):45-60；nature210,756-757(1966年5月14日)；biochimicaetbiophysacta.2012年1月1822(1):14-20；和frontimmunol.2012；3:7。
在过去十年左右的时间里，还证明炎症是糖尿病神经病变(naturereviewneurology2011；7：573-83)、血脂异常(diabetes2009；58：1634-40)、ldl氧化(diabetes2009；58：2376-85)、聚(adp-核糖)活化(freeradicbiolmed2011；50：1400-9)的主要因素。晚期糖化终产物(age)及其受体rage(diabetes2013；62：931-43)的水平增加是这种炎症反应增加的主要原因(diabetologia2009；52：2251-63)。为此，美国临时申请号62/162,972中描述了局部皮肤炎症对小纤维神经病变(sfn)发展的作用，以及在sfn和糖尿病外周神经病变(dpn)发展中起作用的几种新因素的确定，如在糖尿病模型中神经肽、肥大细胞和巨噬细胞之间的相互作用以及增加的肥大细胞脱粒和m1巨噬细胞活化。
鉴于肥大细胞参与多种治疗途径和靶标，因此需要制备调节肥大细胞的化合物(例如，肥大细胞稳定剂)，由此可用于治疗与肥大细胞相关的一种或多种病症。
技术实现要素：
现已发现，本文所述的化合物及其药学上可接受的组合物是肥大细胞的有效调节剂，可用于治疗与之相关的病症，例如促进糖尿病个体的伤口愈合(参见例如图1)。
这种化合物包括式i的化合物或其药学上可接受的盐，
其中x、y、cy、r1、r2、s和p各自如本文所定义和描述。
本文所述的化合物可用于治疗与肥大细胞相关的各种疾病、紊乱或病症。该疾病、紊乱或病症包括本文所述的那些。
附图说明
图1说明了本文所述化合物的治疗对糖尿病小鼠的伤口愈合效果。
图2说明了用本文所述化合物的治疗对糖尿病小鼠完整皮肤中m1/m2比率的影响。
图3显示了化合物12对活化的肥大细胞释放的β-hex的剂量依赖性抑制。测量细胞培养上清液中释放的β-hex，并与细胞裂解物中的总β-hex进行比较(报告为％)。
图4显示了化合物12对活化的肥大细胞中nfat核转位的剂量依赖性抑制。
具体实施方式
1.化合物概述
在某些实施方案中，本公开提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐，
其中
z是ch或n；
x是co且y是nh，或x是nh且y是co；
cy是苯基或吡啶基；
r1和r2各自为卤素；且
p和s各自独立地为1、2或3；条件是化合物不是
2.化合物和定义
本文所用的术语“卤代”和“卤素”是指选自氟(氟代，-f)、氯(氯代，-cl)、溴(溴代，-br)和碘(碘代，-i)的原子。
如本文所用，术语“个体”和“患者”可互换使用，并且是指需要治疗的哺乳动物，例如宠物(如狗、猫等)，家畜(例如牛、猪、马、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。通常，个体是需要治疗的人。
本文的化合物可以以药学上可接受的盐的形式存在。对于在药物中的用途，本发明化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。药学上可接受的盐形式包括药学上可接受的酸性/阴离子盐或碱性/阳离子盐。
药学上可接受的酸性/阴离子盐包括但不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、碳酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙二醇戊酸盐、己基异琥珀酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐和甲苯磺酸盐。
3.示例性化合物的描述
在第一个实施方案中，本公开提供式i的化合物或其药学上可接受的盐、多晶型物或溶剂合物，
其中变量如上所述。或者，本公开提供式i的化合物或其药学上可接受的盐。
在第二个实施方案中，式i化合物具有式ii或iii或其药学上可接受的盐，
其中变量如上对式i所述。
在第三个实施方案中，式i化合物具有式iv或v或其药学上可接受的盐，
其中变量如上对式i和第二个实施方案所述。
在第四个实施方案中，式i、ii、iii、iv和v中的p为2，其中其余变量如上对式i和第二个或第三个实施方案所述。
在第五个实施方案中，式i、ii、iii、iv和v中的s为1或2，其中其余变量如上对式i和第二个、第三个或第四个实施方案所述。
在第六个实施方案中，式i、ii、iii、iv和v中的r2是氟，其中其余变量如上对式i和第二个、第三个、第四个或第五个实施方案所述。
在第七个实施方案中，式i、ii、iii、iv和v中的r1是氯，其中其余变量如上对式i和第二个、第三个、第四个或第五个实施方案所述。
在第八个实施方案中，式i化合物选自
化合物的具体实例在实施例中提供。在一些实施方案中，提供的化合物是选自下文实施例部分中列举的那些中的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐。也就是说，本文包括这些化合物的药学上可接受的盐以及中性形式。
在其他实施方案中，本公开提供了治疗患有与肥大细胞相关的病症的个体(例如人)的方法，其包括给患者施用有效量的式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物的步骤。与肥大细胞相关的病症包括但不限于细菌感染、过敏反应、炎性疾病、纤维化、癌症、中枢神经系统紊乱和代谢紊乱。具体病症包括例如同种异体移植物排斥、糖尿病性视网膜病变、由年龄相关性黄斑变性引起的脉络膜新生血管形成、牛皮癣、关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、关节炎中的滑膜血管收缩、多发性硬化症、重症肌无力、糖尿病、糖尿病性血管病、糖尿病性神经病变、婴儿血管瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌和头颈癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和胰腺癌、牛皮癣、纤维化、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、再狭窄、过敏、呼吸系统疾病、哮喘、移植排斥反应、血栓形成、视网膜血管增生、炎症性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、骨病、移植或骨髓移植排斥反应、狼疮、慢性胰腺炎、恶病质、感染性休克、纤维增生和分化性皮肤病或紊乱、眼部疾病、病毒感染、心脏病、肺或肺部疾病或肾病或肾脏疾病、皮肤炎症和支气管炎。
在其他实施方案中，本公开提供了延迟患有糖尿病的个体(例如人)中外周神经病变(pn)的发作、逆转或降低患有糖尿病的个体(例如人)获得外周神经病变的风险的方法，包括向个体施用有效量的式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物。
在其他实施方案中，本公开提供了延迟在需要其的个体(例如人)中外周糖尿病性神经病变(pn)的发作、逆转或降低需要其的个体(例如人)获得外周糖尿病性神经病变的风险的方法，包括向个体施用有效量的式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物。
在其他实施方案中，本公开提供了延迟患有糖尿病的个体(例如人)的伤口的发作、降低其发展的风险或加速其愈合的方法，包括向个体施用有效量的式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物。
在其他实施方案中，本公开提供了用于改变患有糖尿病的个体(例如人)的伤口中的m1/m2巨噬细胞比率的方法，包括向个体施用有效量的式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物。
在其他实施方案中，本公开提供了预防患有糖尿病的个体(例如人)中基质金属肽酶9(mmp-9)增加的方法，包括向个体施用有效量的式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物。
4.用途、制剂和给药
根据另一个实施方案，本公开提供了使用包含式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或其组合；和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合物治疗患有与肥大细胞相关的病症的个体(例如人)的方法。与肥大细胞相关的病症在上文例如[0022]段中描述。
根据另一个实施方案，本公开提供了使用包含式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或其组合、和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合物延迟患有糖尿病的个体(例如人)中的外周神经病变(pn)的发作、逆转或降低获得其的风险的方法。
根据另一个实施方案，本公开提供了使用包含式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或其组合；和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合物延迟在需要其的个体(例如人)中外周糖尿病神经病变(pn)的发作、逆转或降低获得其的风险的方法。
根据另一个实施方案，本公开提供了使用包含式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或其组合；和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合物延迟患有糖尿病的个体(例如人)的伤口的发作、降低其发展的风险或加速其愈合的方法。
根据另一个实施方案，本公开提供了使用包含式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或其组合；和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合物改变患有糖尿病的个体(例如人)的伤口中的m1/m2巨噬细胞比率的方法。
根据另一个实施方案，本公开提供了使用包含式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或其组合；和药学上可接受的载体、佐剂或媒介物的组合物预防患有糖尿病的个体(例如人)中基质金属肽酶9(mmp-9)增加的方法。
如本文所用，延迟本文所述病症(例如，外周神经病变(pn)、小纤维神经病变(sfn)和外周糖尿病神经病变)的发作、逆转或降低获得上述病症的风险或降低上述病症的发展的风险，是指在由于病症/疾病(例如糖尿病)而具有升高的肥大细胞脱粒水平的个体中减少肥大细胞脱粒的量。已经发现患有糖尿病的个体中肥大细胞脱粒增加。参见例如美国临时申请号62/162,972。
如本文所用，加速伤口愈合意指式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物引发加速或促进伤口愈合的细胞环境。例如，式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物可以引发细胞因子，例如cxcl8、ccl2和cxcl7，的释放，其中每一种都是伤口愈合第一阶段所必需的，从而促进伤口愈合。伤口愈合的第一阶段是持续约三天的炎症阶段，然后是持续两到三周的增殖阶段。在慢性伤口中，这种线性进展被消除，其特征在于存在低级慢性炎症。式i、ii、iii、iv和v的化合物或其药学上可接受的盐或组合物的施用可将慢性低级炎症转化为强烈的急性炎症期，然后进展至增殖期并促进伤口愈合。
在某些实施方案中，所提供的组合物中式i、ii、iii、iv和v的化合物的量使得其在生物样品或个体中作为肥大细胞稳定剂(例如肥大细胞脱粒抑制剂)是有效的。在某些实施方案中，配制所提供的组合物用于向需要这种组合物的个体施用。在一些实施方案中，配制所提供的组合物用于口服给予至个体。在其他实施方案中，配制所提供的组合物用于局部施用至个体。
术语“药学上可接受的载体、佐剂或媒介物”是指不破坏与其配制的化合物的药理学活性的无毒载体、佐剂或媒介物。可用于本公开的组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，例如人血清白蛋白，缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
本文所述的药学上可接受的组合物可以是以任何口服可接受的剂型给药，包括但不限于胶囊、片剂、含水悬浮液或溶液。在口服用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用含水悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
本文所述的药学上可接受的组合物还可以以可注射的形式制备。可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液，u.s.p.和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸用于制备注射剂。
本文所述的药学上可接受的组合物也可局部给药，特别是当治疗目标包括局部施用易于接近的区域或器官时，包括眼、皮肤或下肠道的疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。用于下肠道的局部施用可以以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠剂制剂实现。也可以使用局部透皮贴剂。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的组合物的本文所述化合物的量将根据所治疗的宿主和特定的给药方式而变化。在一些实施方案中，应配制所提供的组合物，使得可以向接受这些组合物的患者施用0.01-100mg/kg体重/天、例如0.1-100mg/kg体重/天的抑制剂剂量。
还应该理解，任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄率、药物组合、治疗医师的判断和所治疗的特定疾病的严重程度。本文所述化合物在组合物中的用量还取决于组合物中的特定化合物。
除非另有说明，否则术语“治疗”是指治疗性治疗。
肥大细胞的调节(或调节肥大细胞)是指从施用一种或多种本文所述化合物开始发生肥大细胞活性的变化或交替。调节可以是上调(增加)或下调(减少)肥大细胞的活性或功能的大小。示例性活性和功能包括例如结合特征、酶活性、细胞受体活化、转录活性和信号转导。在一个方面，本文描述的化合物稳定肥大细胞。在其他方面，本文描述的化合物充当肥大细胞脱粒抑制剂。
实施例
如下文实施例中所述，在某些示例性实施方案中，根据以下一般程序制备化合物。应当理解，尽管一般方法描述了本文某些化合物的合成，但是以下的一般方法和本领域普通技术人员已知的其他方法可以应用于如本文所述的所有化合物和这些化合物的每个亚类和每一种。
合成的一般描述
使用容易获得的原料、试剂和常规合成方法，可以根据下列反应方案和实施例或其改进容易地制备本文所述的化合物。在这些反应中，还可以使用本领域普通技术人员已知的但没有更详细地提及的变体。此外，根据以下反应方案和实施例，本领域普通技术人员将容易明白制备本文所述化合物的其他方法。
例如，其中x为co且y为nh的式i化合物可通过使式100化合物与式110化合物在有机溶剂(例如dmf)中在碱(例如nah)存在下反应来制备，形成式120的化合物。参见例如方案1。
方案1：
然后可以通过将式120化合物的羧酸部分转化为活化基团(例如通过用dmf和(cocl)2在dcm中处理的酰氯)，然后用式130化合物在碱(例如tea)存在下处理，以形成式i化合物。
方案2：
在一个替代方案中，其中x为nh且y为co的式i化合物可通过使式140化合物与式110化合物在有机溶剂(例如dmf)中在碱(例如，koh)存在下反应来制备，以形成化合物150。参见方案3。
方案3：
然后可以通过使胺150与式160的化合物在有机溶剂(例如二氯甲烷)存在下反应来形成式i的化合物。
参见例如方案4。
方案4：
化合物i化合物的制备
试剂和溶剂购自市售来源并且无需进一步纯化即可使用。所有反应均按照指定的程序和条件进行。通过lc/ms分析和/或在二氧化硅涂覆的玻璃板(emd硅胶60f254)上用指定的洗脱液的薄层色谱(tlc)监测反应。通过uv光(254nm)使化合物可视化。lc/ms分析在agilent1200hplc/uv(220nm和/或254nm波长)系统上进行，该系统与质谱(appliedbiosystems，mdssciex，qtraplc/ms/ms)检测器连接。将用于分析的化合物溶解在100％dmso中，并使用含有0.1％甲酸作为改性剂的乙腈/水流动相在c18柱(粒径2.6m，尺寸：100mm×2.1mm，流速0.3ml/min，1ml注射体积)上分离。梯度从20％乙腈开始，保持2分钟，并在10分钟内线性增加至97％乙腈，在97％乙腈中保持3分钟，随后在总共17分钟内重新平衡至原始条件。
报道的化合物在254nm波长下以>95％的纯度获得。使用能够检测1h、13c、31p和15n核的5mmaswpfg探针，在varianmercuryplusnmr光谱仪上，在400.13mhz的1h频率下操作，记录核磁共振(1hnmr)光谱。质子化学位移(ppm)参考四甲基硅烷内标(0ppm)。用以下描述报告nmr数据：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；br，宽峰。
根据下面概述的一般程序制备式i化合物。
实施例1
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(2,6-二氟苯基)吲哚-3-甲酰胺
在0℃下，向吲哚(806mg)的dmf(10ml)溶液中分批加入nah(60％在矿物油中，440mg)。将得到的悬浮液在0℃下进一步搅拌至室温，持续45分钟。将所得混合物冷却至0℃，然后逐滴加入2,4-二氯苄基氯。将反应混合物在0℃下进一步搅拌至室温，并通过tlc监测。向反应混合物中加入meoh，然后用2nhcl酸化。通过过滤分离沉淀物，得到产物为黄色固体(1.57g，98％)。1hnmr1hnmr(400mhz,d-dmso):δ12.10(br,1h,酸-h),8.12(s,1h),8.02-8.08(m,1h),7.71(d,j＝2.4hz,1h),7.42-7.48(m,1h),7.35-7.38(dd,j＝2.4,8.2hz,1h),7.19-7.23(m,2h),6.80(d,j＝8.0hz,1h),5.58(s,2h,ch2).
向吲哚羧酸(800mg)和dcm(5ml)的混合物中加入草酰氯(430μl)，然后加入1滴dmf。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，真空除去溶剂，得到粉红色固体，将其在室温下分批加入到2,6-二氟苯胺(538μl)和三乙胺(697μl)的dcm(5ml)溶液中。将所得混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物倒入水(10ml)中，过滤收集粗产物(800mg)，并通过快速色谱法进一步纯化，得到纯产物1-(2,4-二氯苄基)-n-(2,6-二氟苯基)-1h-吲哚-3-甲酰胺，化合物1，为白色固体。1hnmr(400mhz,d6-dmso):δ9.70(s,1h),8.32(s,1h),8.26(d,j＝7.4hz,1h),7.83(d,j＝2.0hz,1h),7.65(d,j＝7.8hz,1h),7.51-7.55(dd,j＝2.2,8.4hz,1h),7.40-7.49(m,1h),7.24-7.36(m,4h),7.16(d,j＝8.61hz,1h),5.68(s,2h).13cnmr:δ163.0,160.0,157.5,151.8,136.8,133.9(2),133.8,132.6,131.4,129.7,128.4,128.1,127.2,123.2,121.9,121.8,112.3,112.1,111.1,109.8,47.4.ms(esi+):431.5[m]+,433.4[m+2]+.
实施例2
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-2,6-二氟-苯甲酰胺(2)
室温下将1h-吲唑-3-胺(1.33g，10mmol)加入到制备的(60℃预热1小时，在室温下搅拌过夜)粉碎的koh(1.4g，25mmol)在dmso(200ml)中的棕色悬浮液中。在室温下进一步搅拌所得悬浮液30分钟。一次性加入2,4-二氯苄基氯(1.74ml，12.5mmol)。在室温下进一步搅拌反应混合物5小时。将水(300ml)加入到反应混合物中。通过过滤分离形成的黄色沉淀物(2.2g，72％收率)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ7.69(d,j＝8hz,1h),7.61(d,j＝1.6hz,1h),7.38(d,j＝8.4hz,1h),7.27-7.33(m,2h),6.93(t,j＝7.2hz,1h),6.80(d,j＝8.8hz,1h),5.528(s,br,2h),5.36(s,2h).ms(esi+)m/z计算值[c14h11cl2n3]291.03,实测值[m+h]+292.
在室温下，向2,6-二氟苯甲酸(80mg，0.25mmol)的dcm(1ml)溶液中加入草酰氯(32μl，0.38mmol)和dmf(一滴)。将混合物搅拌30分钟。将1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-胺(73mg，0.25mmol)溶于dcm(1ml)中，加入tea(53μl，0.38ml)并搅拌30分钟。将两种溶液冷却至-20℃(10分钟)，合并并在-20℃下搅拌1小时。加入甲醇(2ml)。随后将浅黄色溶液滴加到水(8ml)中。加入己烷(4ml)并将溶液冷却至-20℃过夜。将形成的沉淀物用水和己烷洗涤，在真空下干燥，得到所需产物1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ11.28(s,1h),7.83(d,j＝8.4hz,1h),7.70(d,j＝8.4hz,1h),7.66(d,j＝2.0hz,1h),7.53-7.60(m,1h),7.44(dt,j＝7.6hz,1.2hz,1h),7.38(dd,j＝8.4hz,2.0hz1h),7.14-7.26(m,3h),6.96(d,j＝8.4hz,1h),5.67(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h13cl2f2n3o]431.04,实测值432.4[m+h]+.
实施例3
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-2-氟-苯甲酰胺(3)
按照实施例2中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ9.11(d,j＝14hz,1h),8.24(t,j＝7.4hz,1h),8.12(d,j＝4.4hz,1h),7.98-8.04(dt,j＝7.6hz1.2hz,1h),7.07-7.44(m,7h),6.76(d,j＝8.4hz,1h),5.58(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h13cl2f2n3o]413.05,实测值414.5[m+h]+.
实施例4
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-3-氟-吡啶-4-甲酰胺(4)
按照实施例2中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.93(d,j＝12.8hz,1h),8.70(d,j＝2.4hz,1h),8.67(dd,j＝4.8hz,0.8hz,1h),8.05-8.13(m,2h),7.43(d,j＝2.4hz,1h),7.39-7.43(m,1h),7.32(d,j＝8.8hz,1h),7.22(t,j＝7.6hz,1h),7.12(dd,j＝2.0,8.4hz,1h),6.77(d,j＝8.4hz,1h),5.59(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c20h13cl2fn4o]414.04,实测值415.5[m+h]+.
实施例5
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-3,5-二氟-吡啶-4-甲酰胺(5)
按照实施例2中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.52(s,2h),8.15(d,j＝8.0hz,1h),7.40-7.46(m,1h),7.32(d,j＝8.4hz,1h),7.22(d,j＝7.2hz,1h),7.10(dd,j＝2.0,8.8hz,1h),6.74(d,j＝8.0hz,1h),5.55(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c20h12cl2f2n4o]432.04,实测值433.5[m+h]+.
实施例6
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-2,4-二氟-苯甲酰胺(6)
按照实施例2中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.87(s,1h),7.82(d,j＝8.0hz,2h),7.65-7.70(m,2h),7.36-7.45(m,3h),7.12-7.23(m,2h),7.96(d,j＝8.0hz,2h),5.65(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h13cl2f2n3o]431.04,实测值432.4[m+h]+.
实施例7
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(2,6-二氟苯基)吲唑-3-甲酰胺(7)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.06(s,1h,酰胺),8.20(s,1h),7.81(d,j＝8.8hz,1h),7.72(d,j＝2.4hz,1h),7.52(t,j＝8.0hz,1h),7.34-7.41(m,3h),7.20(t,j＝8.0hz,2h),6.88(d,j＝8.4hz,1h),5.90(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h13cl2f2n3o]431.04,实测值432.5[m+h]+.
实施例9
n-(2-氯-6-氟-苯基)-1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-甲酰胺(8)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.48(s,1h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.19-7.47(m,6h),7.11-7.16(m,2h),6.76(d,j＝8.0hz,1h),5.72(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h13cl3fn3o]447.01,实测值448.5[m+h]+.
实施例10
1-(2,4-二氯苄基)-n-(3-氟吡啶-4-基)-1h-吲哚-3-甲酰胺(9)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.56(s,1h,酰胺),8.29(s,2h),816-8.20(m,1h),7.72(d,j＝2.4hz,1h),7.65-7.71(m,1h),7.52(d,j＝7.6hz,1h),7.41(dd,j＝2.0,8.4hz,1h),7.16-7.29(m,4h),7.00(d,j＝8.4hz,1h),5.57(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c22h15cl2fn2o]412.05,实测值413.4[m+h]+.
实施例11
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(2-氟苯基)吲唑-3-甲酰胺(10)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.78(s,1h,酰胺),8.29(s,2h),8.24(d,j＝7.6hz,1h),7.84-7.90(m,1h),7.80(d,j＝8.0hz,1h),7.70(d,j＝1.6hz,1h),7.51(t,j＝7.2hz,1h),7.34-7.39(m,1h),7.25-7.34(m,1h),7.20-7.24(m,1h),6.91(d,j＝8.4hz,1h),5.88(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h14cl2fn3o]413.05,实测值413.4[m+h]+.
实施例12
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(3-氟-4-吡啶基)吲哚-3-甲酰胺(11)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.04(s,1h),8.62(d,j＝2.8hz,1h),8.43(s,1h),8.35(d,j＝6.0hz,1h),8.12-8.21(m,2h),7.67(d,j＝2.0hz,1h),7.46-7.50(m,1h),7.35(dd,j＝2.0,8.4hz,1h),7.16-7.24(m,2h),6.92(d,j＝8.8hz,1h),5.55(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h14cl2fn3o]413.05,实测值414.4[m+h]+.
实施例13
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-3-氟-吡啶-4-甲酰胺(12)
按照实施例2中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ9.27(s,1h,酰胺),8.60(t,j＝6.4hz,1h),8.48(s,1h),8.38-8.44(m,1h),7.36-7.50(m,4h),7.14(dd,j＝2.0,8.4hz,1h),6.75(d,j＝8.0hz,1h),5.75(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c20h13cl2fn4o]414.04,实测值415.5[m+h]+.
实施例14
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(2,4-二氟苯基)吲哚-3-甲酰胺(13)
按照实施例2中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.60(d,j＝3.2hz,1h,酰胺),8.25(d,j＝5.2hz,1h),8.14-8.19(m,1h),7.68-7.76(m,1h),7.58-7.66(m,1h),7.46-7.56(m,1h),7.36-7.45(m,1h),7.26-7.35(m,1h),7.14-7.25(m,2h),7.03-7.12(m,1h),6.96-7.03(m,1h),5.56(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c22h14cl2f2n2o]430.04,实测值431.4[m+h]+.
实施例15
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(2,4-二氟苯基)吲唑-3-甲酰胺(14)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.91(s,1h),8.21(d,j＝8.0hz,1h),7.69-7.82(m,3h),7.47-7.53(m,1h),7.31-7.40(m,3h),7.06-7.14(m,1h),6.88(d,j＝8.8hz,1h),5.88(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c21h13cl2f2n3o]431.04,实测值432.4[m+h]+.
实施例16
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(3,5-二氟-4-吡啶基)吲唑-3-甲酰胺(15)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.52(s,1h,酰胺),8.60(s,2h),8.19(d,j＝8.8hz,1h),7.81(d,j＝8.8hz,1h),7.71(d,j＝2.4hz,1h),7.50-7.55(m,1h),7.34-7.40(m,2h),6.86(d,j＝8.4hz,1h),5.91(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c20h12cl2f2n4o]432.04,实测值433.5[m+h]+.
实施例17
1-[(2-氯苯基)甲基]-n-(2,6-二氟苯基)吲哚-3-甲酰胺(16)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.61(s,1h),8.25(s,1h),8.16(d,j＝7.2hz,1h),7.50-7.58(m,2h),7.27-7.40(m,3h),7.13-7.06(m,4h),7.05(dd,j＝7.6hz,1.6hz,1h),5.59(s,2h).ms(esi+)m/z计算值[c22h15clf2n2o]396.08,实测值397.5[m+h]+.
实施例18
1-[(4-氯苯基)甲基]-n-(2,6-二氟苯基)吲哚-3-甲酰胺(17)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.61(s,1h),8.32(s,1h),8.13(d,j＝6.8hz,1h),7.55(d,j＝8.0hz,1h),7.26-7.44(m,5h),7.13-7.24(m,4h),5.12(s,2h).ms(esi+):msm/z计算值[c22h15clf2n2o]396.08,实测值397.4[m+h]+.
实施例19
1-[(2,6-二氯苯基)甲基]-n-(2,6-二氟苯基)吲哚-3-甲酰胺(18)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.56(s,1h),8.16(d,j＝7.6hz,1h),7.91(s,1h),7.73(d,j＝6.8hz,1h),7.65(d,j＝7.6hz,2h)；7.53(dd,j＝8.4hz,7.6hz,1h)(s,1h),7.27-7.34(m,2h),7.13-7.22(m,3h),5.28(s,2h),ms(esi+)m/z计算值[c22h14cl2f2n2o]:431.26；found:432.4[m+h]+.
实施例20
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-4-甲基-噻二唑-5-甲酰胺(19)
按照实施例2中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ11.39(s,1h),7.82(d,j＝8.4hz,1h),7.72(d,j＝8.8hz,1h),7.66(d,j＝2.0hz,1h),7.42-7.47(m,1h),7.37-7.40(dd,j＝2.0,8.4hz,1h),7.16(t,j＝7.4hz,1h),7.00(d,j＝8.0hz,1h),5.67(s,2h,ch2),2.83(s,3h,ch3).ms(esi+)m/z计算值[c19h14cl2n4os]416.03,实测值417.5[m+h]+.
实施例21
n-[1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-基]-3-甲基-吡啶-4-甲酰胺(20)
室温下将1h-吲唑-3-胺(1.33g，10mmol)加入到制备的(60℃预热1小时，在室温下搅拌过夜)粉碎的koh(1.4g，25mmol)在dmso(200ml)中的棕色悬浮液。在室温下进一步搅拌所得悬浮液30分钟。一次性加入2,4-二氯苄基氯(1.74ml，12.5mmol)。在室温下进一步搅拌反应混合物5小时。将水(300ml)加入到反应混合物中。通过过滤分离形成的黄色沉淀物(2.2g，72％收率)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ7.69(d,j＝8hz,1h),7.61(d,j＝1.6hz,1h),7.38(d,j＝8.4hz,1h),7.27-7.33(m,2h),6.93(t,j＝7.2hz,1h),6.80(d,j＝8.8hz,1h),5.528(s,br,2h),5.36(s,2h).ms(esi+)m/z计算值[c14h11cl2n3]291.03,实测值[m+h]+292.
在室温下，向3-甲基吡啶-4-羧酸(80mg，0.25mmol)的dcm(1ml)溶液中加入草酰氯(32μl，0.38mmol)和dmf(一滴)。将混合物搅拌30分钟。将1-[(2,4-二氯苯基)甲基]吲唑-3-胺(73mg，0.25mmol)溶于dcm(1ml)中，加入tea(53μl，0.38ml)并搅拌30分钟。将两种溶液冷却至-20℃(10分钟)，合并并在-20℃下搅拌1小时。加入甲醇(2ml)。随后将浅黄色溶液滴加到水(8ml)中。加入己烷(4ml)并将溶液冷却至-20℃过夜。将形成的沉淀物用水和己烷洗涤，真空干燥，得到所需产物20(78mg，76％收率)。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ11.01(s,1h),8.55(s,1h),8.52(d,j＝5.2hz,1h),7.84(d,j＝8.8hz,1h),7.66-7.71(m,2h),7.50(d,j＝5.6hz,1h),7.36-7.46(m,2h),7.16(t,j＝7.2hz,1h),6.97(d,j＝8.4hz,1h),5.67(s,2h,ch2),2.42(s,3h,ch3).ms(esi+)m/z计算值[c21h16cl2n4o]410.07,实测值411.5[m+h]+.
实施例22
1-[(2,4-二氯苯基)甲基]-n-(噻二唑-5-基)吲唑-3-甲酰胺(21)
按照实施例1中所述的方法，用合适的起始原料制备标题化合物。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ12.89(s,1h),8.84(s,1h),8.24(d,j＝8.0hz,1h),7.78(d,j＝8.0hz,1h),7.67(d,j＝2.4hz,1h),7.48-7.53(m,1h),7.35-7.40(m,1h),7.30(dd,j＝8.4hz2.0hz,,1h),6.74(d,j＝8.4hz,1h),5.90(s,2h,ch2).ms(esi+)m/z计算值[c17h11cl2n5os]403.01,实测值404.4[m+h]+.
实施例23
n-(2,6-二氟苯基)-1-[[2-(三氟甲氧基)苯基]甲基]吲哚-3-甲酰胺(22)
按照通用方法b制备。1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ9.61(s,1h),8.27(s,1h),8.15(d,j＝7.0hz,1h),7.44-7.51(m,3h),7.33-7.37(m,2h),7.10-7.24(m,5h),5.58(s,2h),ms(esi+)m/z计算值[c23h15f5n2o2]:446.37；实测值447.4[m+h]+
1-(2,4-二氯苄基)-n-(2-氟苯基)-1h-吲哚-3-甲酰胺
可以按照上述方法制备标题化合物。
生物学数据
一般程序
细胞内ca2+浓度的测量。
将rbl-2h3细胞(atcc)以4×104个细胞/孔接种于在补充有2％fbs的dmem中的96孔板中，并使其粘附过夜。然后用50μl不含ca2+的tyrode溶液替换培养基，以1：1将ca2+-探针fluo-4nw(molecularprobe，thermofisher，ma，usa)加载到细胞中。在探针加载期间从开始提供指定浓度的新化合物。将细胞在存在或不存在新化合物的情况下在不含ca2+的培养基中于37℃温育60分钟。在温育的最后5分钟期间，用1μm毒胡萝卜素(sigmaaldrich)处理细胞以消耗[ca2+]er。将在盐水溶液中的20mmcacl2补充回至[ca2+]er耗尽的细胞，最终为2mm。在再加载ca2+后1分钟除去细胞培养基，并用多模板读数器(filtermaxf5，moleculardevices/thermofisherscientific，ma，usa)记录fluo-4nw荧光(rfu)的变化，激发波长为485nm，发射波长为535nm。
核nfat、脱粒和细胞因子释放。
rbl2h3细胞中的[ca2+]er在crac通道阻断剂存在下以与[ca2+]i测量相同的方式通过tg耗尽，但不用fluo-4nw加载细胞。然后在相应浓度的crac通道阻断剂存在下补充200μldmem-3％fbs(含有3mmca2+)。在添加ca2+后30分钟，收集培养上清液用于脱粒测量。根据测定试剂盒(sigma-aldrich，mo，usa)的方案测量脱粒作为分泌的β-己糖胺酶。通过使用亚细胞蛋白质分级试剂盒(ne-pertmnuclearandcytoplasmicextractionreagents，piercebiotechnology，thermofisherscientific，ma，usa)从nfat细胞制备核部分。用elisa试剂盒(activemotif，ca，usa)测量核nfat-c1。此时，用elisa试剂盒(r&dsystems，mn，usa)测量tnfα作为预先存储的释放。在ca2+添加后的部分中，延长温育4小时以测量细胞因子tnfα的从头产生。
细胞毒性。
在rbl-2h3细胞中测试毒性。将细胞以4×104个细胞/孔接种于在补充有2％fbs的dmem中的96孔板中，并使其粘附过夜。然后将细胞以指定浓度暴露于mcs化合物4小时。通过使用计数测定法(cck8细胞计数试剂盒，dojindomoleculartechnologies，md，usa)测定细胞活力。
数据分析。使用primsgraphpad软件通过非线性回归计算ic50和ec50。通过单向anova和事后检验(tukey检验)进行统计学分析。
抑制活性
使用rbl-2h3啮齿动物mc细胞系作为主要的体外试验测定所述化合物对钙流入的抑制活性。已知rbl-2h3细胞表达功能性crac通道。毒胡萝卜素(tg)是一种肌质网/内质网(er)ca2+-atp酶(serca)抑制剂，通过消耗er储存中的ca2+([ca2+]er)选择性激活crac通道。fluo-4nw被用作分子传感器来检测细胞内钙浓度([ca2+]i)。在这些测定条件下，在用tg(1μm)处理的rbl细胞中始终观察到比未处理的静息mc中高约3.5倍的[ca2+]i。ic50结果如表1所示。
表1
化合物12用于通过测量mc活化时预先储存的β-己糖胺酶(β-hex)的释放来确定mc脱粒的抑制。在不存在或存在各种浓度的化合物12的情况下，通过在不含ca2+培养物中处理1μm毒胡萝卜素来活化rbl-2h3细胞。在测定培养基补充细胞外ca2+30分钟后，通过elisa分析上清液和细胞裂解物的β-hex浓度。上清液中的β-hex与β-hex的总量(在上清液和细胞裂解物中)之间的比率表明，化合物12显著地且剂量依赖性地抑制β-hex的释放(参见图3)。在不存在crac抑制剂的情况下，释放出40％的β-hex，而化合物12在所测试的最高浓度下显示出几乎完全抑制β-hex的释放。
测定化合物12在活化的mc中对活化的t细胞核因子(nfat)的核转位的抑制。核因子nfat是许多细胞因子(包括tnfα)的主要调节因子。细胞溶质nfat被磷酸酶钙调神经磷酸酶去磷酸化，这导致nfat的核转位和随后的用于表达相应的细胞因子基因激活。在不存在或存在各种浓度的化合物12的情况下，首先用不含ca2+培养物中的1μm毒胡萝卜素处理rbl细胞，然后用细胞外ca2+补充30分钟。通过亚细胞蛋白质分级从细胞制备核部分，并通过elisa测量核nfat-c1含量。与静息mc相比，活化mc中核nfat的成倍增加表明mc的活化水平。在没有crac通道阻断剂的情况下，我们观察到活化的mc中核nfat增加了5倍，并且化合物12显著地且剂量依赖性地降低了活化的rbl细胞中nfat-c1的核部分(图4)。此外，在10μm和更高浓度下，化合物12能够将核nfat的水平恢复为静息mc的水平。
选择某些化合物并证明了通过活化的mc对tnfα蛋白产生的剂量依赖性抑制。肥大细胞可以在激活后立即分泌预先储存的tnfα，以及需要几个小时才能产生的从头合成的tnfα。在存在各种浓度的crac通道阻断剂的情况下，如上所述类似地激活rbl细胞。将rbl细胞再次暴露于ca2+4小时后，通过elisa测量上清液中分泌的tnfα(其导致预先储存的和从头合成的tnfα的组合蛋白)。化合物显示出对tnfα蛋白分泌的剂量依赖性抑制(表2)。
表2
糖尿病小鼠的伤口愈合
使用链脲佐菌素(stz)使c57b16小鼠患糖尿病(dm)，并使用四氧嘧啶使兔子患dm。选择10天的伤口愈合期，因为非dm小鼠和兔子中至少80％的伤口在该时间点愈合。按照wo2014/169250中描述的方法产生基于藻酸盐绷带的用于局部持续释放化合物1的敷料，然后在受伤前(伤前)或受伤后(伤后)应用于dm小鼠的剃毛的背部。在非dm和dm小鼠中对fda批准的mc稳定剂、色甘酸二钠(dscg)、50mg/kgdscg(每天腹膜内(ip)，创伤前连续10天)进行比较，然后进行伤口手术。监测伤口愈合10天。
正如所料，每日腹膜内注射dscg改善了糖尿病小鼠伤口愈合。见图1，*p<0.05。然而，还发现化合物1的局部施用(伤前10天或伤后10天)改善了伤口愈合，类似于全身性dscg预处理。见图1。另外，在dm小鼠的皮肤中，用化合物1处理10天，而没有任何伤口，增加了m2巨噬细胞的数量。见图2。类似地，dscg处理降低了完整皮肤中的m1/m2比率。不希望受理论束缚，后来的这些结果表明mc稳定剂最有可能通过增加m2来促进m1/m2比率降低。
虽然我们已经描述了许多实施方案，但显然可以改变我们的基本实施例以提供利用本发明化合物和方法的其他实施方案。因此，应当理解，本发明的范围由所附权利要求限定，而不是由已经通过示例表示的具体实施方案限定。
本申请中引用的所有参考文献(包括参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的内容在此通过引用整体明确地并入本文。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均符合本领域普通技术人员通常知晓的含义。