使用FOXB2基因的癌细胞的判定方法与流程

本发明涉及一种使用FOXB2基因的癌细胞的判定方法。

背景技术：

将一类具有叉头或翼状螺旋DNA结合域的转录因子称为叉头框(Forkhead box，FOX)，在人体中存在约50种。FOX主要作为生长调节因子、组织特异性调节因子、细胞周期调节因子发挥作用，但是，许多FOX的作用几乎尚未阐明。其中，已报告了FOXB2在非洲爪蟾中参与形成胚胎神经，然而，其在哺乳动物中的功能还尚未明确。

另一方面，已知DNA的甲基化与癌变有关，在日本特开2008-283947(专利文献1)中，记载有一种基于FOXB2基因的CpG岛(CpG二核苷酸：-CG-序列)中的甲基化率检测食道癌的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-283947。

技术实现要素：

发明所要解决的课题

在上述专利文献1中，记载了癌细胞的CpG二核苷酸的胞嘧啶大多发生甲基化，而且，还记载了采用BAMCA法(Bacterial Artificial chromosome array-based Methylated CpG island Amplification，细菌人工染色体的甲基化CpG岛扩增阵列法)测定食道癌的FOXB2基因并确认了CpG二核苷酸的胞嘧啶被甲基化。然而，为了通过该方法判定是否为癌细胞，需要解读碱基序列来确认CpG二核苷酸的胞嘧啶是否被甲基化。因此，期待一种简单地判定细胞是否为癌细胞的方法。即，本发明的课题在于，提供一种能够简单地判定癌细胞的方法。

用于解决课题的手段

本发明人等对作为容易辨别癌细胞和正常细胞的方法的亚硫酸氢盐反应产物的检测方法进行了专心研究，其结果发现了：对包含亚硫酸氢盐反应后的FOXB2基因的启动子区域中特定的碱基序列的核酸进行扩增并进行电泳，从而能够将来自癌细胞的扩增产物和来自正常细胞的扩增产物分离。对于进行亚硫酸氢盐反应后扩增的碱基序列而言，癌细胞和正常细胞均为相同的长度，因此，可以认为，难以通过电泳将这些细胞的扩增产物分离。但是，意想不到地发现对包含特定的碱基序列的核酸进行扩增时，能够将来自癌细胞的扩增产物和来自正常细胞的扩增产物分离，从而本发明人等完成了本发明。

即，本发明涉及下述内容。

“癌细胞的判定方法，其中，其包括下述工序1～3，

(1)工序1，使至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的来自细胞的核酸进行亚硫酸氢盐反应；

(2)工序2，对通过工序1得到的反应产物中的至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增；以及

(3)工序3，基于使通过工序2得到的扩增产物进行电泳的结果，判定该细胞是否为癌细胞”；

“引物组，其中，其由序列号6所示的碱基序列构成的正向引物、以及由序列号8的一部分或全部构成且至少包含序列号7所示的碱基序列的碱基序列构成的反向引物或者由序列号9所示的碱基序列构成的反向引物构成”；以及

“细胞的癌判定用试剂，其中，其包含前述引物组”。

发明的效果

根据本发明的方法，不需要像以往方法那样对碱基序列进行解读，在不进行限制性酶处理等的情况下，对由亚硫酸氢盐反应产物的特定碱基序列构成的核酸进行扩增，并使得到的扩增产物进行电泳，从而能够判定目标细胞是否为癌细胞。即，能够通过非常简单的方法在短时间内判定目标细胞是否为癌细胞。另外，由于不需要对碱基序列进行解读、不需要进行限制性酶处理等，因此，也具有能够削减这些步骤所需要的成本、工夫的优点。进一步地，本发明的方法还能够判定良性肿瘤为非癌细胞，能够以高精度判定癌。

附图的简单说明

图1示出了在实施例1中使用hiPS(人正常皮肤成纤维细胞)的正常细胞和人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)的癌细胞通过本发明的方法对PCR扩增产物进行电泳的结果。

图2示出了在实验例1中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对胞嘧啶的甲基化进行分析的结果。

图3示出了在实施例2中对使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞的FOXB2启动子区域的质粒得到的PCR扩增产物进行电泳的结果、以及在比较例1中使用hiPS的正常细胞和人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)的癌细胞对FOXB1基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。

图4示出了在比较例2中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对FOXB2基因的扩增序列1进行电泳的结果。

图5示出了在比较例2中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对FOXB2基因的扩增序列2进行电泳的结果。

图6示出了在比较例2中使用hiPS的正常细胞和U251-MG-P1的癌细胞对FOXB2基因的扩增序列3进行电泳的结果。

图7-1示出了在实施例3中使用来自乳癌患者的细胞(正常组织、肿瘤、淋巴结)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。

图7-2示出了在实施例3中使用来自乳癌患者的细胞(正常组织、肿瘤、淋巴结)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。

图7-3示出了在实施例3中使用来自乳癌患者的细胞(正常组织、肿瘤、淋巴结)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。

图8-1示出了在实施例4中使用来自大肠癌患者的细胞(正常组织、肿瘤)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。

图8-2示出了在实施例4中使用来自大肠癌患者的细胞(正常组织、肿瘤)对FOXB2基因的PCR扩增产物进行电泳的结果。

具体实施方式

[本发明的癌细胞的判定方法]

本发明的癌细胞的判定方法(以下，有时简称为本发明的方法)由以下工序组成：(1)工序1，使至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的来自细胞的核酸进行亚硫酸氢盐反应；(2)工序2，对通过工序1得到的反应产物中的至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增；以及(3)工序3，基于使通过工序2得到的扩增产物进行电泳的结果，判定该细胞是否为癌细胞。

[工序1]

只要工序1中的核酸是至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸且来自细胞即可。

对于该细胞而言，根据待判定的癌选择该细胞的种类，例如，可举出来自肾脏、子宫、肝脏、乳腺、卵巢、大肠(结肠、直肠)、前列腺、肺、胰腺等上皮细胞的细胞；中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等白细胞；骨髄细胞、T细胞等来自造血器官的细胞；来自肉瘤等非上皮性细胞的细胞；神经母细胞等来自神经的细胞等，优选来自上皮细胞的细胞，其中，优选来自乳腺、肺、大肠等上皮细胞的细胞。另外，对于该细胞而言，优选来自哺乳动物的细胞，特别优选来自人的细胞。

另外，对于该细胞而言，能够通过自身公知的方法从血液(全血、血清和血浆)、淋巴液、尿、乳头分泌物、粪便等体液、组织、细胞等生物体试样、这些试样的培养物等试样中获取。

对于工序1中的核酸而言，只要从上述细胞中提取即可，该提取方法基于自身公知的DNA的提取方法进行即可。作为该DNA的提取方法，具体而言，例如，可举出将试样与包含表面活性剂(胆酸钠、十二烷基硫酸钠等)的处理液混合，对得到的混合液进行物理处理(搅拌、均质化、超声波粉碎等)，使试样中所含的DNA在混合液中游离从而来提取DNA的方法、使用苯酚/氯仿从试样中提取DNA的方法、柱提取法。其中，优选使用苯酚/氯仿从试样中提取DNA的方法以及柱提取法。

使用苯酚/氯仿从试样中提取DNA的方法是指使用作为蛋白质改性剂的苯酚和促进蛋白质改性的氯仿来除去试样中存在的蛋白质从而提取DNA的方法。具体的方法基于自身公知的方法进行即可，也可以使用市售的试剂盒[例如Phase Lock Gel(商品名，量子生物科技公司(QTB株式会社)制)等]进行。

另外，柱提取法是指在内部具有膜等的柱等筒状容器中添加试样，利用物质的大小、吸附力、电荷、疏水性等差异从试样中提取DNA的方法。具体的方法基于自身公知的方法进行即可，也可以使用市售的试剂盒[例如QuickGene SP DNA组织提取试剂盒(仓敷纺织公司(倉敷紡績株式会社)制)等]进行。

作为工序1中的核酸，例如，在判定肝癌的情况下，只要使用来自肝细胞的核酸中至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸即可，例如，在判定前列腺癌的情况下，只要使用来自前列腺细胞的核酸中至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸即可。另外，在判定白细胞是否为癌细胞的情况下，使用从血液中取出的(分离的)白细胞或血液本身，只要使用来自白细胞的核酸中至少包含序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸即可。

只要工序1中的核酸是至少包含存在于FOXB2基因的启动子区域的序列号2所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸即可。序列号1所示的碱基序列是FOXB2基因的一部分，其是被推定为FOXB2基因的启动子区域的区域的碱基序列。需要说明的是，在本说明书中，FOXB2基因不仅包括FOXB2蛋白质的结构基因，而且包括其启动子区域、增强子区域、沉默子区域等。

作为工序1中的核酸的优选例，例如，可举出基因组DNA、至少包含序列号3所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸、至少包含序列号4所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸、以及至少包含序列号5所示的碱基序列且包含序列号1所示的碱基序列的一部分或全部的核酸，其中，特别优选基因组DNA。

需要说明的是，在基因银行登记号AL353637的碱基号106566-107065中记载有上述序列号1所示的碱基序列，在同一登记号的碱基号106812-106961中记载有上述序列号2所示的碱基序列，在同一登记号的碱基号106779-106990中记载有上述序列号3所示的碱基序列，在同一登记号的碱基号106779-106995中记载有上述序列号4所示的碱基序列，在同一登记号的碱基号106779-107065中记载有上述序列号5所示的碱基序列。

对于工序1而言，只要按照例如WO2013/089063等中记载的自身公知的亚硫酸氢盐法进行即可，具体而言，例如，对从上述细胞中提取的上述核酸，如果有需要，进行单链化处理后，使其与亚硫酸盐反应从而将胞嘧啶磺酸化，然后使磺酸化的胞嘧啶水解，进一步地，在碱存在的条件下进行脱磺酸化，由此进行。根据该反应，甲基化胞嘧啶不反应而保持原有状态，只有非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。

对于工序1而言，可以在WO2013/089063记载的存在由下述通式[1]～[8]表示的化合物中的至少一种的条件下进行亚硫酸氢盐反应。对于该情况下的这些化合物中的取代基(R1～R39)的具体例、化合物的具体例、化合物的用量、其使用方法等而言，只要按照WO2013/089063的记载进行设定、实施即可。

由通式[1]表示的化合物

(式中，R1～R6各自独立地表示氢或碳数为1～6的烷基，n表示1～3的整数)。

由通式[2]表示的化合物

(式中，Y表示碳原子、氧原子或氮原子，R7～R12各自独立地表示氢原子或碳数为1～6的烷基，k表示0～2的整数，当Y为氧原子时，k表示0；当Y为氮原子时，k表示1；当Y为碳原子时，k表示2)。

由通式[3]表示的化合物

(式中，R13～R15各自独立地表示氢原子或碳数为1～6的烷基)。

由通式[4]表示的化合物

(式中，R17和R19各自独立地表示氢原子、氨基或碳数为1～6的烷基，R16、R18和R20各自独立地表示氢原子、氨基、碳数为1～6的烷基或碳数为2～6的二烷基氨基，R16、R17、与R16相邻的碳原子以及与R17相邻的碳原子可以共同形成苯环)。

由通式[5]表示的化合物

(式中，R21和R22各自独立地表示碳数为1～6的烷基，X1表示抗衡阴离子(counter anion))。

由通式[6]表示的化合物

(式中，R23表示碳数为1～6的烷基，R24～R28各自独立地表示氢原子或碳数为1～6的烷基，X2表示抗衡阴离子)。

由通式[7]表示的化合物

(式中，R29～R34各自独立地表示氢原子或碳数为1～6的烷基)。

由通式[8]表示的化合物

[式中，Z表示氮原子或碳原子，m表示0或1的整数，当Z为氮原子时，m表示0；当Z为碳原子时，m表示1。R35～R39各自独立地表示氢或碳数为1～6的烷基]。

工序1中的核酸在将该核酸溶解在水(灭菌水)、缓冲液等溶液中的状态下使用。作为该缓冲液，例如，可举出pH6～8的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等两性离子缓冲液(Good’s缓冲液)、磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸氢钠缓冲液等。作为此处使用的溶液，优选灭菌水。对该溶液中的DNA量没有特别的限定，通常在溶液1～10μL中为10ng～1μg。

可以通过自身公知的单链化处理进行工序1中核酸的单链化处理。例如，可举出：例如，通过在通常为80～100℃、优选为85～95℃的条件下，通常加热30秒～10分钟、优选加热1～3分钟而进行的热处理；例如，通过使工序1中的核酸接触碱而进行的碱处理等，优选热处理。特别是，在存在由通式[1]～[8]表示的化合物的条件下进行亚硫酸氢盐反应时，即使将反应温度设为80～100℃，也能够在DNA不分解的情况下进行反应，因此，可以使工序1中的核酸在80～100℃条件下进行亚硫酸氢盐反应，使单链化处理和亚硫酸氢盐反应同时进行，简化了处理，因此，在进行单链化处理的情况下，更优选该方法。

作为上述碱处理，具体而言，例如，在工序1中的核酸或包含该核酸的溶液中添加碱或碱的水溶液，将溶液设为通常pH10～14、优选pH12～14的碱性，由此进行碱处理。作为该碱，例如，可举出氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物；氢氧化钡、氢氧化镁、氢氧化钙等碱土类金属氢氧化物；碳酸钠等碱金属的碳酸盐；氨、胺类等，其中，优选氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物，在这些碱中，特别优选氢氧化钠。

在上述亚硫酸氢盐反应中，作为工序1中的核酸和亚硫酸盐反应中的亚硫酸盐，例如，可举出亚硫酸氢钠、亚硫酸铵等，优选亚硫酸氢钠。对于其用量而言，通常在工序1中包含50～500ng核酸的1～500μL溶液中以使反应液中的最终浓度达到1～6mol/L的方式来添加。对于该工序1中的核酸与亚硫酸盐的反应而言，在通常为30～100℃、优选为50～100℃、更优选为80～95℃的温度条件下，使反应通常进行60分钟～20小时，优选进行60分钟～5小时，更优选进行60分钟～3小时，由此进行该工序1中的核酸与亚硫酸盐的反应。通过该反应将胞嘧啶磺酸化。

对于上述亚硫酸氢盐反应中磺酸化的胞嘧啶的水解而言，只要采用本领域中常用的方法即可，没有特别的限定，在通常为30～100℃、优选为80～95℃的温度条件下，通常加热60分钟～20小时，优选加热60分钟～5小时，更优选加热60分钟～3小时，由此进行水解。此外，该水解处理也可以与上述工序1中的核酸和亚硫酸盐的反应同时进行。在该情况下，可以根据磺酸化的胞嘧啶的水解条件来设定工序1中的核酸与亚硫酸盐的反应中的反应温度和反应时间。

对于上述进行水解的工序1中的核酸而言，优选在脱磺酸化处理前进行纯化处理。该纯化处理的目的在于，除去在亚硫酸氢盐反应中使用的高浓度亚硫酸盐等，按照本领域中常用的DNA纯化方法进行即可。具体而言，可举出：例如，在工序1中的核酸或包含工序1中的核酸的溶液中添加胍盐酸盐、碘化钠等离液剂，采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)等将其分离纯化的方法；例如，利用苯酚/氯仿/异戊醇的混合溶液提取纯化的方法；醇沉淀法；利用填充了硅胶的柱进行纯化的方法；利用过滤器的过滤法等，其中，优选醇沉淀法。作为该醇沉淀法，具体如下。

即，在含有水解处理后的工序1中的核酸的溶液10μL中通常添加40～110μL的醇、30～100μL的缓冲液，进行离心分离。离心分离后，除去上清液，用醇进行洗涤，从而能够对工序1中的核酸进行分离纯化。在添加上述醇和缓冲液时，为了易于除去分离后的上清液，可以在含有工序1中的核酸的溶液10μL中添加0.1～1μL的乙醇沉淀核酸载体(Ethachinmate)、糖原。作为上述醇，可举出乙醇、异丙醇、丁醇等，特别优选异丙醇。使用异丙醇时，能够高效地仅使DNA沉淀，能够高效地进行反应。作为上述缓冲液，例如，可举出MES、HEPES等Good’s缓冲液；磷酸缓冲液；Tris缓冲液；甘氨酸缓冲液；硼酸缓冲液；碳酸氢钠缓冲液等，其中，优选MES、HEPES等Good’s缓冲液；Tris缓冲液等，特别优选Tris缓冲液。这些缓冲液的pH通常为7～8，优选为7～7.5，作为缓冲液中的缓冲剂浓度，通常为0.1～5mol/L的范围，优选为0.1～2mol/L的范围。对于上述离心分离而言，只要是本领域中通常采取的方式，就没有特别的限定，通常在12000～22000g的条件下离心分离10～30分钟。

作为上述亚硫酸氢盐反应中的在存在碱的条件下进行的脱磺酸化反应，可举出与上述单链化处理一项中的碱处理相同的方法，也可举出相同的优选方式。具体而言，例如，可以如下所述地进行。

即，在水解处理后的溶液或水解处理后进行纯化处理的溶液10μL中添加通常为1～10μL、优选为1～5μL的0.5～3mol/L的碱水溶液，将反应溶液的pH设为11～14，优选设为12～14，在通常为25～70℃、优选为30～50℃的温度条件下，通常加热5～60分钟，优选加热5～30分钟，从而进行脱磺酸化反应。

下面，说明上述工序1(亚硫酸氢盐反应)的优选具体例。

即，例如，使用DNA提取试剂盒等通过自身公知的方法从包含基因组DNA的目标细胞中提取基因组DNA，将1μg的基因组DNA溶解在例如灭菌水10～30μL中。在该溶液3～5μL中添加例如2～5mol/L的亚硫酸氢钠(pH5.0～7.0)50～100μL以及由通式[1]～[8]表示的化合物或含有这些化合物的水溶液1～12μL，以使在由通式[1]～[8]表示的化合物为液体的情况下，反应溶液中的浓度达到3～10％，在由通式[1]～[8]表示的化合物为固体的情况下，反应溶液中的浓度达到1～1000mmol/L，在80～100℃的温度条件下加热60分钟～3小时。通过该反应使基因组DNA成为单链DNA，能够在对该单链DNA中的胞嘧啶进行磺酸化的同时，将被磺酸化的胞嘧啶水解。然后，以40：60～60：40比例、优选为40：60～50：50的比例分别添加水解后的溶液的5～10倍量的1mol/L的Tris缓冲液(pH7.0～8.0)和异丙醇，使水解后的DNA沉淀。此时，如果添加1～3μL的乙醇沉淀核酸载体(Ethachinmate)、糖原，则容易确认DNA沉淀。接着，在12000～20000g的条件下离心分离10～20分钟，除去上清液，用乙醇洗涤得到的DNA。由此，能够提取纯化水解后的DNA。进一步地，将得到的1μg的DNA溶解在例如灭菌水30～40μL中，在该溶液中添加1～3mol/L的氢氧化钠5～20μL，在30～40℃的温度条件下反应20～60分钟，进行脱磺酸化。接着，如果有需要，采用例如市售的试剂盒等除去低分子量DNA并进行纯化。由此，完成了本发明的亚硫酸氢盐反应，得到基因组DNA中的非甲基化胞嘧啶被高效转化为尿嘧啶的DNA(亚硫酸氢盐处理核酸(亚硫酸氢盐反应产物))。

根据工序1，能得到使工序1中的核酸进行亚硫酸氢盐反应后的核酸，即亚硫酸氢盐反应产物。

更具体地说，通过使工序1中的核酸进行亚硫酸氢盐反应，将工序1中的核酸中未被甲基化的胞嘧啶(非甲基化胞嘧啶)转化为U(尿嘧啶)。另一方面，对于工序1中的核酸中被甲基化的胞嘧啶(甲基化胞嘧啶)而言，碱基未被转化而仍为C(胞嘧啶)。

即，亚硫酸氢盐反应产物具有工序1中的核酸中的非甲基化胞嘧啶被置换为尿嘧啶的序列。

因此，对于亚硫酸氢盐反应产物而言，基于工序1中进行亚硫酸氢盐反应的工序1中的核酸，也能够称为“与工序1中的核酸对应的核酸”。

[工序2]

工序2是对通过工序1得到的反应产物中至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物进行扩增的工序。

在工序2中扩增的核酸(以下，有时简称为本发明的目标核酸)是使在工序1中进行亚硫酸氢盐反应后的核酸(亚硫酸氢盐反应产物)中至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸进行亚硫酸氢盐反应后的核酸(亚硫酸氢盐反应产物)。

换言之，本发明的目标核酸是进行工序1的亚硫酸氢盐反应前的碱基序列由各序列号所示的碱基序列构成的核酸，其是通过使该核酸进行亚硫酸氢盐反应而得到的亚硫酸氢盐反应产物(该核酸的亚硫酸氢盐反应产物)的全部或一部分。

作为本发明的目标核酸，例如，优选至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号5所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物(使至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号5所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸进行亚硫酸氢盐反应后的核酸)，更优选至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号4所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物(使至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号4所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸进行亚硫酸氢盐反应后的核酸)，特别优选至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号3所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸的亚硫酸氢盐反应产物(使至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号3所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸进行亚硫酸氢盐反应后的核酸)。

另外，本发明的目标核酸是具有序列号2所示的碱基序列以及与其3’末端或/和5’末端连接的碱基序列的核酸。

本发明的目标核酸的碱基的个数通常为150～510个，优选为150～290个，更优选为150～220个，进一步优选为150～212个。

更具体地说，通过使核酸进行亚硫酸氢盐反应，核酸中未被甲基化的胞嘧啶(非甲基化胞嘧啶)被转化为U(尿嘧啶)。另一方面，对于核酸中被甲基化的胞嘧啶(甲基化胞嘧啶)，碱基未被转化而仍为C(胞嘧啶)。

例如，工序1的核酸为[……CG……CG……]，在其中的全部C被甲基化的情况下，工序2中扩增的碱基序列(与工序1的核酸对应的核酸)为[……CG……CG……]本身的序列。另外，工序1的核酸为[……CG……CG……]，在其中的全部C未被甲基化的情况下，工序2中扩增的碱基序列(与工序1的核酸对应的核酸)为[……UG……UG……]的序列。进一步地，工序1的核酸为[……CG……CG……]，其中的一部分C被甲基化(左侧的C)、一部分C未被甲基化(右侧的C)的情况下，工序2中扩增的碱基序列(与工序1的核酸对应的核酸)为[……CG……UG……]的序列。

因此，工序2中扩增的核酸的碱基序列根据工序1中的核酸(进行亚硫酸氢盐反应前的核酸)中的甲基化胞嘧啶的有无以及甲基化胞嘧啶的位置而发生变化。

因此，包括具有上述各种碱基序列的情况在内，也可以说本发明的目标核酸为例如与至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号1所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸对应的核酸，优选为与至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号5所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸对应的核酸，更优选为与至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号5所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸对应的核酸，进一步优选为与至少包含序列号2所示的碱基序列且由序列号3所示的碱基序列的一部分或全部构成的核酸对应的核酸。

作为对本发明的目标核酸进行扩增的方法，使用设计成对本发明的目标核酸进行扩增的引物，使上述亚硫酸氢盐反应产物进行PCR反应，从而进行扩增即可。

上述PCR反应可以按照自身公知的方法进行，例如按照《Nucleic Acids Research》(核酸研究),1991,Vol.19,3749；《BioTechniques》(生物科技),1994,Vol.16,1134-1137中记载的方法进行，具体而言，如下所述地进行：即，在作为模板的亚硫酸氢盐反应产物的核酸量1～100ng中，分别添加通常为0.1～100pmol、优选为0.1～50pmol的两种引物，并添加通常为0.05～10U(单位)、优选为0.1～5U(单位)的DNA聚合酶、以及通常为0.1～10nmol、优选为1～10nmol的四种混合脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphate，dNTPs)，在pH7～9的N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液、Tris-盐酸缓冲液等缓冲液中，例如，在93～98℃的条件下反应1～10分钟后，将(1)92～98℃、10～30秒→(2)50～60℃、10～30秒→(3)68～74℃、30秒～5分钟作为一次循环，进行20～40次循环，进一步在68～74℃条件下反应1～10分钟，从而能够对本发明的目标核酸进行扩增。

在上述PCR反应中，优选在反应后采用本领域中常用的纯化方法，例如利用苯酚/氯仿/异戊醇混合溶液提取、醇沉淀、柱纯化、利用过滤器过滤等方法来纯化得到的DNA。另外，更优选在上述纯化后提取具有目标碱基对(bp)的DNA。作为该提取方法，可举出自身公知的方法，例如，采用琼脂糖凝胶电泳的方法、采用液相色谱法的方法、采用《基因工程实验室手册增订版》(増補版ラボマニュアル遺伝子工学)，1990，27-28中记载的使用聚丙烯酰胺凝胶等电泳的方法等。另外，对于如上所述地通过PCR反应得到的DNA(PCR产物)而言，为了得到更多的量，可以在相同的条件下进一步进行PCR反应。

作为上述PCR反应中的两种引物，只要设计成对本发明的目标核酸进行扩增的引物即可，具体而言，只要将正向引物设计为在序列号2所示的碱基序列的上游侧退火的引物、将反向引物设计为在序列号2所示的碱基序列的下游侧退火的引物即可。其核苷酸数通常为20～45，优选为22～40，更优选为25～35。具体而言，作为正向引物，可举出下述序列号6的序列的引物。作为反向引物，可举出由序列号8的一部分或全部构成且由至少包含序列号7所示的碱基序列的连续的碱基序列构成的引物、或者由序列号9所示的碱基序列构成的引物，优选由序列号8的一部分或全部构成且由至少包含序列号7所示的碱基序列的连续的碱基序列构成的引物，更优选由序列号7所示的碱基序列构成的引物。

正向引物

GTAGTTAGTT TTAGTATTTA GTTTTTGG(序列号6)

反向引物

CCCTCTCTA CTTCTCTCTC CTACCTTCTC(序列号7)

CCAAACCCTC TCTACTTCTC TCTCCTACCT TCTC(序列号8)

CCTTAATCAC CCCCATCAAT CCAAAATCC(序列号9)

在本发明的方法的工序2中，优选直接使用上述正向引物或/和反向引物，也可以用标记物质进行标记来作为标记引物。作为该标记物质，只要是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标记物质，均能够使用。具体而言，例如，作为放射性同位素，可举出³²P，³³P，³⁵S等；作为酶，可举出碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶等；作为荧光物质，可举出花青染料系的Cy3、Cy5(安玛西亚生物技术公司(アマシャムバイオサイエンス株式会社))、荧光素等；作为发光物质，可举出包括吖啶酯的化学发光试剂等。

作为通过放射性同位素标记上述引物的方法，可举出在合成引物时掺入用放射性同位素标记的核苷酸来标记引物的方法、在合成引物后用放射性同位素标记的方法等。具体而言，可举出通常使用的随机引物法、切口平移法(nick translation)、使用T4多聚核苷酸激酶的5’-末端标记法、使用末端脱氧核苷酸转移酶等的3’-末端标记法、RNA标记法等。

作为用酶标记上述引物的方法，可举出使碱性磷酸酶(ALP)、辣根过氧化物酶等酶分子与待标记的引物直接共价键合等作为本领域常规方法的直接标记法。

作为用荧光物质标记上述引物的方法，例如，只要通过本领域的常规标记方法将荧光素标记的核苷酸掺入到引物中即可。另外，通过将具有连接臂的核苷酸置换为序列的寡核苷酸的一员的方法(例如，参照《Nucleic Acids Res.》(核酸研究)，1986年，第14卷，p.6115)也能够用荧光物质标记核苷酸。在该情况下，也存在通过日本特开昭60-500717号公报公开的合成法由脱氧尿嘧啶核苷化学合成在5位具有连接臂的尿嘧啶核苷并将荧光物质导入到上述寡核苷酸链的方法。

为了用发光物质或生物素标记上述引物，只要按照本领域常用的对核苷酸进行发光标记或生物素标记的常规方法进行即可。

需要说明的是，在PCR反应中，形成将从正向引物退火的序列到反向引物退火的序列(从正向引物的互补序列到包含序列号2的互补序列的反向引物的互补序列为止的区域)扩增的碱基序列(核酸)。

作为上述PCR反应中的DNA聚合酶，可以是本领域中常用的任意DNA聚合酶，优选具有5’→3’聚合酶活性的DNA聚合酶，其中，更优选具有核酸外切酶活性但不具有3’→5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。具体而言，例如，优选KAPA2G聚合酶、Blend Taq-plus(混合Taq-plus)等突变型或混合型的Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶，其中，特别优选KAPA2G聚合酶。

只要上述PCR反应中的dNTPs是本领域中常用的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)的混合物，就没有特别限定。

下面，说明工序2(本发明的目标核酸的扩增方法)的优选具体例。

即，首先，如上述[亚硫酸氢盐反应]一项所述，对从细胞中提取的核酸进行单链化处理后，进行亚硫酸氢盐反应，得到亚硫酸氢盐反应产物。然后，使用设计成对本发明的目标核酸进行扩增的引物，使得到的亚硫酸氢盐反应产物进行PCR反应。具体而言，在包含通过亚硫酸氢盐反应得到的亚硫酸氢盐反应产物1～100ng的溶液0.5～2μL中，添加1～20μmol/L的作为扩增对象的DNA正向引物(例如，序列号6)0.5～2μL、1～20μmol/L的作为扩增对象的DNA反向引物(例如，序列号7、序列号8或序列号9)0.5～2μL、1～5mmol/L的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的混合溶液1～10μL、以及0.1～5U(单位)的Blend Taq-plus(混合Taq-plus)DNA聚合酶0.1～10μL，例如，在92～98℃、1～5分钟→[93～98℃、10～30秒→50～60℃、10～30秒→68～74℃、30秒～5分钟作为一次循环，进行20～40次循环]→68～74℃、1～10分钟的条件进行反应。由此，非甲基化胞嘧啶被转化为尿嘧啶的本发明的目标核酸被扩增。具体而言，在序列号6的正向引物和序列号7的反向引物的组合的情况下，由序列号3所示的碱基序列构成的核酸被扩增。另外，在序列号6的正向引物和序列号8的反向引物的组合的情况下，由序列号4所示的碱基序列构成的核酸被扩增，在序列号6的正向引物和序列号9的反向引物的组合的情况下，由序列号5所示的碱基序列构成的核酸被扩增。

[工序3]

作为工序3中的电泳，只要是根据依赖于物质的电荷强度以不同的速度移动或者移动不同的距离的方法的电泳即可，具体而言，例如，能够使用等电点电泳法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法等凝胶电泳法等。其中，优选利用分子量越大移动越慢或者移动距离越短的分子筛效果的电泳法，进一步更优选根据分子立体结构的差异能够将分子分离的电泳法。具体而言，优选SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法等凝胶电泳法，更优选SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳法，特别优选丙烯酰胺凝胶电泳法。

需要说明的是，凝胶电泳中的凝胶浓度(w/v)通常为5～15％，优选为5～10％，更优选为7～10％。例如，在使用丙烯酰胺凝胶电泳法的情况下，通常只要使用5～15％(w/v)的丙烯酰胺即可，优选5～10％(w/v)的丙烯酰胺，更优选7～10％(w/v)的丙烯酰胺。对于上述电泳的测定条件、对象物质的检测方法而言，按照自身公知的方法适当设定即可。

在上述电泳后，作为检测本发明的目标核酸的方法，例如可举出使用嵌入剂检测的方法，特别优选该方法。需要说明的是，在使用嵌入剂检测的情况下，可以根据需要进行UV照射来检测。

作为该嵌入剂，具体而言，例如可举出下述(1)～(5)的嵌入剂以及下述(6)和(7)的嵌入剂类似物质。

(1)吖啶橙等吖啶色素。

(2)例如，溴化乙锭、乙锭同型二聚体1(EthD-1)、乙锭同型二聚体2(EthD-2)、叠氮溴化乙锭(EMA)、二氢乙锭等乙锭化合物。

(3)例如，碘化丙啶、碘化己锭(hexidium iodide)等碘化合物，例如7-氨基放线菌素D(7-AAD)、POPO-1、BOBO-1、YOYO-1、TOTO-1，JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、BOBO-3、YOYO-3、TOTO-3等花青二聚体系色素(均为美国分子探针公司(モレキュラープローブ社)商品名)。

(4)例如，PO-PRO-1、BO-PRO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、JO-PRO-1、PO-PRO-3、LO-PRO-1、BO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5等花青单体系色素(均为美国分子探针公司商品名)。

(5)例如，SYBR金、SYBR绿I和SYBR绿II、SYTOX绿、SYTOX蓝、SYTOX橙等SYTOX系色素(均为美国分子探针公司商品名)、例如GelRed(和光纯药工业株式会社商品名)等GelRed系色素。

(6)与DNA双螺旋的小沟结合的嵌入剂〔例如4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI：美国分子探针公司商品名)等〕。

(7)与腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)序列特异性结合的物质〔例如(双苯甲亚胺)五水合物(Hoechst 33258：美国分子探针公司商品名)，三盐酸化物(Hoechst 33342：美国分子探针公司商品名)、双苯甲亚胺色素(Hoechst 34580：美国分子探针公司商品名)等、例如9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)，双-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)精胺(吖啶同型二聚体)等吖啶色素、例如羟芪巴脒等〕。

在上述具体例中，优选(5)SYBR金、SYBR绿I和SYBR绿II、SYTOX绿、SYTOX蓝、SYTOX橙等SYTOX系色素(均为美国分子探针公司商品名)、GelRed(和光纯药工业株式会社商品名)等GelRed系色素，更优选GelRed系色素。

作为检测本发明的目标核酸的方法，在引物为标记引物的情况下，只要根据其标记方法检测即可。具体而言，只要使用前述标记物质标记的引物通过工序2对本发明的目标核酸进行扩增，将得到的扩增产物进行上述电泳后根据标记物质检测即可，例如，如果标记物质为荧光物质，则只要检测其荧光即可。

在使用标记引物的方法中，优选通过工序2对本发明的目标核酸进行扩增后除去游离的标记引物。作为除去游离的标记引物的方法，可举出通过使核酸沉淀的常规方法(乙醇沉淀法、使用异丙醇的沉淀法等)使扩增反应中得到的本发明的目标核酸沉淀后，除去含有未沉淀的游离的标记引物的上清液的方法等。另外，也可举出在适当条件下用凝胶色谱对扩增的本发明的目标核酸进行处理从而将引物伸长产物与游离的标记引物分离的方法、通过电泳法分离的方法等。

对于判定目标细胞(作为工序1中核酸的来源的细胞)是否为癌细胞而言，基于上述电泳结果进行判定。具体而言，将通过本发明的方法对辨别为癌细胞或非癌细胞(在本说明书中，非癌细胞是指包括判明不是癌细胞的全部细胞)的细胞进行电泳而得到的电泳图谱(电泳距离或电泳时间)与使用目标细胞通过本发明的方法进行电泳而得到的电泳图谱(电泳距离或电泳时间)作比较，基于这些电泳图谱相同或者不同来判定其是癌细胞还是非癌细胞。

更具体地说，例如在通过本发明的方法对癌细胞进行电泳而得到的电泳图谱(带型或峰型)与使用目标细胞通过本发明的方法进行电泳而得到的电泳图谱(带型或峰型)相同的情况下，判定该细胞为癌细胞，如果两者的电泳图谱(带型或峰型)不同，则判定为不是癌细胞。

另外，例如在通过本发明的方法对非癌细胞进行电泳而得到的电泳图谱(带型或峰型)与使用目标细胞通过本发明的方法进行电泳而得到的电泳图谱(带型或峰型)相同的情况下，判定为该细胞不是癌细胞，如果两者的电泳图谱(带型或峰型)不同，则判定为癌细胞。

需要说明的是，对于上述电泳图谱的比较而言，既可以将通过电泳得到的全部电泳图像(全部谱带或全部峰)作比较，也可以将能够确认癌细胞与非癌细胞的差异的部分作比较。作为能够确认癌细胞和非癌细胞的差异的部分，可举出癌细胞和非癌细胞出现不同的谱带或峰的部分、癌细胞和非癌细胞中的一个的谱带或峰消失的部分等，具体而言，例如，可举出250bp的扩增产物电泳的距离或时间附近的部分、从220bp的扩增产物电泳的距离或时间附近到250bp的扩增产物电泳的距离或时间附近的部分等。

进一步地，预先对癌细胞和非癌细胞的电泳图谱(带型或峰型)进行比较，根据其结果，确认并设定癌细胞所特有出现或/和消失的、谱带或峰的电泳距离、电泳时间或由此换算的分子量，在通过本发明的方法对目标细胞进行电泳而得到的结果中，可以确认有无与确认并设定的电泳距离、电泳时间或分子量对应的谱带或峰(谱带或峰的出现或/和消失的确认)来判定其为癌细胞或非癌细胞。具体而言，例如，可以确认非癌细胞中未观察到的220bp扩增产物、与该扩增产物的电泳距离或时间对应的谱带或峰在癌细胞中出现、非癌细胞中未观察到的250bp扩增产物、与该扩增产物的电泳距离或时间对应的谱带或峰在癌细胞中消失等来判定其为癌细胞或非癌细胞。

需要说明的是，作为工序1中核酸的来源的细胞并不仅由单一的癌细胞构成，有时其为包括癌细胞和非癌细胞两者的细胞群。在这种情况下，得到的电泳图谱是将通过癌细胞得到的电泳图谱与通过非癌细胞得到的电泳图谱重叠而成的电泳图谱。在该情况下，对电泳图谱(带型或峰型)进行比较，如果确认了癌细胞所特有出现的谱带或峰，则判定为癌细胞。因此，在本发明的方法中，即使在确认了非癌细胞所特有出现的谱带或峰的情况下，只要确认了癌细胞所特有出现的谱带或峰，就判定为癌细胞。

作为工序3的具体方法，如下所述。即，如果有需要，添加电泳用缓冲液，接着将工序2中扩增的本发明的目标核酸与分子量标志物一起进行5～15(W/V)％优选为5～10(W/V)％更优选为7～10(W/V)％的丙烯酰胺凝胶电泳。然后，用GelRed系色素染色后，进行UV照射，检测目标物。另一方面，使正常细胞和癌细胞分别进行本发明的工序1和2，分别对本发明的目标核酸进行扩增。对各核酸进行上述5～15％(W/V)优选为5～10(W/V)％更优选为7～10(W/V)％的丙烯酰胺凝胶电泳，同样地，检测目标物，将其带型与上述本发明的目标核酸的带型作比较，判定目标细胞是否为癌细胞。

需要说明的是，根据上述工序3的结果得到的数据(扩增产物的电泳结果或/和判定是否为癌细胞的结果)能够用作用于判定具有作为工序1中核酸的来源的细胞(或含有该细胞的试样)的动物是否患有癌、或者在该动物中是否存在癌细胞的数据，本发明的方法作为获取用于进行这种判定的数据的方法也是有用的。

[本发明的引物组]

作为本发明的引物组，可举出由序列号6所示的碱基序列构成的正向引物与由序列号8的一部分或全部构成且至少包括序列号7所示的碱基序列的连续的碱基序列构成的反向引物的组合、由序列号6所示的碱基序列构成的正向引物与由序列号9所示的碱基序列构成的反向引物的组合等。优选由序列号6所示的碱基序列构成的正向引物与由序列号8的一部分或全部构成且至少包括序列号7所示的碱基序列的连续的碱基序列构成的反向引物的组合，其中，更优选反向引物为序列号7所示的碱基序列的引物组。

[本发明的细胞的癌判定用试剂]

本发明的细胞的癌判定用试剂包括前述本发明的引物组，具体的引物组及优选的引物组同上。该试剂也可以包括不抑制试剂的稳定性、不抑制PCR反应的本领域中常用的缓冲液、稳定剂、防腐剂等。其浓度和含量根据本领域中常用的范围适当设定。

举出缓冲液的具体例，例如，可举出三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸缓冲液、凡罗那缓冲液、硼酸缓冲液、两性离子缓冲液(Good’s缓冲液)等在实施PCR、杂交反应的情况下通常使用的全部缓冲液，对其pH没有特别的限定，通常优选5～9的范围。

另外，根据需要，也可以包括核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、与酶对应的基质(dNTP、rNTP等)、双链嵌入剂(溴化乙锭、SYBRTM绿等)或者羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)、羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA)等标记检测物质等。

此外，本发明的试剂可以与自身公知的亚硫酸氢盐反应试剂组合来制备试剂盒。作为该亚硫酸氢盐试剂，例如，可举出含有由上述通式[1]～[8]表示的化合物、亚硫酸氢钠、亚硫酸铵等亚硫酸盐、缓冲液、氢氧化钠等的试剂等。只要将该试剂中的浓度适当设定为上述工序1的亚硫酸氢盐反应项中记载的浓度即可。

下面，通过实施例等进一步详细说明本发明，但本发明并不受这些实施例等的任何限定。

实施例

实施例1正常细胞和癌细胞的FOXB2基因(启动子区域)的解析

(1)基因组DNA的提取

使用下述两种细胞，按照试剂盒中所附的说明书，通过QuickGene SP DNA组织提取试剂盒(仓敷纺织公司制)提取基因组DNA。

·人诱导性多能干细胞(hiPS，细胞名称：201B7)：正常细胞。

·人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)：癌细胞。

(2)亚硫酸氢盐反应

在(1)中得到的基因组DNA各400ng中，加入蒸馏水，配制10μL水溶液。接着，使用EpiSight亚硫酸氢盐转化试剂盒(和光纯药工业株式会社制)，按照说明书分别进行亚硫酸氢盐反应。

(3)FOXB2基因的启动子区域的扩增(PCR反应)

在(2)中得到的亚硫酸氢盐反应产物1μL中分别加入蒸馏水17.3μL、10×混合Taq用缓冲液(10×buffer for Blend Taq)(东洋纺公司(東洋紡)制)2.5μL、2mM的dNTPs(东洋纺公司(東洋紡))2μL、混合Taq-Plus(东洋纺公司(東洋紡)制)0.2μL(0.5U)、正向引物(10μM)1μL以及反向引物(10μM)1μL，进行混合，制成反应溶液。这些引物的碱基序列如下所示。通过这些引物扩增的链长为212bp。

正向引物：GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG(序列号6)

反向引物：CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC(序列号7)

将上述反应溶液分别设置在热循环仪(美国伯乐公司(バイオラッド社)制)中，在下述条件下进行反应。

*反应条件

94℃、2分钟；

↓

将94℃、20秒→55℃、20秒→72℃、30秒作为一次循环，循环36次；

↓

72℃、2分钟。

通过上述PCR反应得到的扩增产物为下述序列号3。

gcagccagct ccagcactca gtctttggcc acccggggga agacgcagag aaggcggcgg

taaacctggt gcactccgcc cgcgactgtg cgcgccagtc ggcaaccgtc ggggccagaa

gttgccagct tccgagagct gagtaggccc gaaaggccaa ggtcggagac accaggcaat

tcggagaagg caggagagag aagcagagag gg(序列号3)

然后，在两种得到的PCR扩增产物25μL和25bp DNA阶梯(Step Ladder)(和光纯药工业株式会社制)中，分别加入5μL的6×双色上样缓冲液(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因株式会社(ニッポンジーン)制)，进行混合，采用7.5％的SuperSep Ace(商品名，丙烯酰胺凝胶，和光纯药工业株式会社制)以20mA恒定电流将混合物进行电泳。电泳后用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制)染色，通过UV照射装置确认PCR扩增产物。将从hiPS的正常细胞和人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)的癌细胞得到的PCR扩增产物的电泳结果示于图1。

根据图1的结果可知，对于FOXB2基因的启动子区域而言，通过丙烯酰胺凝胶电泳确认亚硫酸氢盐反应后的PCR扩增产物，从而只要其为甲基化状态(癌细胞)，就会在比非甲基化状态(正常细胞)的谱带更靠低分子侧出现谱带。换言之，可知通过该方法能够判定癌。

实验例1实施例1中使用的基因组DNA的甲基化状态的确认

(1)PCR扩增产物的克隆

分别采用1.5％琼脂糖凝胶将实施例1(3)中得到的两种PCR扩增产物进行电泳。电泳后用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制)染色，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司(キアゲン社)制)按照试剂盒中所附的说明书回收PCR扩增产物。

(2)用于在PCR扩增产物中附加限制性酶识别位点的PCR反应

在(1)中得到的PCR扩增产物1μL中分别加入蒸馏水17.3μL、10×混合Taq用缓冲液(10×buffer for Blend Taq)(东洋纺公司(東洋紡))2.5μL、2mM的dNTPs(东洋纺公司(東洋紡))2μL、混合Taq-Plus(东洋纺公司(東洋紡))0.2μL(0.5U)、正向引物(10μM)1μL以及反向引物(10μM)1μL，进行混合。正向引物使用在序列号6的正向引物中附加了限制性酶识别位点(HindIII：序列中的划线部分)而成的下述序列(序列号10)，反向引物使用在序列号7的反向引物中附加了限制性酶识别位点(BamHI：序列中的划线部分)的下述序列(序列号11)。

正向引物：TTACCATAAGCTT GTAGTTAGTTTTAGTATTTAGTTTTTGG(序列号10)

反向引物：TAATTAAGGATCC CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC(序列号11)

将上述反应溶液分别设置在热循环仪中，在下述条件下进行反应。

*反应条件

94℃、2分钟；

↓

将94℃、20秒→55℃、20秒→72℃、30秒作为一次循环，循环10次；

↓

72℃、2分钟。

然后，在PCR扩增产物25μL中，分别加入6×双色上样缓冲液(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因株式会社制)5μL，进行混合，采用1.5％琼脂糖凝胶将混合物进行电泳。电泳后用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制)染色，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司制)按照试剂盒中所附的说明书回收PCR扩增产物。

(3)限制性酶处理

在(2)中得到的PCR扩增产物43μL中，分别加入10×B缓冲液(日本基因株式会社制)5μL、HindIII(日本基因株式会社制)1μL以及BamHI(日本基因株式会社制)1μL并混合后，在37℃的温度条件下孵育1小时。同样地，在pUC19(日本基因株式会社制)500ng中加入蒸馏水，配制成43μL，进一步地，加入HindIII(日本基因株式会社制)1μL和BamHI(日本基因株式会社制)1μL并混合后，在37℃的温度条件下孵育1小时。然后，加入结合缓冲液(5.5M胍盐酸盐(和光纯药工业株式会社制)、20mM的Tris-盐酸pH6.6(和光纯药工业株式会社制))250μL并混合后，转移至EconoSpin(基因设计株式会社(ジーンデザイン)制)中，在12000×g、室温的条件下离心分离1分钟，除去管中的溶液。然后，添加洗涤缓冲液(包含80％乙醇的2mM的Tris-盐酸pH7.5(日本基因株式会社制))500μL，在12000×g、室温的条件下离心分离1分钟，除去管中的溶液。进一步地，在12000×g、室温的条件下离心分离1分钟后，换成新管，添加洗脱缓冲液(10mM的Tris-HCl pH8.5)(日本基因株式会社制)25μL，在12000×g、室温的条件下离心分离1分钟，除去溶液。由此，回收经限制性酶处理的PCR扩增产物和pUC19。

(4)转化

在经限制性酶处理的PCR扩增产物1μL中，分别加入1μL的经限制性酶处理的pUC19以及DNA连接试剂盒(Mighty Mix)(宝生物工程株式会社(タカラバイオ(株))制)2μL，混合，在16℃的温度条件下孵育1小时。然后，将总量4μL转化入ECOS^TM大肠杆菌DH5α感受态细胞(日本基因株式会社制)，涂抹于添加有氨苄西林的LB琼脂培养基上。然后，在37℃的温度条件下，将菌落在添加有氨苄西林的LB琼脂培养基上培养16小时。进一步地，使用质粒试剂盒SII(仓敷纺织株式会社)按照试剂盒中所附的说明书进行质粒的提取。

通过宝生物工程株式会社的序列分析委托服务，使用所得到的质粒分析碱基序列。

基于碱基序列的解读结果，将表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶是非甲基化胞嘧啶和甲基化胞嘧啶中的哪一种的图示于图2中。需要说明的是，图中的○表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶为非甲基化胞嘧啶，●表示CpG二核苷酸中的胞嘧啶为甲基化的胞嘧啶。

根据图2的结果，确认了hiPS的正常细胞中的胞嘧啶基本为非甲基化胞嘧啶，人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)的癌细胞中的胞嘧啶几乎全被甲基化。因此，根据本发明的方法，示出了通过简单的方法能够辨别细胞中的FOXB2基因的启动子区域中的胞嘧啶的甲基化(甲基化胞嘧啶)或非甲基化(非甲基化胞嘧啶)。即，可知根据本发明的方法能够通过简单的方法辨别细胞是否为癌细胞。

实施例2使用克隆的质粒的FOXB2基因(启动子区域)的解析

分别以实验例1中得到的来自hiPS和U251-MG-P1的FOXB2基因的启动子区域的质粒(PCR扩增的链长为212bp)为模板进行PCR扩增后，通过丙烯酰胺凝胶电泳进行确认。

具体而言，在1μL(50ng)的质粒DNA中分别加入蒸馏水17.3μL、10×混合Taq用缓冲液(10×buffer for Blend Taq)(東洋紡)2.5μL、2mM的dNTPs(东洋纺公司(東洋紡))2μL、混合Taq-Plus(东洋纺公司(東洋紡))0.2μL(0.5U)、正向引物(10μM)1μL以及反向引物(10μM)1μL，进行混合，得到反应溶液。需要说明的是，正向引物和反向引物使用与实施例1(3)记载的引物相同的引物。

将上述反应溶液分别设置在热循环仪中，在下述条件下进行反应。

*反应条件

94℃、2分钟；

↓

将94℃、20秒→55℃、20秒→72℃、30秒作为一次循环，循环10次；

↓

72℃、2分钟。

然后，在PCR扩增产物25μL和25bp DNA阶梯(Step Ladder)(和光纯药工业株式会社制)中，分别加入6×双色上样缓冲液(6×Loading Buffer Double Dye)(日本基因株式会社制)5μL，进行混合，采用7.5％的SuperSep Ace(商品名，丙烯酰胺凝胶，和光纯药工业株式会社制)将混合物进行电泳。电泳后用GelRed核酸凝胶染色液(和光纯药工业株式会社制)染色，通过UV照射装置对PCR扩增产物进行确认。将其结果示于图3。

比较例1正常细胞和癌细胞的FOXB1基因(启动子区域)的解析

除了使用下述序列号12的正向引物和下述序列号13的反向引物作为实施例1(3)的正向引物和反向引物以外，与实施例1同样地使用人诱导性多能干细胞(hiPS)和人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)，对FOXB1基因的启动子区域的PCR扩增产物进行电泳。将其结果与实施例2的FOXB2的结果一同示于图3。

正向引物：GTAGAGGAAATAGAATATTTTAGTTAAG(序列号12)

反向引物：CTTAACCAATAAAAATCACTTCCAACTC(序列号13)

需要说明的是，电泳的扩增产物是扩增的链长为227bp的下述序列号14的FOXB1基因。在基因银行登记号AC009654的碱基号92714-92940中记载有该碱基序列。

GCAGAGGAAA CAGAATACCC CAGCCAAGCA ATTTCCATGT CAAACATCAT CCGCGCGGCT

GCTCCATCTG TGAACGTGAG TGGTCGCCTG GCTCCCTCTT CCGCGGCGGC CGCTTCCTCA

TACCTTCACA CGGCGCACAC CGGCCGGCGC GTCCAGCTGC CTGCCCAGTG GCCGAGGCTC

TTCCCCCTCG CCCAGTCTTG AGCTGGAAGT GATTCCTATT GGCCAAG(序列号14)

根据图3的结果可知，对于FOXB2基因的启动子区域而言，通过对使用亚硫酸氢盐反应后的质粒的PCR扩增产物进行丙烯酰胺凝胶电泳，同样地也能够辨别甲基化胞嘧啶的有无。另一方面，对于FOXB1基因的启动子区域而言，可知有无甲基化胞嘧啶在电泳距离上没有差异，不能辨别。

比较例2各种FOXB2基因的解析

对于与实施例1中扩增的碱基序列不同的下述区域(扩增序列1～3)而言，对FOXB2基因进行扩增，进行电泳。扩增序列1是FOXB2基因的启动子区域的一部分和FOXB2基因的结构基因的一部分的碱基序列，扩增序列2和扩增序列3是作为FOXB2基因的启动子区域的碱基序列3的一部分。

扩增序列1：序列号24

GGAATTAGTG GGGGCAGCCA GGCCCCAGGA ACGGAGTGCG GAGAGATTCT GTGGTCCAGT GCGGGCCGGA GGGCGGTGGA GGAGCCGGGG GCGATGCCGC GGCCGGGGAA GAGCTCGTAC AGCGACCAAA AACCGCCCTA CTCTTACATC TCGCTGACCG CCATGGCAAT CCAGCACTCG GCCGAGAAGA TGCTGCCGCT GAGCGACATC TACAAGTTCA TCATGGAGCG CTTCCCCTAC TACCGCGAGC ACACACAGCG CTGGCAGAAC AGCCTGCGCC ACAACCTCTC CTTCAACGAC TGCTTCATCA AGATTCCGCG GAGGCCCGAC CAGCCTGGCA AGGGTAGCTT CTGGG

扩增序列2：序列号25

GGTAAACCTG GTGCACTCCG CCCGCGACTG TGCGCGCCAG TCGGCAACCG TCGGGGCCAG AAGTTGCCAG CTTCCG

扩增序列3：序列号26

GTTGCCAGCT TCCGAGAGCT GAGTAGGCCC GAAAGGCCAA GGTCGGAGAC ACCAGGCAAT TCGGAGAAGG CAGGAGAGAG AAGCAGAGAG GG

具体而言，除了使用下述正向引物1和反向引物1来代替实施例1(3)的正向引物和反向引物以外，与实施例1同样地进行实验，使用人诱导性多能干细胞(hiPS)和人胶质瘤细胞(U251-MG-P1)对FOXB2基因的PCR扩增产物(扩增序列1)进行电泳。另外，除了在hiPS的情况下使用下述非甲基化正向引物2和非甲基化反向引物2来代替正向引物和反向引物、以及在U251-MG-P1的情况下使用下述甲基化正向引物2和甲基化反向引物2来代替正向引物和反向引物以外，与实施例1同样地进行实验，对FOXB2基因的启动子区域的PCR扩增产物(扩增序列2)进行电泳。进一步地，除了在hiPS的情况下使用下述非甲基化正向引物3和反向引物3来代替正向引物和反向引物、以及在U251-MG-P1的情况下使用下述甲基化正向引物3和反向引物3来代替正向引物和反向引物以外，与实施例1同样地进行实验，对FOXB2基因的启动子区域的PCR扩增产物(扩增序列3)进行电泳。

将扩增序列1的电泳结果示于图4。需要说明的是，作为比较，在图4的左侧与再次进行实施例2的结果一同示出。另外，分别将扩增序列2的电泳结果示于图5，将扩增序列3的电泳结果示于图6。需要说明的是，电泳的扩增产物的扩增的链长依次为355bp(扩增序列1)、76bp(扩增序列2)、92bp(扩增序列3)。

正向引物1：GGAATTAGTGGG GGTAGTTAGGTTTTAGG(序列号15)

反向引物1：CCCAAAAACTACCCTTACCAAACTAATC(序列号16)

非甲基化正向引物2：GGTAAATTTGGTGTATTTTGTTTG(序列号17)

甲基化正向引物2：GGTAAATTTGGTGTATTTCGTTCG(序列号18)

非甲基化反向引物2：CAAAAACTAACAACTTCTAACCCC(序列号19)

甲基化反向引物2：CGAAAACTAACAACTTCTAACCCC(序列号20)

非甲基化正向引物3：GTTGTTAGTTTTTGAGAGTTGAGTAG(序列号21)

甲基化正向引物3：GTTGTTAGTTTTCGAGAGTTGAGTAG(序列号22)

反向引物3：CCCTCTCTACTTCTCTCTCCTACCTTCTC(序列号23)

根据图4～6的结果可知，能够通过本发明的方法采用电泳辨别有无甲基化胞嘧啶的序列仅为FOXB2基因的启动子区域的特定区域。即，可知需要至少具有有着实施例1中已确认的碱基序列3中的CG碱基的序列(即，序列号2)。

实施例3使用来自乳癌患者的细胞的FOXB2基因(启动子区域)的解析

除了使用8名乳癌患者的乳腺细胞作为实施例1(1)中的细胞以外，与实施例1同样地对FOXB2基因的启动子区域的PCR扩增产物进行电泳。将其电泳结果分别示于图7-1、7-2和7-3。需要说明的是，图7-1中的乳癌患者5的细胞为良性肿瘤。

根据图7-1～7-3的结果可知，根据本发明的方法，确认了肿瘤、转移的淋巴结移动至与癌细胞相同的位置，能够判定其为癌细胞(细胞被癌化)。另外，也能够判定肿瘤附近的正常组织为正常细胞，进一步地，可知能够判定良性肿瘤也为正常细胞。

实施例4使用来自大肠癌患者的细胞的FOXB2基因(启动子区域)的甲基化解析

除了使用8名大肠癌患者的大肠细胞作为实施例1(1)中的细胞以外，与实施例1同样地对FOXB2基因的启动子区域的PCR扩增产物进行电泳。

将其电泳结果分别示于图8-1和8-2。

根据图8-1～8-2的结果可知，根据本发明的方法，使用来自大肠癌的细胞也确认了肿瘤移动至与癌细胞相同的位置，能够判定其为癌细胞。

如下示出以上实施例和比较例中使用的序列的位置关系。

序列表

<110> 和光纯药株式会社（WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.）

<120> 使用FOXB2基因的癌细胞的判定方法

<130> 2006

<150> 2016-028394

<151> 2016-02-17

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 500

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 1

ggtctggcta agtgcctggc caggggcctg cgtccagggc actggaagtc ctgctgtcac 60

tggcctccag gacagcaggc gcaaactcag atttaaaggg ccagagtctc tactgcccag 120

accttcctcc cagccatctt ggtctgggtt tccctcggac ctagaaaaag caaagaggcc 180

gggaggaaac acggcccctt gccactctcc tctgcagcca gctccagcac tcagtctttg 240

gccacccggg ggaagacgca gagaaggcgg cggtaaacct ggtgcactcc gcccgcgact 300

gtgcgcgcca gtcggcaacc gtcggggcca gaagttgcca gcttccgaga gctgagtagg 360

cccgaaaggc caaggtcgga gacaccaggc aattcggaga aggcaggaga gagaagcaga 420

gagggcctgg agggcgagag ggcaaagtgg cgggactgga ggggccgagt gggaattagt 480

gggggcagcc aggccccagg 500

<210> 2

<211> 150

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 2

cgggggaaga cgcagagaag gcggcggtaa acctggtgca ctccgcccgc gactgtgcgc 60

gccagtcggc aaccgtcggg gccagaagtt gccagcttcc gagagctgag taggcccgaa 120

aggccaaggt cggagacacc aggcaattcg 150

<210> 3

<211> 212

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 3

gcagccagct ccagcactca gtctttggcc acccggggga agacgcagag aaggcggcgg 60

taaacctggt gcactccgcc cgcgactgtg cgcgccagtc ggcaaccgtc ggggccagaa 120

gttgccagct tccgagagct gagtaggccc gaaaggccaa ggtcggagac accaggcaat 180

tcggagaagg caggagagag aagcagagag gg 212

<210> 4

<211> 217

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 4

gcagccagct ccagcactca gtctttggcc acccggggga agacgcagag aaggcggcgg 60

taaacctggt gcactccgcc cgcgactgtg cgcgccagtc ggcaaccgtc ggggccagaa 120

gttgccagct tccgagagct gagtaggccc gaaaggccaa ggtcggagac accaggcaat 180

tcggagaagg caggagagag aagcagagag ggcctgg 217

<210> 5

<211> 287

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 5

gcagccagct ccagcactca gtctttggcc acccggggga agacgcagag aaggcggcgg 60

taaacctggt gcactccgcc cgcgactgtg cgcgccagtc ggcaaccgtc ggggccagaa 120

gttgccagct tccgagagct gagtaggccc gaaaggccaa ggtcggagac accaggcaat 180

tcggagaagg caggagagag aagcagagag ggcctggagg gcgagagggc aaagtggcgg 240

gactggaggg gccgagtggg aattagtggg ggcagccagg ccccagg 287

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 6

gtagttagtt ttagtattta gtttttgg 28

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 7

ccctctctac ttctctctcc taccttctc 29

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 8

ccaaaccctc tctacttctc tctcctacct tctc 34

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 9

ccttaatcac ccccatcaat ccaaaatcc 29

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 10

ttaccataag cttgtagtta gttttagtat ttagtttttg g 41

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 11

taattaagga tccccctctc tacttctctc tcctaccttc tc 42

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 12

gtagaggaaa tagaatattt tagttaag 28

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 13

cttaaccaat aaaaatcact tccaactc 28

<210> 14

<211> 227

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB1)

<400> 14

gcagaggaaa cagaataccc cagccaagca atttccatgt caaacatcat ccgcgcggct 60

gctccatctg tgaacgtgag tggtcgcctg gctccctctt ccgcggcggc cgcttcctca 120

taccttcaca cggcgcacac cggccggcgc gtccagctgc ctgcccagtg gccgaggctc 180

ttccccctcg cccagtcttg agctggaagt gattcctatt ggccaag 227

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 15

ggaattagtg ggggtagtta ggttttagg 29

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 16

cccaaaaact acccttacca aactaatc 28

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 17

ggtaaatttg gtgtattttg tttg 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 18

ggtaaatttg gtgtatttcg ttcg 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 19

caaaaactaa caacttctaa cccc 24

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 20

cgaaaactaa caacttctaa cccc 24

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 21

gttgttagtt tttgagagtt gagtag 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 22

gttgttagtt ttcgagagtt gagtag 26

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial)

<220>

<223> 引物

<400> 23

ccctctctac ttctctctcc taccttctc 29

<210> 24

<211> 355

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 24

ggaattagtg ggggcagcca ggccccagga acggagtgcg gagagattct gtggtccagt 60

gcgggccgga gggcggtgga ggagccgggg gcgatgccgc ggccggggaa gagctcgtac 120

agcgaccaaa aaccgcccta ctcttacatc tcgctgaccg ccatggcaat ccagcactcg 180

gccgagaaga tgctgccgct gagcgacatc tacaagttca tcatggagcg cttcccctac 240

taccgcgagc acacacagcg ctggcagaac agcctgcgcc acaacctctc cttcaacgac 300

tgcttcatca agattccgcg gaggcccgac cagcctggca agggtagctt ctggg 355

<210> 25

<211> 76

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 25

ggtaaacctg gtgcactccg cccgcgactg tgcgcgccag tcggcaaccg tcggggccag 60

aagttgccag cttccg 76

<210> 26

<211> 92

<212> DNA

<213> 人FOXB2(Human FOXB2)

<400> 26

gttgccagct tccgagagct gagtaggccc gaaaggccaa ggtcggagac accaggcaat 60

tcggagaagg caggagagag aagcagagag gg 92