DSG2-衍生肽的制作方法

本发明提供用于抑制血管生成拟态及血管生成相关疾病的肽。特定而言，本发明提供dsg2衍生肽及其在抑制、预防或治疗血管生成拟态及血管生成依赖性或血管生成相关疾病方面的应用。
背景技术：
：桥粒是上皮组织、心肌组织及其他组织之间细胞间黏着连接的主要类型之一。这些桥粒含有称为桥粒钙黏蛋白的跨膜醣蛋白，即桥粒胶蛋白(dsc)及桥粒核心醣蛋白(dsg)。每一者以至少三种不同的遗传同种型出现，其显示组织特异性表达模式。dsg2在所有形成桥粒的组织中遍在表达。dsg2的细胞外结构域含有4个钙黏蛋白重复结构域(ec1-4)，各自长度为约110个氨基酸。细胞外重复结构域ec1含有细胞黏着识别(car)位点，其提供细胞间黏着。因此，已鉴别dsg2为跨膜细胞黏着分子。另外，最近研究显示，dsg2并非仅为简单的细胞间黏着分子。dsg2参与血管生成的促进、细胞凋亡的信号传导且是mmp的受质。dsg2在调节emt方面起重要作用。其已显示：(1)使用肝细胞生长因子/分散因子(hgf/sf)触发emt显示除dsg2以外的大多桥粒黏着组分下调。(2)经dsg2转染的上皮细胞展现类间质形态且在hgf/sf处理下显示更强迁移及入侵能力。(3)针对dsg2的ec2结构域的抗体在活体外显著阻断hgf/sf诱导的emt。此外，本发明者已确定，针对dsg2的ec2结构域的抗体抑制癌细胞的入侵，这些癌细胞包括mcf7人类乳癌细胞、lncap人类前列腺癌细胞及km12人类结肠癌细胞。尽管不希望受任一特定理论束缚，但本发明者提出dsg2可在细胞中用于促进emt。us20040229811教示通过在哺乳动物中抑制表达dsc的细胞及/或表达dsg的细胞的黏着来治疗癌症。wo99/57149表明，可使用源自dsg2的ec2结构域的细胞黏着识别(car)位点作为治疗癌症及/或抑制转移的调节剂。us20120276082揭示dsg2的拮抗剂，其中所述拮抗剂调节dsg2的ec2结构域的功能。已暗示，dsg2参与诸如癌症的人类疾病，所述dsg2在若干上皮源恶性肿瘤(包括基底细胞癌(bcc)、鳞状细胞癌(scc)、胃癌、黑色素瘤、转移性前列腺癌及膀胱癌)中高度表达。技术实现要素：本发明是基于dsg2衍生肽的开发，所述dsg2衍生肽用于抑制emt及/或血管生成拟态及治疗及/或预防血管生成相关疾病。本发明的肽可衍生自dsg2的位置500至604(iepvqtichdaeyvnvtaedldghpnsgpfsfsvidkppgmaekwkiarqestsvllqqsekklgrseiqflisdnqgfscpekqvltltvceclhgsgcreaqh(seqidno:136))的氨基酸残基且其可经进一步修饰。本发明提供包含下式(i)的氨基酸序列的合成肽：mx1ex2wx3ix4r(seqidno:1)其中x1是a、t或s；x2是k、r或h；x3是k、r、n、h或q；且x4是a、v、i、g、l或p；或其变体肽或其修饰肽。在一些实施例中，在式(i)中，x1是a或t；x2是k或r；x3是k、r或n且x4是a、v或i。在一些其他实施例中，本发明的肽包含seqidno:2至37的任一者的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的变体肽具有与seqidno:1的序列至少70％、80％、90％、95％、98％、99％的氨基酸序列一致性。在一些实施例中，本发明的变体肽具有一或多个取代、缺失或插入。在另一实施例中，本发明的变体肽具有保守变化。在一些实施例中，本发明的变体肽包含选自由seqidno:45至63组成的群的氨基酸序列。在一些实施例中，本发明的修饰肽可包括(但不限于)一或多个连接至本发明的肽的n-末端、c-末端或n-末端及c-末端二者的非天然或修饰氨基酸、环肽及合成聚氨基酸聚合物(例如，聚离胺酸(polyk)、聚l-天冬胺酸(polyd)、聚-l-精胺酸(polyr)、聚l-麸胺酸(polye))。在一些实施例中，本发明的修饰肽包含选自由以下各项组成的群的氨基酸序列：seqidno:64至67及seqidno:68至125。本发明亦提供包含选自由seqidno:126至134组成的群的氨基酸序列的合成肽或其变体肽或其修饰肽。在一个实施例中，修饰肽是seq6的反向序列，其包含seq132的氨基酸序列：vstseqraikwkeam(seqidno:135)。本发明亦提供包含本发明的肽或其变体肽或其修饰肽的医药组合物。本发明亦提供在个体中抑制emt及/或血管生成拟态且治疗及/或预防血管生成依赖性或血管生成相关疾病的方法，其包含将本发明的肽或其肽变体或修饰肽投与个体。另外，本发明提供本发明的肽或其肽变体或修饰肽的用途，其用于制造在个体中抑制emt及/或血管生成拟态且治疗及/或预防血管生成依赖性或血管生成相关疾病的药剂。图式简单说明图1(a)及(b)显示本发明的肽的emt分析。(a)，来自dsg2细胞外结构域aa500-604(seq1)的seq2-seq11的基于序列的设计的示意图。(b)，hgf(肝细胞生长因子)诱导的emt(上皮-间质转变)受合成肽seq5、seq6、seq8及seq10抑制。图2(a)及(b)显示emt分析中seq6的肽缺失研究。(a)，seq6缺失合成肽seq12-seq31的示意图。肽seq12-seq31的序列。(b)，hgf(肝细胞生长因子)诱导的emt(上皮-间质转变)受合成肽seq12-seq31抑制。此外，seq15及seq17显示与seq6相似的优良抑制能力。图3(a)及(b)显示使用u87细胞的血管生成拟态研究，其测定seq17色胺酸残基(w，dsg2氨基酸位置544)对阻断u87细胞的管形成的功能的贡献。seq32-seq38能够阻断血管生成拟态。(a)，神经胶母细胞瘤(gbm)极具侵袭性且基本上无法治愈。其恶性的特征在于旺盛的微血管增殖。最近证据已显示，肿瘤细胞展示驱动血液灌注的血管生成拟态(vm)(一种独立于内皮细胞血管生成的替代微血管循环)的能力。在血管生成拟态研究中，使用神经胶母细胞瘤细胞系(u-87)测定seq17色胺酸残基(w，dsg2氨基酸位置544)藉助阻断基质胶触发的管结构作出的贡献。与充满管的pbs对照相比，seq17及seq32-seq38的肽显示阻断u-87管网络化的强效能。(b)，使用每一治疗组中的3个随机选择视野通过计数管来定量。(平均管数目±sd)图4(a)至(c)显示本发明的肽的huvec管形成分析。(a)，培养于基质胶上的huvec细胞证明，合成肽seq17、seq78及seq97抑制血管生成。(b)，将mr9及衍生自mr9的三种肽(mr9；mr9df：非天然氨基酸肽，9个氨基酸残基是d形式；cmr9c：环肽，通过n及c末端胱胺酸环化；及cmr9cdf：具有非天然氨基酸的环肽)处理至huvec细胞的基质胶诱导的血管系统。这些肽可显示分解40％-80％管结构的潜在能力。(c)，seq132肽(seq6的反向序列)在huvec管形成分析中显示抑制huvec管结构的强效能。(d)，将mr9d6及衍生自mr9d6的两种肽(mr9d6；mr9d6df：非天然氨基酸肽，15个氨基酸残基是d形式；及cmr9d6cdf：环肽，通过n及c末端胱胺酸环化且所有氨基酸是非天然d-形式)处理至huvec细胞的基质胶诱导的血管系统。与pbs处理的对照相比，这些pbs溶解的肽可显示使95体积％的管结构崩溃的极其有效的能力。图5(a)及(b)显示动物模型研究(大鼠脉络膜新血管形成模型)。(a)，pbs治疗的对照、eylea(200μg/5μl)及seq97(500μg/5μl)的萤光黄血管造影照片。(b)，eylea及seq97显著抑制大鼠眼脉络膜新血管形成。具体实施方式在以下说明中，使用多个术语且提供以下定义以促进理解所主张的标的物。在本文中未明确定义的术语是根据其通常的普通含义使用。除非另外规定，否则一(a或an)意指“一或多”。在本申请案通篇中，术语“约”是用于指示值包括固有误差差异。如本文中所使用，片语“合成肽”出于本发明标的物的目的是指通过氨基酸的已知化学反应或通过如上文所述生物材料的分离及纯化所制备的肽。如本文中所使用，术语“天然的”是指物体可在自然界中发现的事实。举例而言，存在于可自自然界中的来源分离的来源中的蛋白质。如本文中所使用，术语“投与”(administer、administering或toadminister)是指药剂的给予或供给，包括活体内投与以及直接离体投与组织。术语“氨基酸残基”或“氨基酸”或“残基”可互换使用，是指纳入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸，包括(但不限于)天然氨基酸及可以与天然氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸的已知类似物。本文中用于氨基酸的缩写是习用的彼等缩写：a＝ala＝丙胺酸；r＝arg＝精胺酸；n＝asn＝天冬酰胺；d＝asp＝天冬胺酸；c＝cys＝半胱胺酸；q＝gln＝麸酰胺酸；e＝glu＝麸胺酸；g＝gly＝甘胺酸；h＝his＝组胺酸；i＝ile＝异白胺酸；l＝leu＝白胺酸；k＝lys＝离胺酸；m＝met＝甲硫胺酸；f＝phe＝苯丙胺酸；p＝pro＝脯胺酸；s＝ser＝丝胺酸；t＝thr＝苏胺酸；w＝trp＝色胺酸；y＝tyr＝酪胺酸；v＝val＝缬胺酸。氨基酸可为l-氨基酸或d-氨基酸。氨基酸可由合成氨基酸替代，所述合成氨基酸经改变以增加肽的半衰期或提高肽的功效，或提高肽的生物利用度。为彼此的保守取代的氨基酸的组如下。丙胺酸(a)、丝胺酸(s)、苏胺酸(t)；天冬胺酸(d)、麸胺酸(e)；天冬酰胺(n)、麸酰胺酸(q)；精胺酸(r)、离胺酸(k)；异白胺酸(i)、白胺酸(l)、甲硫胺酸(m)、缬胺酸(v)；及苯丙胺酸(f)、酪胺酸(y)、色胺酸(w)。如本文中所使用，术语“肽”是指两个或更多个氨基酸以化学方式连接在一起的分子。肽可指多肽、蛋白质或肽模拟物。本发明的肽可包含d-氨基酸、d-氨基酸与l-氨基酸的组合及多种“设计者”氨基酸(例如，β-甲基氨基酸、c-α-甲基氨基酸及n-α-甲基氨基酸等)以赋予特殊性质。合成氨基酸包括针对离胺酸的鸟胺酸及针对白胺酸或异白胺酸的正白胺酸。另外，肽可具有肽模拟键(例如，酯键)以制备具有新颖性质的肽。如本文中所用，术语“环肽模拟物”或“环状多肽模拟物”是指肽模拟物，其具有一或多种环状特征(例如，环、桥连部分及/或内部连接)作为其结构的部分。如本文中所使用，术语“医药上可接受的”是指适于投与人类及/或动物而无过度不良副作用(例如，毒性、刺激及/或过敏反应)且与合理效益/风险比相称的化合物及组合物。如本文中所使用，术语“个体”及“患者”可互换使用且将理解为是指温血动物、尤其哺乳动物。在此术语的范畴及意义内的动物的非限制性实例包括天竺鼠、狗、猫、大鼠、小鼠、马、山羊、牛、绵羊、动物园动物、非人类灵长类动物及人类。如本文中所使用，术语“有效量”是指当以发明性概念的方式使用时，肽化合物足以展现可检测治疗效应而无过量不良副作用(例如，毒性、刺激及过敏反应)且与合理效益/风险比相称的量。如本文中所使用，术语“治疗有效量”是指标的dsg2肽在投与哺乳动物或另一个体用于治疗疾病时，足以实现此疾病的所述治疗的量。如本文中所使用，术语“治疗(treatment、treating及诸如此类)”涵盖哺乳动物(尤其人类)的疾病的任何治疗，且包括：(a)在可易患所述疾病但尚未诊断为患有所述疾病的个体中预防疾病发生；(b)抑制疾病，亦即阻止其发展；及(c)缓解疾病，亦即引起疾病消退。在一态样中，本发明提供包含下式(i)的氨基酸序列的合成肽：mx1ex2wx3ix4r(seqidno:1)其中x1是a、t或s；x2是k、r或h；x3是k、r、n、h或q；且x4是a、v、i、g、l或p；或其变体肽或其修饰肽。在一些实施例中，在式(i)中，x1是a或t；x2是k或r；x3是k、r或n且x4是a、v或i。在一些其他实施例中，本发明的肽包含选自由以下各项组成的群的氨基酸序列：在一些实施例中，变体肽的任一氨基酸残基可自这些肽的相应残基改变，同时仍编码维持对emt、血管生成拟态或血管生成相关疾病的抑制活性的肽。在一个实施例中，肽的变体具有与seqidno:1的序列至少70％、80％、90％、95％、98％、99％的氨基酸序列一致性。“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为当比对两个序列时，与参考(亲本)多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸一致性％，比对序列，且若需要，引入空位以达成最大序列一致性％。测定一致性百分比的氨基酸序列比对程序为熟习此项技术者所熟知。通常使用可公开获得的电脑软体(例如，blast、blast2、align2或megalign(dnastar)软体)来比对肽序列。熟习此项技术者可确定用于量测比对的适当参数，包括在所比较序列的全长范围内达成最大比对所需要的任何演算法。在一些实施例中，本发明的肽变体包括其中序列中特定位置的残基已由其他氨基酸取代的变体，且进一步包括在亲本肽/多肽的两个残基之间插入额外一或多个残基的可能性以及自亲本序列缺失一或多个残基或将一或多个残基添加至亲本序列的可能性。本发明涵盖任一氨基酸取代、插入或缺失。在某些情况下，取代为如本文中所述的保守取代。保守变化通常导致所得蛋白质的结构及功能的较小变化。举例而言，本发明的肽包含一或多种以下保守氨基酸取代：将脂肪族氨基酸(例如，丙胺酸、缬胺酸、白胺酸及异白胺酸)用另一脂肪族氨基酸替代；用苏胺酸替代丝胺酸；用丝胺酸替代苏胺酸；将酸性残基(例如，天冬胺酸及麸胺酸)用另一酸性残基替代；将具有酰胺基的残基(例如，天冬酰胺及麸酰胺酸)用另一具有酰胺基的残基替代；将碱性残基(例如，离胺酸及精胺酸)与另一碱性残基交换；及将芳香族残基(例如，苯丙胺酸及酪胺酸)用另一芳香族残基替代。在一些其他实施例中，本发明的肽变体(氨基酸取代)包含选自由以下各项组成的群的氨基酸序列：seq32aaekwkiar(seqidno:38)seq33maakwkiar(seqidno:39)seq34maeawkiar(seqidno:40)seq35maekakiar(seqidno:41)seq36maekwaiar(seqidno:42)seq37maekwkaar(seqidno:43)seq38maekwkiaa(seqidno:44)在一些其他实施例中，本发明的肽变体(氨基酸缺失)包含选自由以下各项组成的群的氨基酸序列：在一些实施例中，本发明的修饰肽可包含一或多种非天然氨基酸用于修饰。“非天然氨基酸残基”是指除彼等天然氨基酸残基以外的残基，其能够以共价方式结合多肽链中的毗邻氨基酸残基。非天然氨基酸包括(但不限于)高-离胺酸、高-精胺酸、高-丝胺酸、铃兰胺酸、2-胺基己二酸、3-胺基己二酸、β-丙胺酸、胺基丙酸、2-胺基丁酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、2-胺基庚酸、2-胺基异丁酸、3-胺基异丁酸、2-胺基庚二酸、第三丁基甘胺酸、2,4-二胺基异丁酸、锁链素、2.2'-二胺基庚二酸、2,3-二胺基丙酸、n-乙基甘胺酸、n-乙基天冬酰胺、高脯胺酸、羟基离胺酸、别-羟基离胺酸、3-羟基脯胺酸、4-羟基脯胺酸、异锁链素、别-异白胺酸、n-甲基丙胺酸、n-甲基甘胺酸、n-甲基异白胺酸、n-甲基戊基甘胺酸、n-甲基缬胺酸、萘丙胺酸、正缬胺酸、正白胺酸、鸟胺酸、瓜胺酸、戊基甘胺酸、六氢烟碱酸及硫代脯胺酸。修饰氨基酸包括天然及非天然氨基酸，其可逆地或不可逆地经化学封阻或在其n-末端胺基或其侧链基团上经修饰，如(例如)n-甲基化的d氨基酸及l氨基酸、经化学修饰成另一官能基的侧链官能基。举例而言，修饰氨基酸包括甲硫胺酸亚砜；甲硫胺酸砜；天冬胺酸-(β-甲基酯)(天冬胺酸的修饰氨基酸)；n-乙基甘胺酸(甘胺酸的修饰氨基酸)；或丙胺酸甲酰胺及丙胺酸的修饰氨基酸。在一些实施例中，本发明的修饰肽包含选自由以下各项组成的群的氨基酸序列：mr9df:maekwkiar(seqidno:64)；cmr9cdf:cmaekwkiarc(seqidno:65)；mr9d6df:maekwkiardddddd(seqidno:66)；及cmr9d6cdf:cmaekwkiarddddddc(seqidno:67)。在一个实施例中，修饰肽呈环状形式。一种修饰是基于氨基酸的交联以产生环状结构。蛋白质中的环状区域含有刚性域，其降低构象挠性及旋转自由度，从而产生结合至靶蛋白质的极高亲和性。多种环化多肽的方法可为熟习此项技术者所用且以引用方式并入本文中。通常，利用多肽的特定氨基酸侧链及/或羧基或胺基末端的化学反应性使多肽的两个位点交联以产生环状分子。在一种方法中，使两个半胱胺酸残基的硫醇基通过与二溴二甲苯的反应交联。在一些实施例中，呈环状形式的本发明的修饰肽包含选自由以下各项组成的群的氨基酸序列：cmr9cdf:cmaekwkiarc(seqidno:65)；及cmr9d6cdf:cmaekwkiarddddddc(seqidno:67)。在另一实例性方法中，侧链胺基及末端胺基与二琥珀酰亚胺戊二酸酯交联。在其他方式中，环化是通过在多肽上的两个位点之间形成硫醚桥连基团来实现。一种化学方法依赖于在多肽的n-末端纳入n-氯乙酰基修饰的氨基酸，随后与内部半胱胺酸残基的硫醇侧链自发反应。酶法依赖于(1)半胱胺酸与(2)脱氢丙胺酸或脱氢丁胺酸基团之间的反应，所述反应由羊毛硫抗生素(lantibiotic)合成酶催化，以产生硫醚桥连基团。脱氢官能基亦可通过氧化在转译期间纳入的含硒氨基酸侧链以化学方式生成。在一个实施例中，本发明的修饰肽包含连接至本发明的肽的n-末端、c-末端或n-末端及c-末端二者的合成聚氨基酸聚合物(例如，聚离胺酸(polyk)、聚l-天冬胺酸(polyd)、聚-l-精胺酸(polyr)、聚l-麸胺酸(polye)或聚麸酰胺酸(polyq))。在一些实施例中，对seq17的修饰是通过添加聚-精胺酸(r)或聚-天冬胺酸(d)以获得多种合成肽seq74至seq131来进行。在另一实施例中，合成聚氨基酸包含1至12个聚氨基酸，优选3至8个聚氨基酸。在一些实施例中，合成聚氨基酸包含1至12个k残基、1至12个d残基、1至12个r残基、1至12个q残基或1至12个e残基或其组合。在一些实施例中，合成聚氨基酸包含3至7个r残基或3至7个d残基或其组合。在一些实施例中，修饰肽是具有选自由以下各项组成的群的合成聚氨基酸聚合物的本发明的肽：在另一态样中，本发明提供包含选自由以下各项组成的群的氨基酸序列的合成肽：或其变体肽或其修饰肽。在一个实施例中，修饰肽是seq6的反向序列，其包含seq132的氨基酸序列：vstseqraikwkeam(seqidno:136)。seq2至seq11的变体肽包括具有如本文中所述的氨基酸序列一致性及如本文中所述的氨基酸取代、添加或缺失的肽。修饰肽包括具有非天然氨基酸修饰、环状修饰及合成聚氨基酸聚合物修饰的肽。本发明的肽可衍生自来自dsg2的位置500至604(iepvqtichdaeyvnvtaedldghpnsgpfsfsvidkppgmaekwkiarqestsvllqqsekklgrseiqflisdnqgfscpekqvltltvceclhgsgcreaqh(seqidno:137))的氨基酸残基且其可经进一步修饰。本文所阐述的肽亦可通过化学合成或使用重组dna技术制造来制备。举例而言，肽可通过如业内已知的使用迭氮化物、酰氯、酸酐、化合物酸酐、dcc、活化酯、伍德沃德氏试剂k(woodward'sreagentk)、羰基咪唑、脱氧、dcc/honb、bop试剂等的方法获得。另外，其可使用自动化肽合成器通过化学合成制备。在此一化学反应后，肽可分离并通过已知纯化方法纯化。这些纯化方法的实例可包括溶剂萃取、蒸馏、管柱层析、液相层析、再结晶及诸如此类的组合。此外，可使用宿主细胞(例如，大肠杆菌(e.coli))中的重组表达系统将本文所阐述的肽表达为具有特定酶裂解位点的融合蛋白(例如，肠激酶)。接下来，将细胞打碎并离心且所得浆液含有肽。然后可将肽加载于特定亲和管柱(例如，ni2+或麸胱甘肽管柱)上以经溶析。溶析后，使所纯化的肽经受特定酶裂解反应。然后，通过hplc或离子交换层析将肽自所得混合物纯化。涉及习用及分析化学、分子生物学及细胞生物学技术的方法在许多公开已知的参考文献中详细阐述。在另一态样中，本发明提供包含本发明的肽或其变体肽或其修饰肽的医药组合物。本发明提供能够抑制emt及/或血管生成拟态且治疗及/或预防血管生成依赖性或血管生成相关疾病的医药组合物，其包含本发明的肽或其变体肽或其修饰肽及至少一种医药上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。优选将本发明的肽与其他组分(例如，载剂)组合于组合物(例如，医药组合物)中。这些组合物当在医学治疗或预防血管生成相关疾病的方法中投与时有用。医药上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用的剂量及浓度下对接受者无毒。其可为固体、半固体或液体。本发明的医药组合物可呈以下形式：锭剂、丸剂、粉末、菱形锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液或糖浆。在一些实施例中，本发明提供在个体中抑制emt及/或血管生成拟态且治疗及/或预防血管生成依赖性或血管生成相关疾病的方法，其包含将本发明的肽或其肽变体或修饰肽投与个体。因此，本发明提供本发明的肽或其肽变体或修饰肽的用途，其用于制造在个体中抑制emt及/或血管生成拟态且治疗及/或预防血管生成依赖性或血管生成相关疾病的药剂。在本说明书通篇中使用血管生成来阐述生物过程，其导致血管的发展或生物体中组织的血管供应增加。持久、未经调节的血管生成存在于众多疾病状态、肿瘤转移及内皮细胞的异常生长中且支持在这些病状中所见的病理损伤。已将因未经调节的血管生成所产生的不同的病理状态一起分为血管生成依赖性或血管生成相关疾病。旨在控制血管生成过程的疗法可导致这些疾病的消除或减轻。通过本发明治疗、改善或预防的疾病或病症包括以下各项：黄斑退化、年龄相关性黄斑退化、赘瘤形成、内部恶性肿瘤(例如，眼癌或眼部癌、直肠癌、结肠癌、子宫颈癌、前列腺癌、乳癌及膀胱癌)；良性及恶性肿瘤，包括多种癌症，例如肛门癌及口腔癌、胃癌、直肠癌、肝癌、胰脏癌、肺癌、子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肾癌、口/咽癌、食道癌、喉癌、肾脏癌、脑/中枢神经系统癌(brain/ens)(例如，神经胶质瘤)、头颈癌、喉癌、皮肤黑色素瘤、急性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、尤恩氏肉瘤(ewing'ssarcoma)、卡波西氏肉瘤(kaposi'ssarcoma)、基底细胞癌及鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、威尔姆氏瘤(wilmstumor)、神经胚细胞瘤、淋巴瘤、神经纤维瘤、结节性硬化症(这些病状各自产生良性皮肤肿瘤)、血管瘤、淋巴管生成、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼、化脓性肉芽肿、血源性肿瘤(例如，白血病、多种急性或慢性骨髓肿瘤性疾病的任一者(其中发生白血球的无限增殖，通常伴随贫血、凝血受损以及淋巴结、肝及脾的增大))；牛皮癣、痤疮、酒渣、疣、湿疹、神经纤维瘤、史德格-韦伯症候群(sturge-webersyndrome)、皮肤的静脉性溃疡、结节性硬化症、慢性发炎性疾病、关节炎、狼疮、硬皮症、糖尿病视网膜病变、早产的视网膜病变、角膜移植物排斥、新血管青光眼及晶状体后纤维组织增生、流行性角膜结膜炎、维生素a缺乏、接触镜超戴症、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉、干燥性角膜炎、休格伦氏症候群(sjogren's)、泡性角结膜炎(phylectenulosis)、梅毒、分枝杆菌感染(mycobacteriainfections)、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、莫伦氏溃疡(mooren'sulcers)、特芮安氏角膜边缘变性(terrien'smarginaldegeneration)、边缘性角质层分离、创伤、类风湿性关节炎、全身性狼疮、多动脉炎、韦格纳类肉瘤病(wegener'ssarcoidosis)、巩膜炎、斯-琼森二氏病(stevens-johnsondisease)、类天疱疮、放射状角膜切开术、角膜移植物排斥、糖尿病视网膜病变、黄斑水肿、黄斑退化、镰状细胞贫血症、肉状瘤、弹性假黄瘤、佩吉特氏病(pagefsdisease)、静脉阻塞、动脉阻塞、颈动脉阻塞疾病、慢性眼色素层炎/玻璃体炎、莱姆病(lymedisease)、全身性红斑狼疮、bale氏病、贝歇氏病(behcet'sdisease)、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、假定眼部组织胞浆菌病、贝斯特氏病(best'sdisease)、近视、视窝、斯塔加特病(stargardt'sdisease)、睫状体平坦部炎、慢性视网膜脱离、黏性过大症候群、弓虫症、创伤、雷射后并发症、皮肤发红(踝的新血管形成)、由纤维血管或纤维组织的异常增殖所引起的疾病(包括所有形式的增殖性玻璃体视网膜病变，无论是否与糖尿病相关)、新血管疾病、血管翳、糖尿病黄斑水肿、血管视网膜病变、视网膜变性、视网膜的发炎性疾病、增殖性玻璃体视网膜病变、与皮肤发红相关的疾病(踝的新血管形成)、由纤维血管或纤维组织的异常增殖所引起的疾病(包括所有形式的增殖性玻璃体视网膜病变)、克隆氏病(crohn'sdisease)及溃疡性结肠炎、类肉瘤病、骨关节炎、发炎性肠病、皮肤病灶、osler-weber-rendu三氏病或遗传性出血性血管扩张、骨关节炎、类肉瘤病、皮肤病灶、后天免疫缺失症候群及小肠阻塞。在一些实施例中，血管生成依赖性或血管生成相关疾病是赘瘤形成(包括恶性肿瘤或癌症)、黄斑退化(包括年龄相关性黄斑退化)、新血管疾病、血管视网膜病变或视网膜变性。本发明的血管生成抑制肽用于治疗、改善或预防良性及恶性肿瘤，其包括多种癌症，尤其例如子宫颈癌、肛门癌、口腔癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、直肠癌、肝癌、胰脏癌、肺癌、乳癌、子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、肾癌、脑癌(例如，神经胶质瘤)、头颈癌、眼癌或眼部癌、喉癌、黑色素瘤、急性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、尤恩氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、基底细胞癌及鳞状细胞癌、小细胞肺癌、绒毛膜癌、横纹肌肉瘤、血管肉瘤、血管内皮瘤、威尔姆氏瘤、神经胚细胞瘤、口/咽癌、食道癌、喉癌、肾脏癌及淋巴瘤。另外，本发明化合物尤其可有效治疗诸如神经纤维瘤、结节性硬化症(这些症状各自产生良性皮肤肿瘤)、血管瘤及淋巴管生成的病状。血管生成在实体肿瘤形成及转移中显著。已发现血管生成因子与若干实体肿瘤相关，例如横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、尤恩氏肉瘤、神经胚细胞瘤及骨肉瘤。没有血液供应提供营养并去除细胞废物，肿瘤无法扩增。其中血管生成重要的肿瘤包括实体肿瘤及良性肿瘤，例如听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼及化脓性肉芽肿。预防血管生成可停止这些肿瘤的生长及因肿瘤的存在而对动物造成的损伤。应注意，血管生成已与血源性肿瘤相关，例如白血病、多种急性或慢性骨髓肿瘤性疾病的任一者(其中发生白血球的无限增殖，通常伴随贫血、血凝受损及淋巴结、肝及脾的增大)。据信，血管生成在导致白血病类肿瘤的骨髓异常中起重要作用。血管生成在肿瘤转移的两个阶段中重要。其中血管生成刺激重要的第一阶段是在肿瘤的血管形成中，其容许肿瘤细胞进入血流并循环遍及全身。肿瘤细胞离开原发位点并迁入继发性转移位点后，在新肿瘤可生长并扩大之前必然发生血管生成。因此，预防或控制血管生成可导致预防肿瘤转移，并可能将肿瘤生长限制在原发位点。儿童期最频发的血管生成疾病之一是血管瘤。在大多数情形下，这些所述肿瘤为良性且在无介入的情况下消退。在更严重的情形下，肿瘤进展至大的海绵状及浸润性形式并产生临床并发症。血管瘤的全身形式多发血管瘤具有高死亡率。<}存在用目前所用治疗剂无法治疗的治疗抵抗性血管瘤。在本说明中通篇使用血管生成疾病、血管生成病症及血管生成皮肤病症阐述由于组织中的血管形成增加而发生或导致所述组织中血管形成增加的病症、通常皮肤病症或皮肤相关病症。<}主要或次要特征为血管形成增加的任何皮肤病症出于本发明的目的视为血管生成皮肤病症且适于利用根据本发明的化合物治疗。本发明亦涵盖治疗、改善或预防以下疾病的方法：血管生成皮肤病症(例如，牛皮癣、痤疮、酒渣、疣、湿疹、血管瘤、淋巴管生成、神经纤维瘤、史德格-韦伯症候群、皮肤的静脉性溃疡、结节性硬化症、慢性发炎性疾病及关节炎)以及发炎(例如，慢性发炎性疾病，包括关节炎、狼疮及硬皮症)，这些方法包含将治疗有效量的一或多种所揭示化合物投与需要此治疗的患者。与新血管形成相关的疾病包括视神经盘新血管形成、虹膜新血管形成、视网膜新血管形成、脉络膜新血管形成、角膜新血管形成及玻璃体内新血管形成。由血管生成介导的疾病的一个实例是眼部新血管疾病。此疾病的特征在于新血管入侵至眼结构(例如，视网膜或角膜)中。其为失明最常见病因且涉及约20种眼疾。在年龄相关性黄斑退化中，随着视网膜色素上皮下纤维血管组织的增殖，脉络膜微血管穿过bruch氏膜中的缺陷向内生长引起相关视力问题。与慢性发炎及关节炎相关的疾病可通过本发明的肽、组合物及方法治疗、改善或预防。具有慢性发炎症状的疾病包括发炎性肠病(例如，克隆氏病及溃疡性结肠炎)、牛皮癣、类肉瘤病、类风湿性关节炎、骨关节炎、狼疮及硬皮症。血管生成是这些慢性发炎性疾病共有的关键要素。慢性发炎依赖于微血管芽的持续形成以维持发炎性细胞的流入。发炎性细胞的流入及存在产生肉芽肿，且因此维持慢性发炎性状态。欲以单一剂量或分开剂量投与人类或另一哺乳动物宿主的本发明肽的总日剂量可呈(例如)每天约0.0001至约750mg/kg体重，且更通常约1至约300mg/kg体重的量。在一些实施例中，医药组合物通过注射投与眼中，使得本发明的肽以以下剂量给予：每次注射约0.1mg与约50mg之间、更优选每次注射约0.3mg与约40mg之间、最优选每次注射约0.5mg与约30mg之间、约1mg与约30mg之间、约3mg与约30mg之间、约5mg与约30mg之间、约8mg与约30mg之间、约10mg与约30mg之间、约15mg与约30mg之间、约20mg与约30mg之间、约0.5mg与约25mg之间、约0.5mg与约20mg之间、约0.5mg与约15mg之间、约0.5mg与约10mg之间、约0.5mg与约5mg之间或约0.5mg与约3mg之间。此外，医药组合物为通过滴眼剂投与眼，使得将单滴含有以下浓度之本发明肽之溶液施加至眼：约10mg/ml与约600mg/ml之间、更优选约20mg/ml与约500mg/ml之间、最优选约30mg/ml与约400mg/ml之间、约30mg/ml与约350mg/ml之间、约30mg/ml与约300mg/ml之间、约30mg/ml与约250mg/ml之间、约30mg/ml与约200mg/ml之间、约30mg/ml与约150mg/ml之间、约30mg/ml与约100mg/ml之间、约30mg/ml与约50mg/ml之间、约50mg/ml与约400mg/ml之间、约100mg/ml与约400mg/ml之间、约150mg/ml与约400mg/ml之间、约200mg/ml与约400mg/ml之间、约250mg/ml与约400mg/ml之间、约300mg/ml与约400mg/ml之间或约350mg/ml与约400mg/ml之间。治疗有效量的本发明医药组合物的投与定义为达成期望结果所需的剂量及持续时间段下有效的量。举例而言，肽的治疗活性量可根据诸如以下的因素变化：个体的疾病状态、年龄、性别及体重，以及药物在个体中引发期望反应的能力。可对剂量方案进行调整以提供最优选治疗反应。举例而言，可每日投与若干分开剂量或者所述剂量可依照治疗情形的紧急程度所示按比例减少。医药组合物可经由诸如以下的任一方便或适宜途径投与需要其的个体：通过非经肠(包括(例如)动脉内、静脉内、肌内、皮下)、局部(包括皮内、经皮、皮下等)、经口、经鼻、黏膜(包括舌下)或腔内途径。因此，组合物可以多种形式调配，包括溶液、悬浮液、乳液及固体形式，且通常经调配以适于所选投与途径，例如调配为适于非经肠投与的可注射调配物，用于经口摄取的胶囊、锭剂、囊片、酏剂，呈适于通过吸入(例如，通过鼻内吸入或经口吸入)投与的气溶胶形式或适于局部投与的软膏剂、乳膏剂、凝胶或洗剂。举例而言，用于非经肠注射的医药组合物包含医药上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及在即将使用之前重构成为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜水性及非水性载剂、稀释剂、溶剂或媒剂的实例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及诸如此类)、羧甲基纤维素及其适宜混合物、植物油(例如，橄榄油)以及可注射有机酯(例如，油酸乙酯)。举例而言，可通过使用诸如卵磷脂等包覆材料、通过在分散剂的情形下维持所需粒径及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。这些组合物亦可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。举例而言，与本发明的肽相容使用的经口剂型或单位剂量可包括肽及非药物组分或赋形剂，以及其他可视为成分或包装的不可再用的材料的混合物。口服组合物可包括液体、固体及半固体剂型的至少一种。在一些实施例中，提供包含有效量的肽的口服剂型，其中该剂型包含丸剂、锭剂、胶囊、凝胶、糊剂、饮剂及糖浆的至少一种。在一些情形下，提供口服剂型，其经设计及构形以达成肽二聚体在个体小肠中的延迟释放。举例而言，局部投与包括投与皮肤或黏膜，包括肺及眼的表面。用于局部肺投与的组合物(包括用于吸入及鼻内的彼等)可涉及呈水性及非水性调配物的溶液及悬浮液，且可制备为可加压或不加压的干粉。在不加压粉末组合物中，可使用呈精细分散形式的活性成分与较大尺寸的医药上可接受的惰性载剂的混合物，所述惰性载剂包含具有(例如)直径高达100微米的尺寸的颗粒。适宜惰性载剂包括糖，例如乳糖。局部投与的另一形式是投与眼。本发明的化合物是在医药上可接受的眼用媒剂中递送，使得化合物维持与眼表面接触足够时间段以使化合物穿透眼的角膜及内部区域，如例如前房、后房、玻璃体、水样液、玻璃样液、角膜、虹膜/睫状体、晶状体、脉络膜/视网膜及巩膜。医药上可接受的眼用媒剂可为(例如)软膏剂、植物油或封装材料。或者，本发明的化合物可直接注射至玻璃样液及水样液中。本发明的肽亦可以脂质体形式来投与。如业内已知，脂质体通常是源自磷脂或其他脂质物质。脂质体通过分散于水性介质中的单层或多层水合液晶来形成。可使用任何能够形成脂质体的生理上可接受且可代谢的无毒脂质。除本发明的化合物外，呈脂质体形式的本发明组合物可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂及诸如此类。优选脂质为呈天然及合成形式二者的磷脂及磷脂酰胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法为业内已知。本说明书中所提及的任何先前出版物(或源自其的资讯)或任何已知内容不会且不应视为承认或认可或以任何形式表明所述先前出版物(或源自其的资讯)或已知内容形成本说明书相关的
技术领域：
中的普通常识的部分。现将参考以下具体实例阐述本发明，这些具体实例不应理解为以任何方式限制本发明的范畴。实例实例1本发明的肽的emt分析将mdck细胞(800个细胞/孔)接种至96孔板上并在37℃及5％co2下培育，以成为10％亚铺满。然后通过添加具有细胞分散因子hgf(r&dsystem，2.5ng/ml)的培养基触发emt并添加所测试的肽(seq2-seq31)以阻断emt。为量测核间距离，使用直立显微镜以×50放大率捕获随机影像。核间距离是自一个细胞核的中心至相邻/毗邻细胞核的中心量测。两个细胞核之间的距离是通过使用imagej软体来量测。将肽seq1至seq11自dsg2的位置500至604的氨基酸残基片段化，其显示于下图1(a)中。此外，进行emt分析以证明这些肽片段的emt抑制能力。如在图1(b)中所显示，seq6显示在抑制emt方面的有利效应。因此，针对seq6进行肽缺失研究。合成肽seq12至seq31是通过缺失一部分seq6的序列获得。合成肽seq12至seq31的序列及其对emt的抑制效应显示于图2中。实例2本发明的肽的血管生成拟态研究将人类神经胶母细胞瘤细胞(u-87)接种于经基质胶涂布的孔上(6×103个细胞/孔，于96孔板中)。然后将所测试的肽(seq17、seq32-seq38或pbs对照)分别添加至孔中并培育数天。对于管的定量，对每一孔随机拍摄三个视野并计数管的数目用于统计。根据图2，seq17显示在抑制emt方面的有利效应。进行seq17的丙胺酸筛选。seq32-seq38的合成肽序列是自seq17的丙胺酸取代合成肽获得。神经胶母细胞瘤(gbm)极具侵袭性且基本上无法治愈。其恶性的特征在于旺盛的微血管增殖。最近证据已显示，肿瘤细胞展示驱动血液灌注的血管生成拟态(vm)(一种独立于内皮细胞血管生成的替代微血管循环)的能力。在血管生成拟态研究中，使用神经胶母细胞瘤细胞系(u-87)测定seq17色胺酸残基(w，dsg2氨基酸位置544)藉助阻断基质胶触发的管结构作出的贡献。与充满管的pbs对照相比，seq17及seq32-seq38的肽显示阻断u-87管网络化的强效能(参见图3(a))。使用每一治疗组中的3个随机选择视野通过计数管来定量(参见图3(b))。(平均管数目±sd)实例3本发明的肽的huvec管形成分析(血管生成分析)收集饥饿过夜的人类脐静脉内皮细胞(huvec)并用内皮细胞生长培养基调整至1.5×104个细胞/孔(于96孔板中)且然后在经基质胶涂布的孔上接种细胞。不同肽及其通过d-形式非天然氨基酸及/或通过添加n-末端及c-末端胱胺酸环化的修饰形式；以及，seq132与肽主链seq6反方向(反向修饰)：(seq17、seq78、seq97、mr9df、cmr9c、cmr9cdf、mr9d6df、cmr9d6cdf及seq132)或对照pbs添加至孔中并在37℃下培育5小时。藉助直立显微镜以×40放大率对每一孔进行拍摄。通过使用imagej软体对总管长度进行定量。培养于基质胶上的huvec细胞证明，合成肽可抑制血管生成且结果显示于图4(a)至(d)中。实例4大鼠经雷射诱导的脉络膜新血管形成模型用氯胺酮盐酸盐/甲苯噻嗪盐酸盐(7:1，v/v)的混合物通过以1ml/kg肌内注射至大腿肌肉中使动物完全麻醉。将-p眼用溶液(santenpharmaceuticalco.,ltd.)滴注至眼中以使瞳孔扩大。使用slitlampsl-130(carlzeissmeditecag)及multicolorlaserphotocoagulatormc-300(nidekco.,ltd.)，使用雷射(波长：532nm)辐照每只动物的右眼。然后使用微注射器(ms-n10,itocorporation)及33g针(itocorporation)将肽给药调配物注射至右眼的玻璃体中。雷射辐照后14天，将4％fitc-聚葡萄糖溶液以1ml/动物的体积投与尾静脉。然后通过麻醉剂的过量投药使动物安乐死。去除眼球并将其固定于4％多聚甲醛-磷酸盐缓冲液中12-24小时。在立体显微镜(ez-4,leicamicrosystems)下制备脉络膜铺片。然后制备大鼠眼脉络膜铺片用于通过共焦显微镜(nikoneclipsete2000-u)拍摄。将使用软体imagej(卫生研究院(nih)，usa)来量测具有高萤光黄强度的经雷射诱导的新血管形成位点的面积(单位：像素)。通过532nm波长的雷射辐照大鼠的眼并用肽(seq97)、eylea或pbs以静脉内方式处理。14天后，然后将以静脉内方式注射4％fitc-聚葡萄糖溶液，以藉助萤光黄血管造影鉴别视网膜区域中流体的泄漏。图5(a)显示pbs处理的对照、eylea(200μg/5μl)及seq97(500μg/5μl)的萤光黄血管造影照片。处理(pbs、eylea或seq97)14天后，拍摄脉络膜新血管形成位点的照片并用imagej软体来定量。(n＝10)eylea与seq97二者显著抑制大鼠眼脉络膜新血管形成(参见图5(b))。(使用statlight4号进行统计学分析)序列表<110>艾斯克立必恩股份有限公司<120>dsg2-衍生肽<130>a91566/cn28256<150>us62/346,383<151>2016-06-06<160>137<170>patentin版本3.5<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<220><221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>xaa为a,t或s<220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>xaa为k,r或h<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>xaa为k,r,n,h或q<220><221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>xaa为a,v,i,g,l或p<400>1metxaagluxaatrpxaailexaaarg15<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>2metalaglulystrplysilealaarg15<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>3metalaglulystrplysilevalarg15<210>4<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>4metalaglulystrplysileilearg15<210>5<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>5metalaglulystrpargilealaarg15<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>6metalaglulystrpargilevalarg15<210>7<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>7metalaglulystrpargileilearg15<210>8<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>8metalaglulystrpasnilealaarg15<210>9<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>9metalaglulystrpasnilevalarg15<210>10<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>10metalaglulystrpasnileilearg15<210>11<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>11metalagluargtrplysilealaarg15<210>12<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>12metalagluargtrplysilevalarg15<210>13<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>13metalagluargtrplysileilearg15<210>14<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>14metalagluargtrpargilealaarg15<210>15<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>15metalagluargtrpargilevalarg15<210>16<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>16metalagluargtrpargileilearg15<210>17<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>17metalagluargtrpasnilealaarg15<210>18<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>18metalagluargtrpasnilevalarg15<210>19<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>19metalagluargtrpasnileilearg15<210>20<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>20metthrglulystrplysilealaarg15<210>21<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>21metthrglulystrplysilevalarg15<210>22<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>22metthrglulystrplysileilearg15<210>23<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>23metthrglulystrpargilealaarg15<210>24<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>24metthrglulystrpargilevalarg15<210>25<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>25metthrglulystrpargileilearg15<210>26<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>26metthrglulystrpasnilealaarg15<210>27<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>27metthrglulystrpasnilevalarg15<210>28<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>28metthrglulystrpasnileilearg15<210>29<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>29metthrgluargtrplysilealaarg15<210>30<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>30metthrgluargtrplysilevalarg15<210>31<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>31metthrgluargtrplysileilearg15<210>32<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>合成肽<400>32metthrgluargtrpargilealaarg15<210>33<211>9<212>prt<213>人工序列<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