异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸(即，2-氧代戊二酸)。这些酶属于两个不同的亚类，其中一类利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad(+))作为电子受体，另一类利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp(+))。已经报道了五种异柠檬酸脱氢酶：定位于线粒体基质的三种nad(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶，两种nadp(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶，其中一种是线粒体型的，另一种主要是胞质型的。每种nadp(+)依赖型同工酶都是二聚体。idh1基因编码的蛋白是在细胞质和过氧化物酶体中发现的nadp(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶。所述细胞质酶在细胞质nadph产生中具有重要作用。idh1在许多物种和缺乏完整柠檬酸循环的有机体中表达。最近，已经在几种类型的癌症中发现了idh1以及相关同工型idh2的突变。突变被发现出现于蛋白序列的特定氨基酸上，并且被杂合表达，与功能的获得一致。这些突变出现在功能保守的残基上，并且idh1的突变形式的生物化学研究表明idh1正常功能丧失，异柠檬酸向α-酮戊二酸可逆转化。这些突变的结果将允许α-酮戊二酸(αkg)向2-羟基戊二酸(2hg)的新(或新生形)转化。结果，包含idh1或idh2的突变形式的癌细胞形成浓度大大升高的2hg。高水平的2hg导致阻碍细胞分化，这可以通过抑制突变型idh1或idh2来逆转。在wo2013/046136中描述了某些突变型idh抑制剂。申请pct/us2016/043264公开了突变型idh1的共价抑制剂。需要用于治疗各种癌症的相对于野生型idh1而言选择性地抑制突变型idh1酶的化合物。还需要用于治疗各种癌症的相对于野生型idh1而言选择性抑制显示出新形态活性的突变型idh1酶的化合物。本发明提供了式i化合物，其是突变型idh1抑制剂。式i化合物是共价抑制剂，其相对于野生型idh1而言选择性地抑制突变型idh1，相对于野生型idh2而言选择性地抑制突变型idh2酶。本发明的一个方面提供了式i的突变型idh1酶抑制剂化合物：其中：r1是氢、nh2或氟；r2和r3是甲基或氢；或者r2是甲基、乙基、1-羟基乙基、1-甲氧基乙基、氟甲基、1-氟乙基或1-甲基乙基，且r3是氢；r4是甲基或氟甲基；r5是氢、乙基或–ch2-环丙基；或其药学上可接受的盐。本发明的另一个方面提供了式i的化合物，其中：r1是氢、6-nh2或6-氟；r2和r3是甲基；或者r2是1-甲氧基乙基或1-甲基乙基，且r3是氢；r4是甲基；r5是氢、乙基或–ch2-环丙基；或其药学上可接受的盐。本发明的另一个方面提供了选自以下的化合物：(s)-3-(2-(((s)-1-(4-((4-丙烯酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)氨基)嘧啶-4-基)-4-异丙基噁唑烷-2-酮；(s)-3-(2-((1-(4-((4-丙烯酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)氨基)-6-氟嘧啶-4-基)-4,4-二甲基噁唑烷-2-酮；(r)-3-(2-(((s)-1-(4-((4-丙烯酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)氨基)嘧啶-4-基)-4-((r)-1-甲氧基乙基)噁唑烷-2-酮；和(r)-3-(2-(((s)-1-(4-((4-丙烯酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)氨基)-6-氟嘧啶-4-基)-4-((r)-1-甲氧基乙基)噁唑烷-2-酮；或上述化合物中每一个化合物的药学上可接受的盐。本发明的另一个方面提供了化合物：(s)-3-(2-((1-(4-((4-丙烯酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)氨基)-6-氟嘧啶-4-基)-4,4-二甲基噁唑烷-2-酮；或其药学上可接受的盐。本发明的另一个方面提供了化合物，其选自：(4s)-3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-异丙基-噁唑烷-2-酮,异构体1；(4s)-3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-异丙基-噁唑烷-2-酮,异构体2；3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-6-氟-嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮,异构体1；3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-6-氟-嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮,异构体2；3-[6-氨基-2-[[(1s)-1-[4-[1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)丙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮,异构体1；3-[6-氨基-2-[[(1s)-1-[4-[1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)丙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮,异构体2；或上述化合物中任意一个化合物的药学上可接受的盐。本发明的另一个方面提供了药物组合物，其包含式i的突变型idh1抑制剂化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。本发明的另一个方面提供了治疗患者的表达突变型idh1的癌症的方法，所述癌症是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤(gbm)、星形细胞瘤、少突胶质瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(angioimmunoblastict-celllymphoma,aitl)、骨髓增生异常综合征(mds)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(aml)、黑素瘤、前列腺癌、软骨肉瘤或胆管癌，所述方法包括给有需要的患者施用治疗有效量的式i化合物或其药学上可接受的盐。本发明的另一个方面提供了治疗患者的表达突变型idh1的癌症的方法，所述癌症是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤或急性髓性白血病，所述方法包括给有需要的患者施用治疗有效量的式i化合物或其药学上可接受的盐。本发明的另一个方面提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗。本发明的另一个方面提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗表达突变型idh1的癌症，所述癌症是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)、骨髓增生异常综合征(mds)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(aml)、黑素瘤、前列腺癌、软骨肉瘤或胆管癌。本发明的另一个方面提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗表达突变型idh1的癌症，所述癌症是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤或急性髓性白血病。本发明的另一个方面提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗表达突变型idh1的癌症的药剂中的用途，所述癌症是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤、免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(aitl)、骨髓增生异常综合征(mds)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(aml)、黑素瘤、前列腺癌、软骨肉瘤或胆管癌。本发明的另一个方面提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗表达突变型idh1的癌症的药剂中的用途，所述癌症是神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质瘤、副神经节瘤、纤维肉瘤或急性髓性白血病。术语“患者”意指哺乳动物，“哺乳动物”包括但不限于人。“治疗有效量”意指抑制癌症患者的突变型idh1、从而导致对分化的阻碍被解除且伴有肿瘤细胞生长的抑制，以及消除患者的癌症或者减缓或抑制患者癌症的发展所必须的式i化合物或其药学上可接受的盐或者含有所述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的剂量。式i化合物或其药学上可接受的盐的预期剂量在20mg/患者/天至2000mg/患者/天的范围内。优选的剂量预期在30mg/患者/天至1800mg/患者/天的范围内。最优选的剂量预期在40mg/患者/天至1600mg/患者/天的范围内。治疗患者所需要的确切剂量以及治疗时间的长度由医生根据疾病的阶段和严重程度以及个体患者的具体需要和响应来确定。虽然以每天的剂量为基础进行了表述，但为了给患者提供更佳的治疗益处并且控制或改善任何与药物相关的毒性，可以调节给药剂量。除了每天一次给药之外，每天两次(b.i.d.)给药、每天三次(t.i.d.)给药、每隔一天给药(q2d)、在五天时间中每隔一天给药而后两天不给药(t.i.w.)、或者每三天给药一次(q3d)可能都是合适的。术语“治疗”包括对患者所患有的癌症的全面介入，例如，施用活性化合物以减轻、减缓或逆转癌症的一种或多种症状以及延迟癌症的进展(即使不能实际上消除癌症)。优选将式i的化合物或其药学上可接受的盐用药学上可接受的载体配制成药物组合物，并且通过各种途径施用。优选地，这类组合物用于口服施用。这类药物组合物及其制备方法是本领域公知的。参见例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,l.v.allen编辑,第22版,pharmaceuticalpress,2012。在一个具体的实施方案中，所述药物组合物包含(s)-3-(2-((1-(4-((4-丙烯酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)氨基)-6-氟嘧啶-4-基)-4,4-二甲基噁唑烷-2-酮或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体，并且任选地包含另外的治疗成分，其特别是用于治疗综合而言的癌症或特定的癌症类型。式i的化合物或药学上可接受的盐可以与一种或多种其它治疗剂同时施用，或者在施用一种或多种其它治疗剂之前或之后施用。当与一种或多种其它治疗剂一起施用时，式i的化合物或其药学上可接受的盐与其它治疗剂可以通过相同或不同的施用途径分开施用、或者在相同的药物组合物中一起施用。在施用一种或多种其它治疗剂的情况下，每种治疗剂可以同时、分开或相继施用。可以通过本领域已知的各种方法以及如下文所述的那些方法来制备式i的化合物或其药学上可接受的盐。具体的合成步骤可以以不同的顺序组合来制备式i的化合物或其药学上可接受的盐。式i的化合物按照iupac命名，也可以按照cas命名，也可以使用其它命名方式来毫无疑义地鉴定式i的化合物或其药学上可接受的盐。应理解，式i的化合物可以具有至多四个手性中心，包括带有r4、r5和r2取代基的碳原子，以及在所定义的r2基团内产生多种立体异构体的另一种可能性。应该理解，所述化合物中的一种或多种可以具有1、2、3或4个立体异构体结构，并且可以确证每种异构体。式i范围内的特定化合物可被描绘为具有所示构型的基本上对映体纯的立体异构体。对于具有显示所有立体中心的构型的式i化合物，“基本上对映体纯的”意指异构体纯度大于90％对映体过量。在另一个实施方案中，式i化合物的异构体纯度在带有r4和/或r5的碳原子上大于95％对映体过量。在另一个实施方案中，式i化合物的异构体纯度在带有r4和/或r5的碳原子上大于98％对映体过量。在另一个实施方案中，式i化合物的异构体纯度在带有r4和/或r5的碳原子上大于99％对映体过量。式i化合物的所有立体异构体(单独的立体异构体，包括非对映异构体混合物)都包括在本发明的范围内。如本文所用，对单一立体异构体的提及也包括立体异构体混合物，包括所命名的或所描绘的式i化合物。在本文中，(r)-和(s)-的cahn-ingoldprelog命名可用于指特定的立体异构体。特定的立体异构体可以使用对映体纯的或富集的起始材料通过立体特异性合成来制备。起始材料、中间体或包括式i化合物的外消旋混合物的特定立体异构体可以通过本领域公知的技术拆分，例如在stereochemistryoforganiccompounds,e.i.eliel和s.h.wilen(wiley1994)和enantiomers,racematesandresolutions,j.,jacques,a.collet和s.h.wilen(wiley1991)中所述的那些方法，包括手性固定相色谱法、酶促拆分或者为该目的而形成的非对映体如非对映体盐的分级结晶或色谱法。命名“异构体1”和“异构体2”分别是指第一个和第二个从手性色谱中洗脱的化合物，如果在合成早期开始手性色谱法，则相同的命名也应用于后续的中间体和实例。以描绘的键是指异构体混合物。在式i化合物的合成中用作初始起始材料的化合物是公知的，在商业上不可获得的情况下，可通过本领域技术人员通常采用的标准方法使用所提供的特定参考文献容易地合成或者可在通常的参考文件中找到。已知的操作和方法的例子包括在通常的参考文献中所描述的那些，例如：comprehensiveorganictransformations,vchpublishersinc,1989；compendiumoforganicsyntheticmethods,第1-10卷,1974-2002,wileyinterscience；march’sadvancedorganicchemistry:reactions,mechanisms,andstructure,第5版,michaelb.smith和jerrymarch,wileyinterscience,2001；advancedorganicchemistry,第4版,b部分,reactionsandsynthesis,francisa.carey和richardj.sundberg,kluweracademic/plenumpublishers,2000等和其中引述的参考文献。为了清楚起见，下面的流程图中未指明某些立体化学中心，但并非旨在以任何方式限制流程图的教导。本领域技术人员可以利用例如选择性结晶技术或手性色谱法等方法在本发明的化合物的合成中的任意方便的点分离或拆分单个异构体、对映体和非对映体。某些缩写定义如下∶“acn”是指乙腈；“αkg”是指α-酮戊二酸或2-酮戊二酸；“bca”是指二辛可宁酸(bicinchoninicacid)；“boc”是指叔丁氧基羰基；“bsa”是指牛血清白蛋白；“cbz”是指苄氧羰基；“cdi”是指1,1’-羰基二咪唑或二(咪唑-1-基)甲酮；“dcc”是指1,3-二环己基碳二亚胺；“1,2-dce”是指1,2-二氯乙烷；“dic”是指二异丙基碳二亚胺；“dipea”是指二异丙基乙基胺或n-乙基-n-异丙基-丙烷-2-胺；“dmap”是指二甲基氨基吡啶；“dme”是指二甲氧基乙烷；“dmea”是指二甲基乙基胺；“dmf”是指二甲基甲酰胺；“dmso”是指二甲亚砜；“dtt”是指二硫苏糖醇；“dppf”是指1,1’-二茂铁二基-双(二苯基膦基)；“edc”是指edac、edci或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；“edta”是指乙二胺四乙酸；“ee”是指对映体过量；“egta”是指乙二醇四乙酸；“etoac”是指乙酸乙酯；“etoh”是指乙醇；“et2o”是指乙醚；“ex”是指实施例；“hatu”是指六氟磷酸(二甲基氨基)-n,n-二甲基(3h-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)甲烷亚铵(methaniminium)；“hbtu”是指六氟磷酸2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；“2hg”是指2-羟基戊二酸；“d5-3hg”是指3-羟基-1,5-戊二酸-2,2,3,4,4-d5酸；“hilic”是指亲水相互作用液相色谱；“hoat”是指1-羟基-7-偶氮苯并三唑；“hobt”是指1-羟基苯并三唑水合物；“hplc”是指高效液相色谱；“ic50”是指产生对该物质可能的最大抑制响应的50％的物质浓度；“ipam”是指异丙基胺；“mcpba”是指间氯过苯甲酸；“meoh”是指甲醇；“nadp+和nahph”分别是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的氧化和还原形式；“oac”是指乙酸酯基；“pg”是指保护基；“ph”是指苯基；“prep”是指制备；“pybop”是指六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基-鏻；“pybrop”是指六氟磷酸溴-三吡咯烷基鏻；“rpm”是指每分钟转数；“rt”是指保留时间；“scx”是指强阳离子交换；“sfc”是指超临界流体色谱法；“snar”是指亲核芳香取代；“tea”是指三乙胺；“tfa”是指三氟乙酸；“thf”是指四氢呋喃；“tris”是指三(羟基甲基)氨基甲烷。本发明的化合物或其盐可以用本领域已知的各种方法制备，其中的一些方法如下面的流程图、制备例和实施例中所阐释的那样。针对所述路线中的每一种给出的具体合成步骤可以以不同的方式组合，或者与不同流程图的步骤联合，以制备本发明的化合物或其盐。可以使用本领域公知的常规方法回收下面的流程图中的每个步骤的产物，包括提取、蒸发、沉淀、色谱法、过滤、研磨和结晶。在下面的流程图中，除非另有说明，否则所有的取代基如之前所定义。试剂和起始材料是本领域技术人员可容易地获得的。除非另有定义，否则r1、r2、r3、r4和r5如针对式i所定义。流程图1x＝卤素或离去基团在流程图1的步骤a中，使用有机碱例如三乙胺和二(咪唑-1-基)甲酮在溶剂例如thf中将2取代的-4-氨基乙醇嘧啶(1)环化成取代的嘧啶2-噁唑烷-2-酮(3)。嘧啶上的x可以是卤素或其它离去基团例如甲基磺酰基。或者，对于化合物(2)，可以在snar反应中用取代的噁唑烷-2-酮的胺置换卤素，得到化合物(3)，即步骤b的产物。流程图2在流程图2中，化合物(4)可以通过本领域技术人员已知的各种方法制备。例如，取代的4-(1-氨基乙基)苯甲醛和哌嗪的还原胺化可以得到化合物(4)。或者，在烷基化条件下将来自4-[1-(卤代甲基)苯基]乙胺的卤素基团用哌嗪置换也能得到化合物(4)。在步骤c的子步骤1中，可以将化合物(4)的被保护的胺脱保护。例如，1-苯基乙胺可以在标准脱保护条件下使用碱性条件例如在溶剂如etoh中暴露于氢氧化钠水溶液脱保护，得到步骤c的子步骤1的游离胺产物。或者，如果保护基团是羧基苄基，则氢解条件例如在氢气氛下在溶剂如etoh中使用10％pd/c可得到步骤c的子步骤1的脱保护产物。然后在步骤c的子步骤2中可以将脱保护的化合物(4)的胺用2,4,6-三氟取代的嘧啶在snar反应中用溶剂如et2o在约-50至-20℃的温度下烷基化，得到化合物(5)，即步骤c的子步骤2的产物。可以在约0℃的温度下、在溶剂例如dmf中、使用碱例如氢化钠用取代的噁唑烷-2-酮的氮置换4-卤素在4-卤素或4,[5或6]-二卤素取代的嘧啶上完成第二次snar芳基化，得到化合物(6)，即步骤d的产物。在一种供替代选择的路线中，在步骤e的子步骤1中，可以将化合物(4)如步骤c的子步骤1中所述的那样脱保护，然后在步骤e的子步骤2中在snar反应中烷基化。例如，脱保护后，可以将步骤e的子步骤1的产物在溶剂如dme中、在约120℃的温度下、在微波条件下用2-取代的嘧啶-6-酮进行芳基化，其中2-位是离去基团例如甲基硫基，得到化合物(7)，即步骤e的子步骤2的产物。可以将嘧啶酮(7)用三苯基膦树脂在溶剂例如1,2-dce和四氯化碳中卤化，在约70℃加热，得到化合物(5)，即步骤f的产物。然后可以以与前面针对步骤d所述的方式相同的方式对化合物(5)进行处理，得到化合物6。流程图3或者，在流程图3步骤g的子步骤1中，可以将1-苯基乙基胺化合物(4)如流程图2步骤c的子步骤1中所述的那样脱保护，得到步骤g的子步骤1的脱保护产物。然后，可以使1-苯基乙胺与流程图1步骤a或b的产物化合物(3)在snar反应中使用加速反应的有机碱例如dipea、氟化铯、在溶剂例如dmso中、在约70-100℃的温度下进行反应，得到步骤g的子步骤2的产物化合物(6)，其是流程图2的步骤d的类似产物。对于其中r1是–nh2取代基的那些式i化合物，将流程图2的步骤d或流程图3的步骤g的被保护的哌嗪(6)胺烷基化(氨基-脱卤素卤化)，其通过使5或6氟嘧啶与氢氧化铵在dmso溶液中在加压容器中加热过夜反应来进行。可以用酸性脱保护方法例如hcl在二噁烷和meoh中的溶液或者tfa在ch2cl2中的溶液将被保护的哌嗪(6)脱保护，得到步骤h的子步骤1的脱保护哌嗪。如果噁唑烷酮的r2或r3基团被酸不稳定的基团例如o-叔丁基保护，则该基团的脱保护可以以相同操作与哌嗪脱保护一起进行。在步骤h的子步骤2中，可以将哌嗪胺用丙烯酰氯在–78至0℃的温度下、使用或不使用有机碱例如三乙胺、在溶剂例如ch2cl2中酰化，得到式i的化合物。本领域技术人员知道，酰胺偶联可以用丙烯酸和适宜的胺在溶剂如dmf中、用偶联剂例如edc和添加剂例如hobt来完成。本领域技术人员还知道，对于由羧酸与胺的反应导致的酰胺形成而言存在许多方法和试剂。例如，在偶联剂存在下、使用或补使用有机碱如dipea或tea进行适宜的胺和丙烯酸的反应可以提供式i的化合物。其它偶联剂包括碳二亚胺例如dcc、dic或羰基二咪唑例如cdi。其它酰胺偶联添加剂例如hoat也可用于增强反应。另外，可以使用非亲核阴离子的脲鎓或鏻盐例如hbtu、hatu、pybop和pybrop代替更传统的偶联剂。诸如dmap等添加剂也可用于加速所需的酰胺化反应并得到式i的化合物。式i的化合物能与许多无机和有机酸反应形成药学上可接受的酸加成盐。在任选的步骤中，式i化合物的药学上可接受的盐可以通过使适宜的式i游离碱与适宜的药学上可接受的酸在标准条件下在适合的溶剂中反应来形成。另外，这些盐的形成可以在氮保护基脱保护时同时发生。这类盐的形成在本领域中是公知的和了解的。参见例如p.stahl等人,handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selectionanduse,(vcha/wiley-vch,2002)；p.l.gould,“saltselectionforbasicdrugs,”internationaljournalofpharmaceutics,33:201-217(1986)；r.j.bastin,etal.“saltselectionandoptimizationproceduresforpharmaceuticalnewchemicalentities,”organicprocessresearchanddevelopment,4:427-435(2000)；和s.m.berge等人,“pharmaceuticalsalts,”journalofpharmaceuticalsciences,66:1-19,(1977)。本领域技术人员将理解，式i的化合物可容易地转化为药学上可接受的盐，并且可以以药学上可接受的盐的形式被分离。制备例1(1s)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙胺盐酸盐历时30分钟，向(s)-(4-(1-氨基乙基)苯基)甲醇(81.8g,541mmol)在ch2cl2(2.5l)中的溶液中滴加socl2(80ml,1.1mmol)，同时维持反应温度低于25℃。搅拌4小时后，浓缩混合物，得到黄色固体。加入acn(1l)，将混合物浓缩至500ml，过滤得到的固体，得到灰白色固体，将其真空干燥，得到第一批标题化合物。将母液也进行浓缩，得到纯度较低的产物(～20g)，为黄色固体。合并两批产物，得到标题化合物(111g,78％)。ms(m/z):170(m+h).制备例24-[[4-[(1s)-1-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]乙基]苯基]-甲基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯在0℃向(1s)-1-[4-(氯甲基)苯基]乙胺盐酸盐(10g,48.5mmol)在ch2cl2(160ml)中的溶液中加入三氟乙酐(8.2ml,58mmol)。加入tea(15ml,108mmol)，同时维持添加温度低于5℃。在0℃搅拌1小时后，将反应混合物浓缩至干，加入acn(120ml)，然后加入碳酸叔丁酯哌嗪-1-基酯(13.5g,72.5mmol)。加入k2co3(20g,144.7mmol)，将混合物加热至60℃，搅拌17小时。真空除去溶剂，加入etoac(1l)，得到固体。通过过滤除去固体，用水和盐水洗涤etoac溶液。用na2so4干燥有机相，过滤，浓缩至干，得到残余物，将其通过硅胶色谱法(10-50％丙酮/ch2cl2)纯化，得到标题化合物，为白色泡沫(15.8g,78％)。ms(m/z):416(m+h).制备例32,2,2-三氟-n-[(1s)-1-[4-(羟基甲基)苯基]乙基]乙酰胺将三氟乙酐(12ml,85.4mmol)加入到0℃的[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]甲醇(10.8g,71.4mmol)在ch2cl2(150ml)中的溶液中。10分钟后，历时30分钟滴加tea(24ml,172mmol)在ch2cl2(8ml)中的溶液，除去冷却浴，将反应搅拌过夜。真空浓缩反应混合物，用另外的ch2cl2稀释，用1nhcl水溶液和水洗涤。干燥有机相(na2so4)，过滤，浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗物质，用0-50％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为白色固体(11.1g,44.9mmol,63％)。es/ms(m/z):246(m-h).制备例4(s)-2,2,2-三氟-n-(1-(4-甲酰基苯基)乙基)乙酰胺将戴斯-马丁过碘烷(dess-martinperiodinane)(20.9g,49.3mmol)加入到0℃的2,2,2-三氟-n-[(1s)-1-[4-(羟基甲基)苯基]乙基]乙酰胺(11.1g,44.9mmol)在ch2cl2(450ml)中的溶液中。将反应混合物搅拌过夜，使其温热至室温。用另外的ch2cl2稀释反应混合物，用饱和nahco3水溶液、饱和na2s2o3水溶液和盐水洗涤。干燥合并的有机层(na2so4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其通过硅胶色谱法纯化，用0-50％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为白色固体(9.5g,39mmol,86％)。es/ms(m/z):244(m-h).制备例52,2,2-三氟-n-((1s)-1-(4-(1-羟基丙基)苯基)乙基)乙酰胺历时15分钟，在0℃将溴化乙基镁(12.23ml,36.7mmol,3m的et2o溶液)加入到(s)-2,2,2-三氟-n-(1-(4-甲酰基苯基)乙基)乙酰胺(4.5g,18.35mmol)在thf(100ml)中的溶液中。45分钟后，通过添加饱和nh4cl水溶液淬灭反应混合物，在etoac与水之间分配。分离有机层，用盐水洗涤，干燥(na2so4)，过滤，浓缩，得到标题化合物，为蜡状白色固体(5.74g,19mmol,91％纯度)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):274(m-h).制备例6n-((1s)-1-(4-(1-氯丙基)苯基)乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺在0℃将亚硫酰氯(4.63ml,63.6mmol)滴加到2,2,2-三氟-n-((1s)-1-(4-(1-羟基丙基)苯基)乙基)乙酰胺(5g,18.2mmol)在ch2cl2(150ml)中的溶液中。将反应混合物在室温搅拌2小时。浓缩混合物，得到标题化合物，为米黄色固体(5.33g,18.2mmol,100％)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):292(m-h).制备例7n-[(1s)-1-[4-(2-环丙基乙酰基)苯基]乙基]-2,2,2-三氟-乙酰胺在-78℃将正丁基锂(2.5m的己烷溶液,53ml,130mmol)滴加到n-[(1s)-1-(4-溴苯基)乙基]-2,2,2-三氟-乙酰胺(18.00g,60.79mmol)在thf(600ml)中的溶液中，以便维持内部温度低于-70℃。在添加完成后，将混合物在-78℃搅拌45分钟，加入在thf(10ml)中的溶液形式的2-环丙基-n-甲氧基-n-甲基-乙酰胺(11.4g,79.6mmol)。将混合物在-78℃搅拌45分钟，加入饱和氯化铵水溶液，将混合物温热至室温。分离各层，用无水硫酸钠干燥有机层，过滤，真空浓缩。向固体中加入少量ch2cl2，短暂加热混合物以溶解固体。浓缩混合物，脂质发生沉淀前停止，然后在剧烈搅拌下滴加己烷(150ml)，得到无色固体。通过过滤采集固体，用少量己烷洗涤，减压干燥，得到标题化合物(13.82g,76％)，为无色固体。ms(m/z):298.3(m-h).制备例8(1-(4-溴苯基)-2-氟乙基)氨基甲酸苄基酯在室温将碳酸钠(17g,160.3mmol)加入到含有1-(4-溴苯基)-2-氟-乙胺(10g,45.9mmol)的水(115ml)和ch2cl2(60ml)的双相溶剂混合物中。将混合物冷却至0℃，滴加氯甲酸苄基酯(8.45ml,57.3mmol)。在0℃搅拌2小时后，将反应混合物在室温搅拌过夜，然后用ch2cl2稀释，用饱和nahco3水溶液、水和盐水洗涤。干燥有机相(na2so4)，过滤，浓缩，溶于最少量的etoac。加入己烷，直到观察到沉淀，过滤固体，用另外的己烷洗涤。得到标题化合物，为米黄色固体(12g,34.1mmol,74％)。es/ms(m/z):352(m+h).制备例94-(1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-氟乙基)苯甲酸甲酯向parr高压反应器中加入pd(oac)2(774mg,3.28mmol)、dppf(2.3g4mmol)、(1-(4-溴苯基)-2-氟乙基)氨基甲酸苄基酯(12g,34.1mmol)、meoh(120ml)、ch3cn(180ml)和tea(12ml)。密封容器，吹扫，用co气体加压(100psi)。将反应在85℃搅拌24小时，然后冷却至室温。给parr反应器排气，浓缩反应混合物。通过硅胶色谱法纯化所需的产物，用50％etoac/己烷洗脱，然后从最少量的etoac中沉淀，缓慢添加己烷。得到标题化合物，为橙色固体(9.5g,29mmol,84％)。es/ms(m/z):332(m+h).制备例104-(1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-氟乙基)苯甲酸在室温将meoh(80ml)和2n氢氧化钠水溶液(80ml,160mmol)加入到4-(1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-氟乙基)苯甲酸甲酯(9.5g,29mmol)在thf(160ml)中的溶液中。搅拌过夜后，用6nhcl水溶液酸化反应混合物至ph4。用ch2cl2萃取混合物，干燥(na2so4)，过滤，浓缩，得到标题产物，为米黄色固体(9.2g,29mmol,100％)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):316(m-h).制备例11(2-氟-1-(4-(羟基甲基)苯基)乙基)氨基甲酸苄基酯在0℃将硼烷二甲硫(51ml,102mmol,2n的thf溶液)滴加到4-(1-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-氟乙基)苯甲酸(9.2g,29mmol)在thf(150ml)中的溶液中。将反应温热至70℃达2.5小时。冷却至室温后，通过滴加meoh淬灭反应混合物，直到不再观察到有气体放出为止。然后浓缩反应混合物，再溶于meoh，再次浓缩。将这种meoh-添加/浓缩重复2次，得到标题化合物，为黄棕色油状物(6.65g,21.9mmol,76％)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):304(m+h).制备例12(4-(1-氨基-2-氟乙基)苯基)甲醇将(2-氟-1-(4-(羟基甲基)苯基)乙基)氨基甲酸苄基酯(6.65g,21.9mmol)在etoh(200ml)中的溶液加入到混悬于etoh(200ml)中的10wt％披钯碳(2.33g,2.19mmol)中。用n2吹扫溶液并且填充h2后，加入h2入口(气囊)，将反应在室温搅拌过夜。通过硅藻土过滤溶液。向滤液中加入另外的10wt％披钯碳(2.33g,2.19mmol)，将反应混合物在h2气囊下再搅拌6小时。用硅藻土过滤溶液，浓缩滤液至干，得到标题化合物，为灰色固体(3.9g,16mmol,70％纯度)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):170(m+h).制备例131-(4-(氯甲基)苯基)-2-氟乙烷-1-胺盐酸盐在0℃将亚硫酰氯(4.7ml,65mmol)加入到(4-(1-氨基-2-氟乙基)苯基)甲醇(3.9g,16mmol,70％纯度)在ch2cl2(80ml)中的溶液中。将反应在室温搅拌4小时。过滤出固体，用et2o洗涤，然后用水吸收，用ch2cl2萃取，进一步用meoh稀释，浓缩，得到残余物，将其通过反相色谱法纯化，用10-100％ch3cn/h2o洗脱，得到标题化合物，为白色固体(2.4g,11mmol,66％)。es/ms(m/z):188(m+h).制备例144-(4-(1-氨基-2-氟乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯在室温将碳酸钾(5.9g,43mmol)加入到1-(4-(氯甲基)苯基)-2-氟乙烷-1-胺盐酸盐(2.4g,11mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4g,21.5mmol)在acn(50ml)中的溶液中。将反应混合物在60℃搅拌24小时，冷却至室温，浓缩。将粗反应混悬于ch2cl2中，用饱和nahco3水溶液和盐水洗涤。干燥有机相(na2so4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其通过反相色谱法纯化，用10-100％ch3cn/碳酸氢铵水溶液洗脱，得到标题化合物，为黄色油状物(2.47g,7.32mmol,68％)。es/ms(m/z):338(m+h).制备例154-[[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯在室温向4-[[4-[(1s)-1-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]乙基]苯基]-甲基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(203g,0.489mol)在etoh(2.4l)中的溶液中加入5mnaoh水溶液(480ml,2.40mol)。在室温搅拌3.5小时后，浓缩反应混合物以除去大部分etoh。加入etoac(2l)以溶解残余物，用水和盐水洗涤有机溶液。用etoac(2×)萃取合并的水相。用na2so4干燥合并的有机萃取物，过滤，浓缩至干，得到粗标题化合物，为黄色粘性油状物(156g,93％)，将其不经进一步纯化即使用。ms(m/z):320(m+h).制备例164-(1-(4-((s)-1-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙基)苯基)丙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯将k2co3(9.2g,67mmol)和nai(1.5g,10mmol)加入到n-((1s)-1-(4-(1-氯丙基)苯基)乙基)-2,2,2-三氟乙酰胺(4.9g,17mmol)和1-boc-哌嗪(3.7g,20mmol)在ch3cn(90ml)中的溶液中。将混合物在90℃搅拌3小时，然后冷却至室温。过滤掉固体，浓缩滤液，通过硅胶色谱法纯化，用10-40％etoac/己烷洗脱，得到标题化合物，为油状物(5.56g,12.5mmol,75％)。es/ms(m/z):444(m+h).制备例174-[2-环丙基-1-[4-[(1s)-1-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]乙基]苯基]乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯将异丙醇钛(iv)(60ml,200mmol)加入到n-[(1s)-1-[4-(2-环丙基乙酰基)苯基]乙基]-2,2,2-三氟-乙酰胺(12.0g,40.1mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(17.9g,96.1mmol)在thf(80ml)中的溶液中，将混合物在60℃搅拌过夜。将混合物冷却至室温，加入meoh(80ml)，然后分份添加氰基硼氢化钠(5.3g,80mmol)。将混合物在室温搅拌8小时，然后加入水和meoh，将混合物在室温搅拌过夜。过滤混合物以除去固体，用meoh和水冲洗固体。部分浓缩滤液以除去大部分meoh，用etoac(2×)萃取残余物。用无水硫酸钠干燥合并的有机萃取物，过滤，减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化粗物质，用0％-30％在溶剂b中的etoac梯度洗脱，其中溶剂b是1:1的己烷:ch2cl2，得到标题化合物(10.5g,56％)，为无色固体。ms(m/z):470.3(m+h).制备例184-(1-(4-((s)-1-氨基乙基)苯基)丙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯将koh(3.52g,62.7mmol)在水(11ml)中加入到4-(1-(4-((s)-1-(2,2,2-三氟乙酰氨基)乙基)苯基)丙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(5.56g,12.5mmol)在etoh(50.1ml)中的溶液中。将混合物在室温搅拌3小时，浓缩，在ch2cl2与饱和nahco3水溶液之间分配。分离有机相，用盐水洗涤，干燥(na2co3)，过滤，浓缩，得到标题化合物，为油状物(4.31g,12mmol,96％)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):348(m+h).制备例194-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯将koh水溶液(5m,69ml,350mmol)加入到4-[2-环丙基-1-[4-[(1s)-1-[(2,2,2-三氟乙酰基)氨基]乙基]苯基]乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(32.24g,68.67mmol)在etoh(350ml)中的溶液中，将得到的混合物在室温搅拌4小时。减压除去etoh，向残余物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用ch2cl2萃取混合物。用无水硫酸钠干燥合并的有机萃取物，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(24.33g,96.5％纯度,含有3.5％残留的ch2cl2,92％收率)，为无色粘性油状物。ms(m/z):374.3(m+h).制备例19a4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯，异构体1制备例19b4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯，异构体2将4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(3.23g)溶于meoh(40ml)，通过制备型手性hplc色谱法使用如下条件分离成各非对映体：柱chiralpakad,20μm,(8×33cm)；进样体积10ml；洗脱液是含有0.2％dmea的100％甲醇；检测波长220nm；流速400ml/min。实施例19a,4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体1得自第一个洗脱峰，为澄清粘性油状物(1.50g,46％,>99％de,rt＝4.2分钟)。ms(m/z):374.3(m+h)。实施例19b,4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体2得自第二个洗脱峰，为澄清粘性油状物(1.46g,45％,>98.2％de,rt＝5.7分钟)。ms(m/z):374.3(m+h).制备例202-((2-(甲基硫基)嘧啶-4-基)氨基)乙烷-1-醇将dipea(5ml,29mmol)加入到4-氯-2-甲基硫基-嘧啶(4.2g,26mmol)和2-氨基乙醇(3.2g,52mmol)在ch3cn(60ml)中的溶液中。将混合物在80℃搅拌2小时，然后在50℃浓缩。将粗产物用etoac吸收，用水洗涤，干燥(na2co3)，过滤，浓缩。通过硅胶色谱法纯化该物质，用0-100％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为白色固体(3.33g,18.0mmol,69％)。es/ms(m/z):186(m+h).制备例21(s)-3-(2-氯嘧啶-4-基)-4-乙基噁唑烷-2-酮在室温将tea(0.864ml,6.2mmol)加入到(2s)-2-[(2-氯嘧啶-4-基)氨基]丁烷-1-醇(1.25g,6.2mmol)[ger.offenlegungsschrift,102009001438,2010年9月16日]和二(咪唑-1-基)甲酮(1.21g,7.44mmol)在thf(12.4ml)中的溶液中。在搅拌5小时后，加入另外的二(咪唑-1-基)甲酮(1.21g,7.44mmol)和tea(0.864ml,6.2mmol)，将得到的混合物温热至50℃，搅拌3小时。除去加热，将得到的混合物静置16小时，然后用水稀释，用etoac(3×)萃取。然后用1mhcl水溶液和盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(mgso4)，过滤，浓缩，得到标题化合物，为白色固体(1.20g,5.27mmol,85％)。es/ms(m/z):228(m+h).基本上按照与制备例21的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表1制备例233-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-4-基)噁唑烷-2-酮在室温将mcpba(7.4g,30mmol,70wt％)加入到3-(2-甲基硫基嘧啶-4-基)噁唑烷-2-酮(3.0g,14mmol)在ch2cl2(71ml)中的溶液中。在搅拌1小时后，过滤出固体，浓缩滤液，得到固体。将该固体与et2o一起研磨，真空干燥，得到标题化合物，为白色固体(2.63g,9.30mmol,86％纯度)。es/ms(m/z):244(m+h).制备例24(s)-3-(2-氯嘧啶-4-基)-4-甲基噁唑烷-2-酮在室温将氢化钠(379mg,9.48mmol,60％在矿物油中)以固体形式加入到2,4-二氯嘧啶(1.47g,9.89mmol)和(s)-4-甲基噁唑烷-2-酮(877mg,8.2mmol,95％纯度)在dmf(16.5ml)中的溶液中。在室温搅拌16小时后，用饱和nh4cl水溶液淬灭混合物，用etoac(3×)萃取。合并有机萃取物，干燥(mgso4)，过滤，浓缩。将粗物质溶于9:1ch2cl2/meoh，过滤掉不需要的白色固体。通过硅胶色谱法纯化在滤液中获得的粗产物，用5％-100％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为白色固体(518mg,2.42mmol,29％)。es/ms(m/z):214(m+h).制备例25((2r,3s)-3-(叔丁氧基)-1-羟基丁烷-2-基)氨基甲酸苄基酯在-25℃将4-甲基吗啉(0.540ml,4.9mmol)加入到在thf(30ml)中的氯甲酸异丁酯(0.640ml,4.90mmol)和(2s,3s)-2-(苄基氧基羰基氨基)-3-叔丁氧基-丁酸n-环己基环己铵(2.00g,4.08mmol)中。10分钟后，通过过滤除去固体，用最少量的无水thf冲洗。将滤液冷却至-20℃，加入硼氢化钠(231mg,6.1mmol)，然后加入水(4ml)。将混合物在-20℃搅拌10分钟，然后在室温搅拌2小时。加入水，用etoac(2×)萃取混合物。用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(na2so4)，过滤，浓缩，得到标题化合物，为黄色油状物(1.367g,3.93mmol,85％纯度)。es/ms(m/z):240(m+h-叔丁基)。基本上按照与制备例25的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表2制备例27(r)-4-((s)-1-(叔丁氧基)乙基)-3-(4-甲氧基苄基)噁唑烷-2-酮在0℃将氢化钠(616mg,15.4mmol,60％在矿物油中)加入到((2r,3s)-3-(叔丁氧基)-1-羟基丁烷-2-基)氨基甲酸苄基酯(2.61g,7.51mmol)在dmf(40ml)中的溶液中，将混合物搅拌30分钟。向混合物中加入4-甲氧基苄基氯(1.49ml,11.3mmol)和碘化四丁基铵(277mg,0.749mmol)，将溶液温热至室温，搅拌过夜。将反应混合物倾倒在冰水(200ml)上，在搅拌的同时加入etoac。分离etoac层，用另外的etoac(2×)萃取水相。用5％licl水溶液(2×)洗涤合并的etoac萃取物，干燥(na2so4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其通过硅胶色谱法纯化，用0-20％etoac/己烷洗脱，得到标题化合物(1.91g,6.21mmol,83％)。es/ms(m/z):308(m+h).基本上按照与制备例27的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表3制备例29(r)-4-((s)-1-羟基乙基)-3-(4-甲氧基苄基)噁唑烷-2-酮在室温将tfa(15ml,198mmol)加入到在ch2cl2(15ml)中的(r)-4-((s)-1-(叔丁氧基)乙基)-3-(4-甲氧基苄基)噁唑烷-2-酮(2.31g,7.51mmol)的溶液中，将混合物搅拌20分钟，浓缩至干。将粗产物再溶于另外的ch2cl2，浓缩。将添加ch2cl2和浓缩再重复一次，得到标题化合物，为黄色油状物(1.97g,7.51mmol,100％)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):252(m+h).基本上按照与制备例29的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表4制备例31(r)-4-((r)-1-氟乙基)-3-(4-甲氧基苄基)噁唑烷-2-酮在0℃用tea(5ml,35.9mmol)处理(r)-4-((s)-1-羟基乙基)-3-(4-甲氧基苄基)噁唑烷-2-酮(985mg,3.92mmol)在ch3cn(13ml)中的溶液。依次加入九氟丁烷磺酰氟(2.11ml,11.7mmol)和三乙胺三氢氟酸盐(1.94ml,11.7mmol)，将混合物在0℃搅拌1小时。加入另外的九氟丁烷磺酰氟(0.9ml,5mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(1ml,6mmol)和tea(2.5ml,17.95mmol)，将混合物在0℃搅拌45分钟。加入另外的九氟丁烷磺酰氟(1.05ml,5.8mmol)、三乙胺三氢氟酸盐(1ml,6mmol)和tea(2.5ml,17.95mmol)，将混合物在0℃搅拌30分钟。用水淬灭混合物，用etoac(3×)萃取。用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(na2so4)，过滤，浓缩。将粗混合物用ch2cl2吸收，过滤掉固体。浓缩得到的滤液，通过硅胶色谱法纯化残余物，用20-60％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为黄色油状物(300mg,1.18mmol,30％)。es/ms(m/z):254(m+h).基本上按照与制备例31的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表5制备例33(r)-4-((r)-1-氟乙基)噁唑烷-2-酮在65℃将(r)-4-((r)-1-氟乙基)-3-(4-甲氧基苄基)噁唑烷-2-酮(290mg,1.15mmol)在tfa(6ml)中的溶液加热40小时。将混合物冷却至室温，浓缩。将粗产物再溶于另外的ch2cl2，浓缩。将该步骤再重复一次，以除去残留的tfa。通过硅胶色谱法纯化粗残余物，使用30-80％etoac/ch2cl2梯度洗脱，得到标题化合物，为琥珀色油状物(141mg,1.06mmol,93％)。es/ms(m/z):134(m+h).基本上按照与制备例33的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表6制备例37(r)-4-((r)-1-(叔丁氧基)乙基)噁唑烷-2-酮在0℃将氢化钠(822mg,20.6mmol,60％在矿物油中)加入到n-[(1r,2r)-2-叔丁氧基-1-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸苄基酯(4.35g,13.7mmol)在thf(70ml)中的溶液中。在0℃搅拌1小时后，将反应混合物温热至室温过夜。将混合物用饱和nh4cl水溶液淬灭，用etoac(2×)萃取，干燥(na2so4)，过滤，浓缩。用硅胶色谱法纯化该物质，用30-70％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为无色油状物，静置后固化成白色固体(1.95g,9.35mmol,90％纯度)。es/ms(m/z):188(m+h).制备例38(r)-3-(4-甲氧基苄基)-4-((s)-1-甲氧基乙基)噁唑烷-2-酮在0℃将氢化钠(300mg,7.5mmol,60％在矿物油中)加入到(4r)-4-[(1s)-1-羟基乙基]-3-[(4-甲氧基苯基)甲基]噁唑烷-2-酮(985mg,3.92mmol)在dmf(20ml)中的溶液中。30分钟后，加入ch3i(0.732ml,11.75mmol)。另外30分钟后，加入另外的氢化钠(100mg,2.5mmol,60％在矿物油中)，将反应搅拌45分钟，然后用饱和nh4cl水溶液淬灭，加入水，将反应混合物用etoac(3×)萃取。将合并的有机萃取物干燥(na2so4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其用硅胶色谱法纯化，用25-60％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为无色油状物(423mg,1.59mmol,41％)。es/ms(m/z):266(m+h).基本上按照与制备例38的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表7制备例404-(4-((s)-1-((4-((s)-4-异丙基-2-氧代噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯在室温下将氟化铯(9.35g,61.6mmol)加入到(s)-3-(2-氯嘧啶-4-基)-4-异丙基噁唑烷-2-酮(7.44g,30.8mmol)[pct国际申请(2013),wo2013046136]在dmso(50ml)中的溶液中。然后加入dipea(8.05ml,46.2mmol)。将得到的混合物加入到4-[[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(10.0g,31.4mmol)在dmso(50ml)中的溶液中。将反应混合物在60℃加热6小时，在70℃加热17.5小时，在90℃加热1.5小时。冷却反应混合物，用nacl水溶液(50％饱和)稀释，用etoac(3×)萃取。合并有机萃取物，用盐水洗涤，干燥(mgso4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其通过硅胶色谱法(35-95％etoac/己烷)纯化，得到标题化合物(10.72g,20.4mmol,66％)。es/ms(m/z):525(m+h).基本上按照与制备例40的方法相同的方式使用适宜的试剂制备了下列化合物。表8制备例504-[1-[4-[(1s)-1-[[4-[(4r)-4-[(1r)-1-叔丁氧基乙基]-2-氧代-噁唑烷-3-基]嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯将4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(350mg,0.91mmol)、(4r)-4-[(1r)-1-叔丁氧基乙基]-3-(2-氯嘧啶-4-基)噁唑烷-2-酮(273mg,0.91mmol)、氟化铯(152mg,1.00mmol)和dipea(0.17ml,1.00mmol)在dmso(3.0ml)中的混合物在密封小瓶中加热至约85℃。约6小时后，将混合物冷却至室温，在et2o与水之间分配。用饱和nacl水溶液洗涤有机层，浓缩。用硅胶色谱法纯化粗物质，用20％-50％etoac的己烷溶液梯度洗脱，得到标题化合物，为油状物(288mg,0.448mmol,49％)。es/ms(m/z):637.4(m+h).制备例514-[2-环丙基-1-[4-[(1s)-1-[[4-[(4s)-4-异丙基-2-氧代-噁唑烷-3-基]嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体1将4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体1(1.3g,3.48mmol)、(4s)-3-(2-氯嘧啶-4-基)-4-异丙基-噁唑烷-2-酮(1.09g,4.51mmol)、氟化铯(1.59g,10.5mmol)和dipea(0.911ml,5.22mmol)在dmso(17ml)中的混合物在70℃放入预热模块中，搅拌2小时。将反应混合物冷却至室温，用etoac稀释，用3×水洗涤。再用2×etoac萃取合并的水层。合并有机萃取物，用na2so4干燥，过滤，真空除去溶剂，得到粗产物。通过硅胶闪式色谱法纯化产物，用30-60％etoac的己烷溶液梯度洗脱，得到标题化合物(1.97g,93％)，为白色无定形固体。es/msm/z579(m+h).基本上按照与制备例51的方法相同的方式制备了下列化合物。表9制备例534-(4-1-((4-((s)-4-乙基-2-氧代噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氟乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体2将4-(4-(1-((4-((s)-4-乙基-2-氧代噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基)氨基)-2-氟乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(540mg,1.0mmol)溶于meoh(4ml)，通过手性sfc色谱法使用如下条件拆分：柱：chiralpakas-h,21.2x150mm)；进样体积：0.9mlx5,洗脱液：15％ipa(0.2％ipam)/co2，检测波长：225nm；洗脱时间：10min；流速：70g/min；柱温：40℃；bpr设定点：100巴；bpr温度：35℃。分离标题化合物，为第二个洗脱峰(异构体2)，为白色固体(260mg,0.48mmol,48％,rt＝3.04,>99％ee)。es/ms(m/z):529(m+h).基本上按照与制备例53的方法相同的方式制备了下列化合物。表10制备例57(s)-4-(4-(1-((4,6-二氟嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯将2,4,6-三氟嘧啶(278mg,2.07mmol)在et2o(10ml)中的溶液冷却至-20℃，通过滴加4-[[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(600mg,1.88mmol)在et2o(10ml)中的溶液处理。将得到的混合物在-20℃搅拌1小时，然后温热至室温，搅拌过夜。通过过滤除去固体，用另外的et2o洗涤。用水、使用一小份nacl添加剂洗涤滤液，以减少乳化，用et2o(1×)和ch2cl2(1×)反萃取水层。然后干燥合并的有机萃取物(na2so4)，过滤，浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶色谱法纯化，使用20-60％etoac/己烷洗脱，得到标题化合物，为浅黄色油状物(606mg,1.40mmol,74％)。es/ms(m/z):434(m+h).制备例584-(2-环丙基-1-(4-((s)-1-((4,6-二氟嘧啶-2-基)氨基)乙基)苯基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体1将2,4,6-三氟嘧啶(1.7g,13mmol)在et2o(56ml)中的溶液冷却至-30℃至-40℃，通过滴加4-[1-[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯异构体1(5.5g,15mmol)在et2o(56ml)中的溶液处理。搅拌混合物，将温度维持在-30℃至-40℃达45分钟。45分钟后，除去冷却浴，将反应在室温下搅拌过夜。用饱和碳酸氢钠水溶液稀释反应，用3×ch2cl2萃取。合并有机层，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，通过硅胶闪式色谱法纯化，使用20％-50％etoac/己烷洗脱，得到标题化合物(5.318g,74％)，为白色无定形固体。es/msm/z488(m+h).基本上按照与制备例58的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表11制备例604-(4-((s)-1-((4-氟-6-((s)-4-异丙基-2-氧代噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯在0℃将氢化钠(61mg,1.53mmol,60％在矿物油中)加入到(s)-4-(4-(1-((4,6-二氟嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(550mg,1.27mmol)在dmf(6ml)中的溶液中。1分钟后，加入(s)-4-异丙基噁唑烷-2-酮(180mg,1.39mmol)，将混合物在0℃搅拌1小时，然后温热至室温，搅拌过夜。然后将反应混合物用水淬灭，用etoac萃取。用5％licl水溶液(2×)洗涤etoac萃取物，干燥(na2so4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其通过硅胶色谱法纯化，用30-50％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为固体(500mg,0.92mmol,73％)。es/ms(m/z):543(m+h).基本上按照与制备例60的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表12制备例644-[2-环丙基-1-[4-[(1s)-1-[[4-(4,4-二甲基-2-氧代-噁唑烷-3-基)-6-氟-嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体1将4,4-二甲基噁唑烷-2-酮(493mg,4.282mmol)在dmf(20ml)中的溶液冷却至0℃，用氢化钠(187mg,4.67541mmol)处理，搅拌约40分钟。加入4-[2-环丙基-1-[4-[(1s)-1-[(4,6-二氟嘧啶-2-基)氨基]乙基]苯基]乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯异构体1(1.90g,3.90mmol)在dmf(10ml)中的溶液，将混合物温热至室温，此时切断冷却浴过夜。当反应完成时，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，用etoac萃取。用5％licl水溶液洗涤有机萃取物，采集，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，通过硅胶快速色谱法纯化，使用20％-40％etoac/己烷洗脱，得到标题产物(1.12g,48％)，为白色无定形固体。es/msm/z583(m+h).基本上按照与制备例64的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表13制备例66(s)-4-(4-(1-((6-氧代-1,6-二氢嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯将2-甲基硫基-1h-嘧啶-6-酮(4.81g,33.8mmol)、4-[[4-[(1s)-1-氨基乙基]苯基]甲基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(9.00g,28.2mmol)和dme(56ml)等分入3个微波容器中，将其密封，加热至120℃达4天。将反应混合物冷却至室温，合并，浓缩，重新混悬于ch2cl2。过滤掉固体，使滤液吸附在硅胶上，在硅胶上进行色谱处理，用1-7％meoh/ch2cl2梯度洗脱，得到标题化合物，为灰白色固体(10.55g,22.45mmol,88％纯度)。es/ms(m/z):414(m+h).制备例67(s)-4-(4-(1-((4-氯嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯将(s)-4-(4-(1-((6-氧代-1,6-二氢嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(10.55g,22.45mmol,88％纯度)、四氯化碳(6.5ml)、三苯膦树脂(22.5g,67mmol,3mmol膦/g)和1,2-dce(300ml)的混合物在70℃搅拌6小时，然后冷却至室温。加入meoh(300ml)，将得到的混合物剧烈搅拌30分钟。通过过滤从混合物中除去树脂，用另外的meoh冲洗，加入到滤液中。浓缩合并的滤液，将残余物溶于ch2cl2，用饱和nahco3水溶液洗涤。用ch2cl2(2×)反萃取水相。干燥合并的有机萃取物(na2so4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其通过硅胶色谱法纯化，用35-60％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为白色无定形固体(6.85g,15.9mmol,71％)。es/ms(m/z):432(m+h).制备例684-(4-((s)-1-((4-((r)-4-((r)-1-氟乙基)-2-氧代噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯通过使n2气体鼓泡5-10分钟将(s)-4-(4-(1-((4-氯嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(400mg,0.925mmol)、(r)-4-((r)-1-氟乙基)噁唑烷-2-酮(136mg,1.02mmol)和cs2co3(513mg,1.57mmol)在1,4-二噁烷(4.5ml)中的溶液脱气。然后加入三(二亚苄基丙酮)二钯(51mg,0.056mmol)和4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(113mg,0.195mmol)，重复进行脱气。密封容器，在100℃加热4.5小时。将混合物冷却至室温，用etoac稀释，用硅藻土过滤。用水洗涤滤液，用另外的etoac萃取水相。干燥合并的有机萃取物(na2so4)，过滤，浓缩。用硅胶色谱法纯化残余物，用70-100％etoac/己烷梯度洗脱，得到标题化合物，为浅黄色无定形固体(421mg,0.796mmol,86％)。es/ms(m/z):529(m+h).基本上按照与制备例68的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表14制备例724-[1-[4-[(1s)-1-[[4-氨基-6-(4,4-二甲基-2-氧代-噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]丙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯,异构体1在压力容器中用氢氧化铵(72％,1ml,10eq.)处理4-[1-[4-[(1s)-1-[[4-(4,4-二甲基-2-氧代-噁唑烷-3-基)-6-氟-嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]丙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯异构体1(1.62g,2.74mmol)的dmso溶液(14ml)，加热至110℃过夜。将反应冷却至室温，用etoac稀释，用水(3×)洗涤。收集有机层，用mgso4干燥，过滤，减压除去溶剂，得到标题化合物，为白色无定形固体(1.51g,93％)。es/msm/z554(m+h).基本上按照与制备例72的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表15制备例74(s)-4-异丙基-3-(2-(((s)-1-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)乙基)氨基)嘧啶-4-基)噁唑烷-2-酮在室温下将tfa(69ml,912.6mmol)加入到4-(4-((s)-1-((4-((s)-4-异丙基-2-氧代噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(10.7g,20.4mmol)在ch2cl2(204ml)中的溶液。搅拌4小时后，用饱和na2co3水溶液将反应的ph调整至9，用ch2cl2(3×)萃取得到的混合物。合并有机萃取物，干燥(mgso4)，过滤，浓缩，得到残余物，将其通过硅胶色谱法纯化，使用0-15％7n-nh3的meoh/etoac溶液梯度洗脱，得到标题化合物(7.76g,18.3mmol,90％)。es/ms(m/z):425(m+h).基本上按照与制备例74的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表16制备例91(4s)-3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-哌嗪-1-基-乙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-异丙基-噁唑烷-2-酮,异构体1用tfa(5ml,66.13mmol)处理4-[2-环丙基-1-[4-[(1s)-1-[[4-[(4s)-4-异丙基-2-氧代-噁唑烷-3-基]嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯异构体1(1.97g,3.40mmol)在ch2cl2(15ml)中的溶液，在室温下搅拌过夜。除去溶剂，将残余物溶于ch2cl2。用10％碳酸钠水溶液使溶液的ph呈碱性。分离各层，用2×ch2cl2反萃取水层。合并有机萃取物，用na2so4干燥，过滤，减压浓缩，得到标题化合物(1.691g,97％)。es/msm/z479(m+h).制备例92(4r)-3-[2-[[(1s)-1-[4-(2-环丙基-1-哌嗪-1-基-乙基)苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-[(1r)-1-羟基乙基]噁唑烷-2-酮将tfa(2ml)加入到4-[1-[4-[(1s)-1-[[4-[(4r)-4-[(1r)-1-叔丁氧基乙基]-2-氧代-噁唑烷-3-基]嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]-2-环丙基-乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(288mg,0.448mmol)在(2ml)中的溶液中，在室温下搅拌混合物。约2小时后，浓缩混合物，溶于meoh。用scx柱纯化溶液。用meoh冲洗柱，用1n氨的meoh溶液洗脱标题化合物。浓缩氨/meoh溶液，得到标题化合物，为油状物(176mg,0.359mmol,80％)，将其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z):481.2(m+h).制备例933-[6-氨基-2-[[(1s)-1-[4-[1-哌嗪-1-基丙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮,异构体1用tfa(4ml)处理4-[1-[4-[(1s)-1-[[4-氨基-6-(4,4-二甲基-2-氧代-噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]丙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.50g,2.55mmol)的ch2cl2溶液(13ml)，在室温下搅拌过夜。用10％碳酸钾水溶液稀释反应，用3×ch2cl2萃取。合并有机萃取物，用固体na2so4干燥，过滤，减压除去溶剂，得到标题化合物，为浅黄色无定形固体(1.285g,100％)。es/msm/z454(m+h).基本上按照与制备例93的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表16a制备例94(s)-4-乙基-3-(2-(((s)-1-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)乙基)氨基)嘧啶-4-基)噁唑烷-2-酮将4-(4-((s)-1-((4-((s)-4-乙基-2-氧代噁唑烷-3-基)嘧啶-2-基)氨基)乙基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(749mg,1.47mmol)溶于hcl(4m的二噁烷溶液,1.8ml,7.3mmol)和ch2cl2(2.9ml)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后浓缩，得到标题化合物的hcl盐，将其使用预先用meoh洗涤并且用2nnh3的meoh溶液冲洗的25-g阳离子交换scx柱脱盐，得到标题化合物，为无色油状物(491mg,1.20mmol,82％)。es/ms(m/z):411(m+h).基本上按照与制备例94的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表17制备例963-[2-[[(1s)-1-[4-[(2-环丙基-1-哌嗪-1-基-乙基]苯基]乙基]氨基]-6-氟-嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮二盐酸盐,异构体1用hcl(4.0mol/l的1,4-二噁烷溶液(9.5ml,38mmol)处理4-[2-环丙基-1-[4-[(1s)-1-[[4-(4,4-二甲基-2-氧代-噁唑烷-3-基)-6-氟-嘧啶-2-基]氨基]乙基]苯基]乙基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.11g,1.85mmol)在ch2cl2(9ml)中的溶液，在室温下搅拌3小时。将反应减压浓缩，得到标题化合物(1.142g,90质量％,100％)，为白色固体。es/msm/z483(游离碱的m+h).基本上按照与制备例96的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表17a实施例1(s)-3-(2-(((s)-1-(4-((4-丙烯酰基哌嗪-1-基)甲基)苯基)乙基)氨基)嘧啶-4-基)-4-异丙基噁唑烷-2-酮在0℃向(s)-4-异丙基-3-(2-(((s)-1-(4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)乙基)氨基)嘧啶-4-基)噁唑烷-2-酮(4.6g,11mmol)在ch2cl2(100ml)中的溶液中加入丙烯酰氯(0.97ml,12mmol)。15分钟后，加入饱和nahco3水溶液，除去冷却浴。将得到的混合物用盐水进一步稀释，用ch2cl2(3×)萃取，干燥(mgso4)，过滤，浓缩，得到白色固体，将其通过硅胶色谱法纯化，用50-100％己烷/[10％meoh的丙酮溶液]洗脱，得到标题化合物，为白色固体(4.35g,9.1mmol,84％)。es/ms(m/z):479(m+h).基本上按照与实施例1的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表18实施例20(4s)-3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-异丙基-噁唑烷-2-酮,异构体1将(4s)-3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-哌嗪-1-基-乙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-异丙基-噁唑烷-2-酮异构体1(1.665g,3.270mmol)在ch2cl2(30ml)中的溶液冷却至0℃，通过滴加丙烯酰氯(306μl,3.760mmol)在ch2cl2(3ml)中的溶液处理，在室温下搅拌。将混合物用meoh(约3ml)、然后用碳酸氢钠水溶液淬灭，温热至室温。分离各层，用3×ch2cl2反萃取水层。合并有机萃取物，用na2so4干燥，过滤，减压除去溶剂，得到粗产物。将粗物质用硅胶闪式色谱法纯化，用20-40％(10％meoh的丙酮溶液)的己烷溶液梯度洗脱，得到标题化合物，为无定形固体(1.304g,74％)。es/msm/z533(m+h).基本上按照与实施例20的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表19实施例223-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]-6-氟-嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮,异构体1用饱和nahco3处理3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-哌嗪-1-基-乙基]苯基]乙基]氨基]-6-氟-嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮异构体1二盐酸盐(1.118g,1.811mmol,90质量％)在ch2cl2(约50ml)中的溶液，分离各层。用另外的2×ch2cl2萃取水层，用na2so4干燥合并的有机层。将ch2cl2溶液(约100ml)冷却至0℃，通过滴加丙烯酰氯(170μl,2.089mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液处理，在0℃搅拌2分钟。将混合物用meoh(约1ml)淬灭，用饱和nahco3稀释，温热至室温。将反应用2×ch2cl2萃取，合并有机萃取物，用na2so4干燥，减压浓缩，通过硅胶闪式色谱法纯化，用10％-30％(10％meoh的丙酮溶液)的己烷溶液系统，得到标题化合物，(870mg,89％)，为白色无定形固体。es/msm/z537(m+h).基本上按照与实施例22的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表20实施例243-[6-氨基-2-[[(1s)-1-[4-[1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)丙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮,异构体1将3-[6-氨基-2-[[(1s)-1-[4-[1-哌嗪-1-基丙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4,4-二甲基-噁唑烷-2-酮异构体1(1.26g,2.78mmol)的ch2cl2溶液(24ml)用冰浴冷却。冷却后，通过经注射器滴加丙烯酰氯(224μl,2.75mmol)的ch2cl2溶液(1ml)处理该溶液，得到粘性油状沉淀物。将混悬液冷却至-78℃，用tea(387μl,2.78mmol)处理，在-78℃搅拌15分钟。将反应用meoh(1ml)淬灭，用饱和碳酸氢钠水溶液稀释，使其温热至室温。分离各层，用2×ch2cl2萃取水层。合并有机萃取物，用na2so4干燥，过滤，减压除去溶剂。将粗物质通过硅胶闪式色谱法纯化，用2％-5％meoh的ch2cl2溶液梯度洗脱，得到标题化合物(855mg,59％)，为白色无定形固体。es/msm/z508(m+h).基本上按照与实施例24的方法相同的方式使用适宜的中间体制备了下列化合物。表21实施例264r)-3-[2-[[(1s)-1-[4-[2-环丙基-1-(4-丙-2-烯酰基哌嗪-1-基)乙基]苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-[(1r)-1-羟基乙基]噁唑烷-2-酮将丙烯酰氯(1.23m的ch2cl2溶液,0.292ml,0.3589mmol)加入到(4r)-3-[2-[[(1s)-1-[4-(2-环丙基-1-哌嗪-1-基-乙基)苯基]乙基]氨基]嘧啶-4-基]-4-[(1r)-1-羟基乙基]噁唑烷-2-酮(176mg,0.3589mmol)在ch2cl2(5ml)中的溶液中，用干冰丙酮浴冷却。～20分钟后，将混合物在ch2cl2与饱和碳酸氢钠溶液之间分配。用饱和nacl水溶液洗涤有机层，用na2so4干燥，过滤，浓缩。将粗残余物用硅胶色谱法纯化，用10％-70％[10％meoh的etoac溶液]的ch2cl2溶液洗脱，得到标题化合物，为白色固体(199mg,100％)。s/ms(m/z):535.4(m+h).癌症越来越多地被认为是疾病的异质累积，它的起始和发展是由一种或多种在细胞和组织微环境中调节dna修复、基因稳定性、细胞增殖、细胞死亡、粘附、血管生成、侵入和转移的基因的功能异常引起的。“癌症”基因的变异或异常的功能可起因于天然存在的dna多态性、基因组拷贝数的变化(通过扩增、删除、染色体丧失或复制)、基因和染色体结构的变化(通过染色体易位、反转或导致基因表达失调的其它重排)和点突变。癌性肿瘤可以由一种异常基因功能引起，并且被相同的异常基因功能所保持，或由其它异常基因功能加强保持和发展。除了上述遗传性染色体畸变以外，每种癌症还可以包括基因组的后天修饰，包括dna甲基化、基因组印迹和通过乙酰化、甲基化或磷酸化进行的组蛋白修饰。后天修饰可以在恶性疾病的诱导和/或保持中发挥作用。已经汇编了人类癌症中的细胞遗传畸变的大量目录，并且在线保持和经常更新(参见themitelmandatabaseofchromosomeaberrationsincancerattheusnationalcancerinstitute(nci)cancergenomeanatomyproject(cgap)website)。wellcometrustsangerinstitutecancergenomeproject保持了所有与肿瘤发生有关的人类基因的详细在线“癌症基因统计(cancergenecensus)”以及人类癌症中的体细胞突变的cosmic(catalogueofsomaticmutationsincancer)数据库。含有偶然与各种癌症有关的细胞遗传变化的丰富信息的其它来源是atlasofgeneticsandcytogeneticsinoncologyandhaematology。通过活检、免疫表型分型及其它测试来诊断癌性恶性病是已知的且常规使用的。除了高分辨染色体显带和先进的染色体成像技术之外，还可以通过细胞遗传分析例如原位杂交荧光(fish)、核型分析、光谱核型分析(sky)、复合fish(m-fish)、对比基因组杂交(cgh)、单核苷酸多态性阵列(snpchips)及本领域技术人员已知的和使用的其它诊断和分析试验来确定怀疑为癌症的病例中的染色体畸变。已经在多种癌性肿瘤类型中鉴定了idh1的突变，包括但不限于：神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(gbm)、星形细胞瘤、少突胶质瘤、副神经节瘤、骨髓增生异常综合征(mds)、b细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)、甲状腺癌、结肠直肠癌、急性髓性白血病(aml)，dang等人,trendsmol.med.,2010,16:387-397；ward等人,oncogene,2012,31(19):2491-2498；黑素瘤,shibata等人,am.j.pathol.,2010,178(3):1395-1402；前列腺癌,flaherty等人,j.clin.oncol.,2014,32(增刊4；摘要213)；cairns等人,cancerdiscovery,2013,3:730-741；软骨肉瘤和胆管癌,balss等人,actaneuropathol.,2012,124:883-891；cairns等人,cancerdiscovery,2013,3:730-741,血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤(angioimmunoblastict-celllymphoma)(aitl),cairns等人blood,2012.119(8):1901-1903。在下列活性位点的特定残基上或其附近已经发现突变：g97d、r100、r132h、r132c、r132s、r132v、r132g、v71i、r132l和g123r(对于idh1而言)，dang等人,trendsmol.med.,2010,16:387-397；ward等人,2012和补充表2。已经表明，idh1的突变形式具有使α-酮戊二酸还原为2-羟基戊二酸的新形态活性(功能获得)。2-羟基戊二酸的内源性产生是对映体特异性的，导致产生d-对映体(也称为(r)对映体)。通常，细胞具有低水平的2-羟基戊二酸，而证据表明含有idh1突变的细胞具有显著升高水平的2-羟基戊二酸。在含有突变的肿瘤中和在具有突变型idh1的患者的血浆中均检测到显著升高水平的2-羟基戊二酸。高水平的2-羟基戊二酸与过甲基化表型有关，导致分化受到阻碍，从而导致增加的肿瘤发生。特定的不可逆的共价抑制剂的活性是用其与靶标(idh1)的结合来定义的，用ki定义，共价键形成的最大潜在速率用kinact定义。这两个因素不是分离的要素，而是合作产生共价键形成的所需作用。这可以由以下3点来说明。首先，亲电体例如丙烯酰胺必须相对于亲核体例如半胱氨酸恰当定位这一事实在有机化学中是共价键形成的基本组成部分。存在亲核体必须接近亲电体以形成共价键的精确的角度和距离。在亲核体附近简单放置亲电体不足以形成共价键。第二，当在含有氢键原子的核心上合并入反应性基团以稳定抑制剂与酶例如定向核心(orientingcore)时，本领域技术人员必须考虑定向核心如何与靶标结合以及鉴于上述最佳角度和距离如何使亲电体相对于亲核体定位。此外，在亲核体附近简单放置亲电体不足以形成共价键。定向核心的变化可以影响抑制剂化合物形成共价键的能力。第三，当将上述两点一起考虑时，在定向核心上仅仅存在亲电体部分不足以表明将形成共价键。下面的体外和体内研究证明了所测试的式i化合物针对各种具体癌细胞系的突变型idh1蛋白抑制活性和功效。这些测定法是本领域技术人员普遍公认的，可预测对包含具有这些突变型idh1酶的癌细胞的增殖性瘤的人类临床治疗活性。证明突变型idh1抑制活性和功效的测定法可以基本上如下进行或者通过提供类似数据的类似测定法进行。下面的测定法的结果表明，例举并测试的化合物作为idh1突变型抑制剂是有用的，是共价抑制剂，可用于治疗表达突变型idh1的癌症。在下面的每种测定法中，在测试了具体给出的art化合物的情况下，制备了另外的art化合物，对其进行了测试并且得到了类似数据。idh1和idh2突变型酶的生物化学测定法idh1-r132h、idh1-r132c、idh2-r172k和idh2-r140q突变型酶催化αkg转化为2hg。使用在线固相提取和质谱分析2hg。使用与6460三重四极质谱仪(g6460aagilent)连接的仪器进行该分析。使包含n端his标签的idh1突变型(r132h和r132c)和idh2突变型(r140q和r172k)蛋白在大肠杆菌(e.coli)中表达，通过本领域技术人员常用的且公知的方法使用镍亲和色谱纯化。酶测定法在包含100mmtris-hcl缓冲剂、1mmdtt、0.005％tritontmx-100、120mmnacl的v底96孔聚丙烯板中进行。对于idh1r132h，包括终浓度分别为300μm、2.5μm和300μm的α-酮戊二酸、nadph和mncl2。对于idh1r132c，包括终浓度分别为100μm、10μm和100μm的α-酮戊二酸、nadph和mncl2。对于idh2r172k，包括终浓度分别为150μm、10μm和150μm的α-酮戊二酸、nadph和mncl2。对于idh2r140q，包括终浓度分别为3000μm、10μm和100μm的α-酮戊二酸、nadph和mncl2。最终ph值＝7.0。将溶于dmso储备液中的测试化合物在反应混合物中稀释，最终dmso浓度为4％。以剂量-响应方式测试化合物。通过加入酶使测试开始。酶以下列终浓度使用：idh1r132h，2nm；idh1r132c，0.5nm；idh2r172k，1.2nm；idh2r140q，1.2nm，使测定法持续进行以下时间：对于idh-1r132c，40分钟；对于idh-1hr132h，60分钟；对于idh-2172k和idh-2r140q酶，50分钟。通过加入含有d5-3hg的acn(50:50)淬灭反应，所述d5-3hg作为内标用于质谱分析和反应产物的定量。使用强阴离子交换柱色谱(phenomenexstrata-x-asecurityguard)分离被淬灭的样品中的2hg，利用6460三重四极质谱仪(g6460aagilent)通过质谱法进行分析。使用校正曲线(使用已知的2hg浓度形成)将检测的2hg信号转换成分析物浓度。对于所测试的每个化合物，使用dmso对照样品作为0％抑制、使用没有酶的对照作为100％抑制计算％抑制。使用4参数方程由不同化合物浓度下的各个％抑制值获得ic50值。使用activitybase(idbs)或screener(genedata)数据分析程序进行这些计算。该测定法的结果表明，对ihd1/r132h和idh1/r132c而言，例举且测试的化合物抑制突变型idh1活性。基本上如上文所述测试了下面的实施例，其表现出如下表22中所示的对突变型idh1的活性，相对于突变型idh2它们对突变型idh1是选择性的(未给出针对突变型idh2的数据)。表22平均值是±sem(sem是指平均值的标准误差)*art化合物,(4s)-3-(2-{[(1s)-1-{4-[(4-乙酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基}乙基]氨基}嘧啶-4-基)-4-(丙烷-2-基)-1,3-噁唑烷-2-酮，按照wo13/046136实施例编号556制备。本测定法的结果表明，与idh1r132h或r132c突变酶相比，表22中列出的实施例化合物在抑制idh1野生型酶方面活性较低。idh1(r132h)生物化学跳跃稀释(jumpdilution)测定法将冻干的实施例化合物用100％dmso重构至10mm或100mm并保持在室温下直至测试。通过本领域技术人员公知的和常用的方法表达和纯化idh1(r132h)-his蛋白。测定试剂包括以下：α-酮戊二酸(sigmacat#k1875)，mncl2-fisherscientificcat#m87-100,nadph-sigma-aldrichcat#n7505,tris-hcl(invitrogen,cat#15567-027),nacl(sigma,s3014),二硫苏糖醇(sigma,d5545)，和tritonx100(peirce,28314)。promega的nad(p)h-glotm试剂盒(g9061)。始终使用的测定缓冲液含有100mmtris-hclph7.0,120mmnacl，1mmdtt，0.005％tritonx-100和2％dmso(来自测试化合物的添加)。通过在测定缓冲液中温育在echo555上制备的化合物的剂量反应与1.5nmidh1(r132h)、1mmα-酮戊二酸、1mmmncl2和15μmnadh来测定每种化合物的ic50。将反应在室温下温育2小时，然后使用6-环丙基-5-(异喹啉-5-基)-2-[(3r)-4-(3-甲氧基丙酰基)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶-3-甲腈(10μm)终止反应。如供应商所规定的那样使用nad(p)h-glotm试剂盒测量nadph浓度。在envision(perkinelmer；0.1秒/luminescensemirror/lum700wl400-700过滤器)上读取发光信号。在随后的跳跃稀释实验中，将相当于10倍ic50的化合物浓度与100nmidh1(r132h)一起预温育。化合物的浓度总是大于或等于酶浓度。在室温下2小时后，将混合物以1:100稀释到含有α-酮戊二酸(10mm)、mncl2(10mm)和nadph(15μm)的溶液中。该最终酶反应含有1nmidh1(r132h)和0.1×[ic50]。在室温下温育2小时后，使用6-环丙基-5-(异喹啉-5-基)-2-[(3r)-4-(3-甲氧基丙酰基)-3-甲基哌嗪-1-基]吡啶-3-甲腈和nad(p)h-glotm试剂盒如上所述测量nadph浓度。包括三个对照：1)除了1mmα-酮戊二酸、1mmmncl2和15μmnadph之外在预温育和酶测定中含有10×ic50化合物的“10×对照”用于测定酶活性的最终测定，2)对于预温育和酶测定，含有dmso代替化合物的“max活性对照”，和3)含有dmso代替预温育中的化合物和酶测定中的0.1×ic50化合物的“0.1×对照”。包括“min活性对照”，其缺少酶，但在其它方面等同于“max活性对照”。使用1mmα-酮戊二酸、1mmmncl2和15μmnadph进行第二组max和min活性对照。每个测定条件一式三份地进行测试，max活性对照(10mm)和min活性对照(10mm)进行32次重复，而max活性对照(1mm)和min活性对照(1mm)进行16次重复。在每个实验/对照中产生的nadp(产物)浓度使用观察到的信号相对于含有15μmnadph的min活性对照的降低百分比来确定。将min活性对照(1mm和10mm)和max活性对照(1mm和10mm)平均并针对每种计算标准偏差。每次跳跃稀释和0.1×对照的信号乘以15然后除以min活性对照(10mm)孔的平均计数。从15中减去该数字以计算nadp(μm产品)。将相同的计算用于10×对照，但使用min活性对照(1mm)。通过将平均计数乘以15然后除以相应的min活性对照(1mm和10mm)来计算max活性对照(1mm和10mm)的产物的μmole数。将每孔的μmnadp除以平均max活性对照(1mm或10mm)，然后乘以100以确定化合物跳跃稀释10×对照和0.1×对照的％idh活性。对于10×对照，通过的化合物必须显示<30％的活性－表明预温育浓度足以用化合物使酶饱和。此外，对于0.1×对照，化合物必须显示>70-80％的活性，证实在0.1×/稀释的化合物浓度下没有抑制。基本上如文所述测试了下列实施例，对于idh1/r132h，其在本测定法中显示出下表23中所示的％回收率数据。与art化合物相反(art化合物在稀释后2小时不抑制酶)，下面所给出的实施例在稀释后2小时抑制酶，％回收率如下所示。表23*art化合物，(4s)-3-(2-{[(1s)-1-{4-[(4-乙酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基}乙基]氨基}嘧啶-4-基)-4-(丙烷-2-基)-1,3-噁唑烷-2-酮，按照wo13/046136实施例编号556制备。该数据表明，化合物以与突变体idh1的共价抑制一致的方式起作用，因为抑制剂的稀释不导致酶活性的恢复。野生型idh1和idh2酶的生物化学测定法idh1和idh2酶催化异柠檬酸转化为αkg。使含有n端his标签的野生型idh1(nationalcenterforbiotechnologyinformation,accession:np_001269316.1)和idh2(nationalcenterforbiotechnologyinformation,accession:eax02082.1)蛋白在大肠杆菌(e.coli)中表达，通过本领域技术人员常用的且公知的方法使用镍亲和色谱纯化。酶测定法在包含ph7.5的100mmtris-hcl缓冲剂、1mmdtt、0.005％tritontmx-100、120mmnacl的v底96孔聚丙烯板中进行。对于idh1野生型测定，包括浓度分别为85μm、50μm和20μm的异柠檬酸、nadp+和mncl2。对于idh2野生型测定，包括浓度分别为30μm、50μm和10μm的异柠檬酸、nadp+和mncl2。将溶于dmso储备液中的测试化合物在反应混合物中稀释，最终dmso浓度为4％。通过加入含有d(d6-αkg)的acn(50:50)终止(淬灭)反应，所述d(d6-αkg)作为内标用于质谱分析。将10微升反应混合物与100μl水、50μl1m在吡啶缓冲液中(8.6％吡啶，ph5)的o-苄基羟胺和50μl1m在吡啶缓冲液中的edc合并。在室温下衍生化1小时后，用etoac(600μl)提取样品。取出400μl上层，在加热的氮气下干燥，用meoh/水(1:1)(100μl)重构。将10μl衍生化的样品进样到由shimadzuprominence20ahplc系统和thermoquantumultratm三重四极质谱仪组成的lc-ms系统上。在watersxbridgetmc18柱(2.1×50mm,3.5μm)上分离分析物，流速0.6ml/分钟。流动相a是0.1％甲酸水溶液，流动相b是meoh。使用校正曲线(使用已知的αkg浓度形成)将检测的αkg信号转变成分析物浓度。对于所测试的每个化合物，使用dmso对照样品作为0％抑制、使用没有酶的对照作为100％抑制计算％抑制。使用4参数方程由不同化合物浓度下的各个％抑制值获得ic50值。使用activitybase(idbs)或screener(genedata)数据分析程序进行这些计算。基本上如上文针对idh1和idh2突变酶的生物化学测定法所述测试了表24中的下列实施例，与idh1r132h或r132c突变酶相比它们在抑制idh1野生型酶方面活性较低。表24实施例#idh1野生型ic50(μm)11.56±0.20,n＝223.15±0.07,n＝2315.5±0.5,n＝246.76±1.35,n＝252.46±0.30,n＝2112.2260.145平均值＝±sem(sem＝平均值的标准误差)idh1突变体抑制剂的基于细胞的测定法为了测试idh1突变体r132c的细胞抑制，使用纤维肉瘤细胞系ht1080(atcc)。为了测试基于细胞的r132h突变的抑制，用表达r132h突变酶的dna构建体稳定转染u87mg神经胶质瘤细胞系(atcc)，所述dna构建体是通过本领域技术人员公知的且常规使用的方法制备的。ht1080细胞测定法在用化合物处理前18-24小时，将15,000个细胞在聚-d-lys包被的96孔板(15,000个细胞/孔)中铺板。在化合物处理前4小时，通过除去正常培养基并用无谷氨酰胺培养基替换使细胞谷氨酰胺饥饿。饥饿后，然后用溶解在含有dmso的无谷氨酰胺培养基中的不同浓度的测试化合物(20μm至1nm)处理细胞，终浓度为0.2％。将初始化合物在37℃/5％co2下温育1小时。1小时后，加入谷氨酰胺至2mm终浓度，然后将处理过的细胞在37℃/5％co2下再温育18小时。温育18小时后，在细胞裂解物中分析细胞内2hg和αkg。在除去培养基并向细胞中加入含有25mmtris-hclph7.5,150mmnacl,1mmedta,1mmegta/1％triton-x100的缓冲液后，制备裂解物。将裂解物的等分试样加入到作为内标的d6-αkg和d5-3hg混合物中，在edc和吡啶存在下用o-苄基基胺处理该混合物。然后将分析物衍生物用etoac萃取，干燥，然后用50％meoh的h2o溶液重构。将如上所述制备的样品进样到hplc中，使用c18柱反相色谱法分离2hg和αkg衍生物(和相应的内标)。使用6460三重四极杆质谱仪(g6460aagilent)进行样品分析。使用在校正曲线内外推的2hg/d5-3hg比和αkg/d6-αkg比将检测的2hg和αkg信号转化为分析物浓度。在用化合物处理细胞期间将计算的2hg或αkg浓度标准化为在存在和不存在谷氨酰胺的情况下获得的最大和最小参考值后获得每个单独样品的抑制百分比。使用s形剂量响应4-参数方程从各％抑制获得ic50值。这些计算使用activitybase(idbs)或screener(genedata)数据分析程序自动进行。本测定法的结果表明，表25中测试的实施例抑制2-羟基戊二酸的产生，这表明在本测定法中细胞中突变体idh1r132c的抑制。由野生型idh1产生的代谢物αkg不受抑制剂的影响，这表明在本测定法中在细胞中性对于野生型idh1化合物对突变体idh1是选择性的。以下实施例的所得ic50值如表25所示。表25.平均值＝±sem(sem＝平均值的标准误差)*art化合物,(4s)-3-(2-{[(1s)-1-{4-[(4-乙酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基}乙基]氨基}嘧啶-4-基)-4-(丙烷-2-基)-1,3-噁唑烷-2-酮，按照wo13/046136实施例编号556制备。u87mg/idh1r132h细胞测定法在用化合物处理前18-24小时，将细胞在聚-d-lys包被的96孔板(12,000个细胞/孔)中铺板。在化合物处理前4小时，通过除去正常培养基并用无谷氨酰胺培养基替换使细胞谷氨酰胺饥饿。饥饿后，然后用溶解在含有dmso的无谷氨酰胺培养基中的不同浓度的测试化合物(20μm至1nm)处理细胞，终浓度为0.2％。将初始化合物在37℃/5％co2下温育1小时。1小时后，加入谷氨酰胺至2mm终浓度，然后将处理过的细胞在37℃/5％co2下再温育18小时。在除去培养基并向细胞中加入裂解缓冲液(25mmtris-hclph7.5,150mmnacl,1mmedta,1mmegta/1％triton-x100)后获得的细胞裂解物中分析细胞内2hg。将细胞裂解物在-80℃保存直至处理。对于分析物提取，将解冻的裂解物的等分试样转移至深96孔板中，用含有d5-3hg作为内标的冷meoh处理，然后用氯仿和h2o(1:4:3:2)处理。分离后收集上层相，进样到hplc中，使用与6460三重四极杆质谱仪中的ms/ms检测偶联的亲水相互作用(hilic)色谱法来分离2hg(和内标)。在用化合物处理细胞期间将计算的2hg或αkg浓度标准化为在存在和不存在谷氨酰胺的情况下获得的最大和最小参考值后获得每个单独样品的抑制百分比。使用s形剂量响应4-参数方程从各％抑制获得ic50值。这些计算使用activitybase(idbs)或screener(genedata)数据分析程序自动进行。基本上如上所述测试了下列实施例，它们在本测定法中对u87mg细胞中的突变体idh1/r132h显示出抑制活性，如下面的表26所示。表26平均值＝±sem(sem＝平均值的标准误差)*art化合物,(4s)-3-(2-{[(1s)-1-{4-[(4-乙酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基}乙基]氨基}嘧啶-4-基)-4-(丙烷-2-基)-1,3-噁唑烷-2-酮，按照wo13/046136实施例编号556制备。体内2-羟基戊二酸测定法对于idh1抑制剂的体内测试，在植入tb08-0537(tb08)细胞(携带r132h突变体idh1的继发性成胶质细胞瘤；杂合人；wo2013/086506)后，使皮下异种移植肿瘤在无胸腺裸鼠(20-22g，harlanlaboratories)中生长。在植入细胞之前，使小鼠自由进食和饮水并适应环境一周。将tb08作为肿瘤碎片直接植入右后侧腹。通过卡尺每周两次测量肿瘤体积，使用0.536×l×w2计算肿瘤体积，其中l＝长，w＝宽。当肿瘤体积达到150-400mm3时，将动物随机分组(每组n＝3-6只)并给予idh1抑制剂或溶媒对照。对于idh1抑制剂，将化合物配制在溶媒中，所述溶媒含有在25mm磷酸盐缓冲液ph2中的20％和1moleq1nhcl。将化合物浴超声处理以获得混悬液。化合物以mg/kg(mpk)为基础通过口服强饲法给药，最终体积为0.2ml。为了确定对2hg的抑制，化合物每日一次(qd)给药，给药6天(总剂数＝6)。最后一次给药后12小时，用异氟醚麻醉和颈椎脱臼对小鼠实施安乐死。溶媒对照小鼠接受相同的给药方案但不添加idh1抑制剂化合物。切除肿瘤，放入标记的管中，立即在液氮中冷冻。将肿瘤储存在-80℃以备进行处理。肿瘤裂解物的制备在分子级水中制备xylite缓冲液，其含有以下组分：25mmtris,ph7.5,150mmnacl,1％tritonx-100,1mmedta,1mmegta。向xylite(40ml)中加入800μlhalt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(halttm蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物，edta-freethermoscientific，cat#78441)。将样品涡旋，然后在冰上冷却。标记橙色盖帽裂解-a管，在架子上放置在冰上。将陶瓷研钵和杵放入干冰中冷却。将2×2平方英寸的铝箔放置在研钵底部。将肿瘤样品转移到箔正方形上的预冷却的研钵中。加入液氮(约5ml)并使其蒸发，从而过度冷冻肿瘤。将另一片箔置于肿瘤上，用陶瓷杵将肿瘤碎成小块。将压碎的肿瘤快速转移至裂解管中。将冰冷的xylite(500μl)添加到每个管中并盖上盖。然后在fastprep-24mpbiomedicals上通过在速度设定5下旋转两次35秒来处理肿瘤。然后将样品在beckmanmicrofuger中在4℃以14,000rpm离心30分钟。将上清液转移至预冷却的96孔深孔板中。弃去沉淀。蛋白质测定法通过将xy缓冲剂(145μl)加入到非无菌96孔圆底corning板中首先形成蛋白质测定稀释板。向其中加入肿瘤裂解物(5μl)，温和地混合。将板保持在冰上。如下设置bsa标准物(thermoscientificcat.23209,2mg/ml)的系列稀释：将五个0.5ml的管放置在架上，向每个管中加入xy缓冲液(60μl)。将储备液bsa(60μl)加入到第一个管中并涡旋。从第一个管中取出60μl转入下一个管中，涡旋，如此进行，直至稀释系列如下完成：管1＝储备液bsa，管2-5是1:2的系列稀释液，管6＝单独的xy缓冲液。按照生产商的说明书将thermobca蛋白质测定试剂混合。将混合的bca试剂(200μl)加入到每个样品中，温育15分钟。在softmaxpro板读数器上读出蛋白质测定结果。基于蛋白质测定结果，将适宜量的xy缓冲液加入到每个肿瘤裂解物中，以形成5mg/ml的最终蛋白质浓度。将所有样品贴标签并在-80℃下保存。肿瘤裂解物中的代谢物分析通过肿瘤异种移植的液相色谱-质谱(lc-ms)分析测定idh1抑制对于全部2hg和αkg的浓度的体内影响。在lc-ms分析之前，该方法使用o-苄基羟胺衍生化。将10微升每种肿瘤裂解物放入深孔96孔板中，与含有10μmd5-3hg和10μmd6-αkg的内标溶液混合。将50μl1m的在吡啶缓冲液(8.6％吡啶，ph5)中的o-苄基羟胺和50μl1m的在吡啶缓冲液中的edc加入到每个样品中。将衍生化反应在室温下进行1小时。使用beckmanbiomekfx液体处理器向每个样品中加入etoac(600μl)。将板密封，涡旋5分钟，然后将它们在4000rpm下在eppendorf5810r离心机上离心5分钟。将400μl上层转入新的96孔板中。将样品在加热的氮气下于50℃干燥，用100μl的meoh/水(1:1)重构。将1微升衍生化的样品进样到由shimadzuprominence20ahplc系统和thermoquantumultratm三重四极质谱仪组成的lc-ms系统上。将分析物在waterxbridgetmc18柱(2.1x50mm,3.5μm)上分离，流速：0.6ml/分钟。流动相a是0.1％甲酸的水溶液，流动相b是meoh。梯度分布是∶0分钟，5％b；3分钟，100％b；4.00分钟，100％b；4.1分钟，5％b；5.50分钟，停止。质谱仪使用hesi-ii探头，在阳离子选择的反应监控方式下运行。通过绘制分析物浓度相对于分析物/内标峰面积比的图建立校正曲线，利用用xcaliburtm软件加权的1/浓度进行数据的二次拟合。由校正曲线来反计算未知的分析物浓度。lcms测定法的代谢物数据用nmol/mg蛋白质表示。溶媒处理组的平均2hg水平用于测定0％抑制对照。然后相对于溶媒对照测定每个抑制剂处理的动物的％抑制。利用jmp软件分析数据，以确定每个剂量组的平均％抑制、标准偏差和标准误差。数据如所示的那样，其证明了表27中给出的实施例化合物在idh1突变体异种移植小鼠中的体内2hg抑制。表27在idh1r132h突变型异种移植物中在不同剂量的抑制剂下评价的2hg抑制。表27stddev是指标准偏差；stderr平均值是指平均值的标准误。*art化合物,(4s)-3-(2-{[(1s)-1-{4-[(4-乙酰基哌嗪-1-基)甲基]苯基}乙基]氨基}嘧啶-4-基)-4-(丙烷-2-基)-1,3-噁唑烷-2-酮，按照wo13/046136实施例编号556制备。当前第1页12