穿过血脑屏障的人源化抗体及其用途的制作方法
本申请要求于2017年7月6日提交的美国临时专利申请号62/358,777的利益，其内容通过引用结合在本文中。
发明领域
本发明涉及穿过血脑屏障的人源化抗体及其片段及其用途。更具体地，本发明涉及通过将现有抗体人源化衍生的抗体及其片段。本发明的抗体表现出与脑内皮抗原的结合得到增强和穿过血脑屏障得到改善。
发明背景
神经变性疾病，诸如阿尔茨海默病和帕金森病，由于目前尚没有对这些致残性病况的有效的治疗，日益成为我们老龄化社会的负担。由于大部分适当的治疗剂分子和诊断剂不能穿过紧密且高度限制性的血脑屏障(blood-brainbarrier，bbb)(abbott,2013)，因此，起源于脑的这些和其他疾病的治疗以及早期诊断仍然是具有挑战性的。bbb组成由内衬血管并且彼此通过紧密连接而联结的脑内皮细胞(brainendothelialcell，bec)形成的物理屏障(abbott,2013)。bec之间形成的紧密连接是bbb的完整性必需的，并且防止大于500道尔顿(da)的亲水分子的细胞旁转运。由于脑内皮细胞表现出非常低的胞饮率(abbott,2013)，因此较大分子的跨细胞转运局限于高度特异性的受体介导的胞吞转运(receptormediatedtranscytosis，rmt)途径和被动的基于电荷的吸附介导的胞吞转运作用(abbott，2013；pardridge，2002)。另外，高密度流出泵，如p-糖蛋白或多药耐药蛋白1(mdr-1)，有助于从脑去除不需要的物质(abbott，2013)。
尽管所有这些特征保护脑免受病原体和毒素，它们同样防止大部分治疗剂的进入。事实上，少于5％的小分子治疗剂和几乎没有较大的治疗剂能够以药理学相关的浓度(即，足以结合中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)靶标并引发药理学/治疗性反应)穿过bbb，除非它们被特异性‘摆渡’，即，偶联到转运分子上。由于缺少将分子转运穿过bbb的有效‘运载体’，许多针对神经变性疾病的药物由于不能以有效量递送到脑中而已经被从进一步的研发中‘搁置’或排除。
已经探索了将较大分子递送到脑中的不同方法。例如，可以破坏bbb的完整性，导致渗漏的bbb，其进而允许较大分子非限制性、细胞旁进入脑中。紧密连接能够通过各种方法成功地变松或破坏。例如，注射诱导到血流中的渗透休克的物质(例如，甘露醇、高渗溶液)引起细胞收缩并且导致紧密连接被破坏，因此严重地损害bbb(guillaume，2010)。紧密连接的其他调节剂包括烷基甘油、缓激肽及其几种类似物以及调节参与维持紧密连接的蛋白的表达的病毒(erdlenbruch等人，2003；preston等人，2008；gan等人，2013)。通过应用超声，更加局部化的bbb破坏是可能的(nhan等人，2013)。然而，bbb被破坏的期间足以改变脑内稳态并且允许有害的化学品、毒素和病原体进入脑；这能够导致严重的副作用，例如，癫痫发作和脑肿胀、感染和可能的永久性神经病变。因此，对于影响多个脑区的慢性和弥散性脑病使用这些技术进行重复治疗不可行。这些治疗中的大部分是昂贵的、必须住院，并且一些方法需要麻醉。
另一种绕过bbb的方法是将治疗分子直接注射到脑脊液(cerebrospinalfluid，csf)、实质空间或脑的其他部分。已经开发了一些递送方法，包括：通过输注或对流增强扩散(convection-enhanceddiffusion，ced)泵进行的大脑内(实质内)、脑室内和鞘内递送。然而，向脑内的任何类型的直接注射或大脑内植入物是侵入性的且花费高的过程，原因在于其需要住院、麻醉以及通常需要手术。此外，治疗剂(特别是大的生物制剂)在脑实质内的差的扩散速率限制治疗剂仅透到注射/植入位点周围的小区域。注射剂、导管和植入物的正确放置对于实现药物向脑的靶向区域的扩散是具有挑战性又至关重要的。另外，导管和植入物提供了感染的部位和/或针对外来物质的免疫应答。
在另一个增加穿过bbb的递送的尝试中，已对cns药物进行修饰以增加其脑摄入。此类修饰能够包括改变其表面电荷、减小分子尺寸和改变药物的亲脂性。然而，任意增加脑透过的修饰也很可能改变药物的整体药理学，包括其期望的活性和/或特异性。另外，亲脂性分子更倾向于透过p-糖蛋白流出泵被从脑中排出。
最后，已经开发利用了穿过bbb的内源性转运机制。允许大分子穿过bbb转运的生理机制能够分为高特异性受体介导的胞吞转运(rmt)和非特异性的基于电荷的吸附介导的胞吞途径。当特异性配体与其受体结合时，或当阳离子配体或药物与脑内皮细胞表面(腔侧)上的阴离子官能团静电相互作用时，分别引发胞吞作用。随之，新形成的内体被胞吞转运穿过细胞进入远腔侧，从而释放其货物。
由于吸附介导的胞吞转运作用是非特异性的、电荷介导的相互作用，其在所有血管床和器官中发生，这限制了药物对脑递送的可用性。因此，利用rmt途径仍然是唯一生理学的、非侵入性而高度受体特异性脑递送方法。
目前仅已知少量的受体在bbb处进行rmt并且“摆渡”穿过其天然配体：充分研究过的运铁蛋白受体(transferrinreceptor，tfr)、胰岛素受体(insulinreceptor，ir)、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和2(low-densitylipoproteinreceptorrelatedprotein1and2，lrp-1和-2)和白喉毒素受体。已经开发了结合这些受体的肽、天然配体和抗体或抗体片段(pardridge等人，1991；yu等人，2011；muruganandam等人，2001；abulrob等人，2005；demeule，2008；sumbria等人，2013)，它们作用为利用内源性rmt途径的药物-到-脑的转运体。最近，已经证明针对cd98hc(大的中性氨基酸转运蛋白的成分)的抗体进行穿过bbb的胞吞转运作用(zuchero等人，2016)，这表明这种转运蛋白可能是用于开发bbb运载体的另一个靶标。然而，迄今为止，在ii期临床研究中仅已经分析了单种肽(angiopepang1005，靶向lrp-1)，而其他的候选物正在实验室环境中或刚进入1期研究进行研究。rmt途径似乎是将生物药物转运到脑中的最有希望的途径，但是目前的方法具有局限性，包括靶标受体在bbb的非选择性表达，在运载体与受体的天然配体之间的竞争，无效的受体胞吞转运作用，以及被胞吞的运载体的溶酶体降解(xiao和gun，2013)。
不破坏bbb的生理学和稳态的高容量和高选择性bbb运载体的缺乏延缓了用于起源于脑的疾病(包括脑瘤和神经变性疾病)的新治疗剂和诊断剂的开发。
发明概述
本发明涉及穿过血脑屏障的抗体及其片段以及它们的用途。更具体地，本发明涉及通过将已有的抗体人源化衍生的抗体及其片段，本发明的抗体表现出增强的与脑内皮抗原的结合和穿过血脑屏障得到改善。
本发明提供包含下述序列的分离的或纯化的抗体或其片段：
x1vqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwx2rqapgkx3x4ex5vsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntx6ylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:9)，其中x1＝d或e，x2＝f或v，x3＝e或g，x4＝r或l，x5＝f或w，x6＝l或v。
例如，本发明分离的或纯化的抗体或其片段可以选自下述的任一种：
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwvrqapgkglewvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:2，本文中称作fc5-h1)；
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwvrqapgkglewvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:3，本文中还称作fc5-h2)；
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkglefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:4，本文中还称作fc5-h3)；
dvqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkglefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:5，本文中还称作fc5-h4)；
dvqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkgrefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:6，本文中还称作fc5-h5)；
dvqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkerefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:7，本文中还称作fc5-h6)；和
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkerefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:8，本文中还称作fc5-h7)。
在本文所述的本发明中，使用任意适当的多聚化技术，所述分离的或纯化的抗体或其片段可以为多价展示形式。例如，所述分离的或纯化的抗体或其片段可以连接到fc片段上，由此形成二聚体。在该实施方案中，fc片段可以是任意合适的fc片段，例如，来自小鼠igg2b或来自人igg1的fc。在具体实例中，fc可以包含seqidno:20的序列。
本发明分离的或纯化的抗体或其片段可以穿过血脑屏障。
本发明还包括编码本文所述的分离的或纯化的抗体或其片段的核酸分子。包含编码所述分离的或纯化的抗体或其片段的核酸的载体也包括在本发明的范围内。
本发明的分离的或纯化的抗体或其片段可以被固定在表面上，
在另一应用中，上述分离的或纯化的抗体或其片段可以连接到货物分子上。可以使用任何适宜的货物分子。货物分子可以具有约1kda至约200kda范围内的分子量。例如并且不希望受到限制，货物分子可以是可检测试剂、治疗剂、药物、肽、生长因子、细胞因子、受体陷阱、化学化合物、碳水化合物部分、酶、抗体或其片段、基于dna的分子、病毒载体或细胞毒性剂；一种或多种负载可检测试剂、治疗剂、药物、肽、酶、抗体或其片段、基于dna的分子、病毒载体或细胞毒性剂的脂质体或纳米运载体；或一种或多种纳米颗粒、纳米线、纳米管或量子点。在此类构建体中，所述分离的或纯化的抗体或其片段运送货物分子穿过血脑屏障。
本发明还包括包含一种或多于一种上述分离的或纯化的抗体或其片段和药学上可接受的运载体、稀释剂或赋型剂的组合物。
目前，描述了穿过血脑屏障的抗体fc5的人源化变体。抗体的人源化目的在于减少由于vhh内骆驼科动物来源的氨基酸残基在人中引起的潜在的免疫原性。不仅fc5抗体的cdr序列被移植到人重链框架上，而且还将回复突变(回复突变为所选择的亲本骆驼科动物序列的氨基酸残基)引入到完全人源化的框架序列中。令人惊讶的是，通常发现与亲本骆驼科动物fc5相比人源化变体表现出改善的热稳定性，如通过解链温度(tm)值所反映的，其中一种变体(fc5-h3)与亲本fc5相比表现出突出的超过10℃的tm增加。此外，大多数人源化fc5构建体表现出针对sv-arbec表达的受体的亲和力得到改善，其中一种变体(fc5-h7)与亲本fc5相比表现出出乎意料的显著增加。重要的是，这种趋势进一步与由人源化变体相对于亲本骆驼科动物fc5提供的针对人脑内皮细胞(humanbrainendothelialcell，hbec)-d3的结合改善一致。最后，人源化变体表现出至少为亲本fc5抗体的水平的体外细胞穿透性能力，并且一些人源化变体的体外细胞穿透性能力增加至差不多165％。
附图简要说明
现在将参考附上的附图通过实例描述本发明的这些和其他特点，在所述附图中，其中：
图1是fc5vhh与它的人源化变体的序列比对。
图2显示对于fc5vhh及其人源化变体(标记为fc5-h1、fc5-h2、fc5-h3、fc5-h5、fc5-h6、fc5-h7)通过圆二色性(cd)确定的解链温度(tm)。将蛋白加热至90℃以上，并且在cd仪器中进行测量以确定解链曲线(黑色或实心圆)和tm。随后，将蛋白冷却至室温，再次加热并且通过cd分析(灰色曲线或方形)。这允许确定重新折叠的蛋白的分数。
图3显示通过使用mirrorball仪器确定的fc5vhh及其人源化变体与悬浮的大鼠脑内皮细胞(sv-arbec)或人微血管脑内皮细胞(hbec-d3)的结合曲线。对于每个测试变体，在mirrorball384孔测定板内制备血清稀释物，从而产生7点结合曲线。使用补充有draq5核染料(2um，cellsignaling)的荧光缀合物c-mycalexa488检测抗体(1600ng/ml，santacruzbiotechnology)来检测细胞结合的抗体。所有的板都在4℃孵育4小时。如下所述使用mirrorball高灵敏性微量板细胞术采集读数。
图4显示在fc5及其人源化变体(h1-h7)的体外bbb模型中的papp值。同时检测等摩尔量(1.25μm)的每种fc5变体和阴性对照(a20.1，结合艰难梭菌(clostridiumdifficile)毒素a的vhh)穿过大鼠体外bbb模型的能力。图4a显示transwell体外bbb模型。将来自成年大鼠的sv40永生化的脑内皮细胞(svarbec)在底室中在存在大鼠星形胶质细胞条件培养基的条件下和在顶室中在标准培养基中在插入物膜上以单层生长。在向bbb模型的腔侧共同加入等摩尔量的各种vhh后，在15、30和60分钟后，从底室取样品。然后通过质谱法(多反应监测-同种型标记的内标；mrm-ilis)定量这些样品中每种vhh的浓度。使用给定的式[qr/dt＝接收区室中相对时间累积的量；a＝细胞单层的面积；c0＝加药(dosing)溶液的初始浓度]计算的papp值用来确定分子穿过bbb的能力。结果为在5-6个transwell实验中获得的平均papp值。图4b显示fc5及其人源化变体h1-h7的papp值。与阴性对照a20.1vhh相比，所有的变体都表现出bbb穿过得到增强。与亲本fc5相比，fc5-h3和fc5-h5表现出统计学(p<0.05；student’st检验)更高的papp值。
图5显示fc5和fc5-h7的fc融合体在体外的结合和转移。图5a显示使用mirrorball仪器确定的fc5fc和fc5h7-fc与悬浮的大鼠脑内皮细胞(sv-arbec)的结合。对每种检测变体，在mirrorball384孔测定板中制备连续稀释液，以产生7点结合曲线。使用补充有draq5核染料(2um，cellsignaling)的荧光缀合物c-mycalexa488检测抗体(1600ng/ml，santacruzbiotechnology)来检测细胞结合的抗体。所有的板都在4℃孵育4小时。如下所述使用mirrorball高灵敏性微量板细胞术采集读数。图5b显示在体外bbb模型中在transwell中fc5fc和fc5h7-fc的papp值。实验如图4所述进行。
发明详述
本发明涉及穿过血脑屏障的抗体及其片段以及它们的用途。更具体地，本发明涉及通过将已有的抗体人源化衍生的抗体及其片段，本发明的抗体表现出增强的与脑内皮抗原的结合和穿过血脑屏障得到改善。
本发明提供包含下述序列的分离的或纯化的抗体或其片段：
x1vqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwx2rqapgkx3x4ex5vsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntx6ylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:9)，其中x1＝d或e，x2＝f或v，x3＝e或g，x4＝r或l，x5＝f或w，x6＝l或v。
本文所使用的术语“抗体”，在本领域中也称为“免疫球蛋白”(ig)，是指由成对的重链和轻链多肽链构成的蛋白；存在各种ig同种型，包括iga、igd、ige、igg和igm。当抗体正确折叠时，每条链折叠成许多由更多的线性多肽链连接的独特球形结构域。例如，免疫球蛋白轻链折叠成一个可变(vl)和一个恒定(cl)结构域，而重链折叠成一个可变(vh)和三个恒定(ch、ch2、ch3)结构域。重链和轻链可变结构域(vh和vl)的相互作用导致形成抗原结合区(fv)。每个结构域具有本领域技术人员所熟悉的充分确定的结构。
轻链和重链可变区负责结合靶抗原，并且因此能够在多种抗体之间显示出显著的序列多样性。恒定区显示出较少的序列多样性，并且负责多种天然蛋白的结合，从而引发重要的生化事件。抗体的可变区包含分子的抗原结合决定簇，并且因此决定抗体对其靶抗原的特异性。大部分序列变化存在于六个超变区中，其中每条可变重链(vh)和轻链(vl)各三个超变区；超变区组合形成抗原结合位点，并且有助于抗原决定簇的结合和识别。抗体针对其抗原的特异性和亲和性由超变区的结构以及它们的尺寸、形状和它们呈递给抗原的表面的化学性决定。存在各种方案鉴定具有超变性的区域，两个最常见的方案是kabat的方案与chothia和lesk的方案。kabat等人(1991)基于vh和vl结构域的抗原结合区的序列可变性定义“互补性决定区”(cdr)。chothia和lesk(1987)基于vh和vl结构域的结构环区的位置定义“超变环”(h或l)。这些个体方案定义邻近或重合的cdr和超变区，抗体领域的技术人员通常互换使用术语“cdr”和“超变环”，并且它们可以在本文中这样使用。cdr/环在本文中按照kabat方案鉴定。
本文引用的“抗体片段”可以包括本领域已知的任意适当的结合抗原的抗体片段。抗体片段可以是天然存在的抗体片段，或可以通过操作天然存在的抗体或通过使用重组方法得到。例如，抗体片段可以包括但不限于fv、单链fv(scfv；由肽接头连接的vl和vh组成的分子)、fab、f(ab’)2、单结构域抗体(sdab；由vl或vh构成的片段)以及这些中任一种的多价形式。诸如刚刚所述的那些的抗体片段可能需要接头序列、二硫键或其他类型的共价键来结合片段的不同部分；本领域技术人员熟悉不同类型的片段的需要和用于构建其的各种方法。
在非限制性的实例中，抗体片段可以是来源于天然存在的来源的sdab。骆驼科动物来源的重链抗体(hamers-casterman等人，1993)缺少轻链，因此其抗原结合位点由一个称作vhh的结构域组成。sdab也在鲨鱼中观察到，并且称作vnar(nuttall等人，2003)。可以基于人ig重链和轻链序列改造其他sdab(jespers等人，2004；to等人，2005)。
本文使用的术语“sdab”包括通过噬菌体展示或其他技术从任意来源的vh、vhh、vl或vnar储库直接分离的那些sdab，来源于前述sdab的sdab，重组产生的sdab，以及通过人源化、亲和力成熟、稳定、增溶、骆驼化(camelization)或其他抗体改造方法进一步修饰所述sdab产生的那些sdab。本发明还包括保留sdab的抗原结合功能和特异性的同源物、衍生物或片段。
sdab具有抗体分子的值得期望特性，诸如高的热稳定性、高的耐洗涤剂性、相对高的蛋白酶抗性(dumoulin等人，2002)和高产率(arbabi-ghahroudi等人，1997)；它们还能够通过从免疫文库分离(li等人，2009)或通过体外亲和力成熟(davies&riechmann，1996)而被改造具有非常高的亲和力。还可以对sdab进行进一步的修饰以增加稳定性，诸如引入非经典的二硫键(hussack等人，2011；kim等人，2012)。
本领域技术人员将充分了解单结构域抗体的结构(参见，例如，蛋白数据库(proteindatabank)中的3dwt，2p42)。sdab包含保留免疫球蛋白折叠的单免疫球蛋白结构域；最为显著的是，仅三个cdr/超变环即可形成抗原结合位点。然而，并且如本领域技术人员应该理解的，结合抗原并不需要所有cdr。例如并且不希望受到限制，cdr中的一个、两个或三个cdr可有助于本发明的sdab对抗原的结合和识别。sdab的cdr或可变结构域在本文称为cdr1、cdr2和cdr3。
本发明包括“人源化的”抗体片段。抗体或抗体片段的人源化包括将序列中的氨基酸用其在人共有序列中存在的人对应氨基酸替换，而不丧失抗原结合能力或特异性；该方法降低所述抗体或抗体片段在引入到人受试者中时的免疫原性。在cdr移植的方法中，本文定义的cdr中的一个或多于一个可被融合到或移植到人可变区(vh或vl)，到其他人抗体(iga、igd、ige、igg和igm)，到抗体片段框架区(fv、scfv、fab)，或到cdr能够移植到其上的相似尺寸和性质的蛋白(nicaise等人，2004)。在这样的情形中，所述一个或多于一个超变环的构象有可能得以保持，并且sdab对其靶标(即，脑内皮细胞)的亲和力和特异性有可能受到的影响最小。cdr移植在本领域中是已知的(例如，参见tsurushita等人，2005；jones等人，1986；tempest等人，1991；riechmann等人，1988；queen等人，1989；在gonzales等人，2005中综述–还参见其中引用的参考文献)，并且由此技术人员充分熟悉制备此类人源化抗体片段和使氨基酸位置人源化的方法。
本发明的抗体或其片段是wo2002/057445中所述的fc5抗体的人源化形式。fc5(seqidno:1)结合脑内皮细胞的表面，随后穿过血脑屏障(bbb)。还已表明fc5作用为运载体引领不同尺寸的分子穿过bbb(参见，例如，wo2011/127580)。介导fc5的穿过的抗原鉴定为跨膜结构域蛋白30a(tmem30a；wo2007/036021)，其富集在脑内皮细胞的表面上。
例如并且不希望以任何方式受到限制，上述分离的或纯化的抗体或其片段可以选自：
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwvrqapgkglewvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:2，本文中称作fc5-h1)；
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwvrqapgkglewvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:3，本文中还称作fc5-h2)；
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkglefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:4，本文中还称作fc5-h3)；
dvqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkglefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:5，本文中还称作fc5-h4)；
dvqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkgrefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:6，本文中还称作fc5-h5)；
dvqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkerefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntvylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:7，本文中还称作fc5-h6)；
evqlvesggglvqpggslrlscaasgfkithytmgwfrqapgkerefvsritwggdntfysnsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycaagststatplrvdywgqgtlvtvss(seqidno:8，本文中还称作fc5-h7)；和
与其基本相同的序列。
基本相同的序列可包含一个或多个保守氨基酸突变。本领域中已知对参比序列的一个或多个保守氨基酸突变可产生与所述参比序列相比在生理学、化学、物理-化学或功能特性方面没有实质变化的突变肽；在这样的情形中，所述参比和突变序列被认为是“基本相同的”多肽。保守氨基酸置换在本文中定义为用另一种具有相似化学特性(例如，尺寸、电荷或极性)的氨基酸残基置换一种氨基酸残基。对sdab的框架区进行这些保守氨基酸突变，同时保持fc5的cdr序列(seqidno:1至9的残基26-35、50-66、99-111)和抗体或片段的cdr的整体结构；由此保持所述抗体的特异性和结合。此外，还应该保持有助于sdab人源化的框架残基(seqidno:2-9的残基1、5、14、37、44、45、47、75、79、87、88、93、114和117)。
在非限制性的实例中，保守突变可以是氨基酸置换。此类保守氨基酸置换可以将碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸置换为同组中的另一种氨基酸。术语“碱性氨基酸”意指具有大于7的侧链pka值的亲水氨基酸，其在生理ph下通常带正电荷。碱性氨基酸包括精氨酸(arg或r)和赖氨酸(lys或k)。术语“中性氨基酸”(也称为“极性氨基酸”)意指具有在生理ph下不带电荷但是具有至少一个键(其中两个原子共有的电子对被所述原子中之一保持得更近)的侧链的亲水氨基酸，例如，组氨酸(his或h)。极性氨基酸包括丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)、半胱氨酸(cys或c)、酪氨酸(tyr或y)、天冬酰胺(asn或n)和谷氨酰胺(gln或q)。术语“疏水氨基酸”(还称为“非极性氨基酸”)旨在包括按照eisenberg标准化共有疏水性量表(1984)表现出大于零的疏水性的氨基酸。疏水氨基酸包括脯氨酸(pro或p)、异亮氨酸(ile或i)、苯丙氨酸(phe或f)、缬氨酸(val或v)、亮氨酸(leu或l)、色氨酸(trp或w)、甲硫氨酸(met或m)、丙氨酸(ala或a)和甘氨酸(gly或g)。“酸性氨基酸”是指具有小于7的侧链pk值的亲水氨基酸，其在生理ph下通常带负电荷。酸性氨基酸包括谷氨酸(glu或e)和天冬氨酸(asp或d)。
序列同一性用来评价两个序列的相似性；其通过在比对两个序列的残基位置之间最大对应性时计算相同的残基的百分数而确定。可以使用任意已知的方法来计算序列同一性；例如，计算机软件可用于计算序列同一性。不希望受到限制，能够通过诸如由瑞士生物信息研究所维持的ncbiblast2服务(并且在ca.expasy.org/tools/blast/找到)、blast-p、blast-n或fasta-n的软件或本领域已知的任意其他适当的软件计算序列同一性。
本发明基本相同的序列可以为至少90％相同；在另一个实例中，基本相同的序列可以在氨基酸水平上与本文所述的序列是至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％(或其间的任意百分数)相同。重要的是，基本相同的序列保留参比序列的活性和特异性。在非限制性实施方案中，序列同一性的差异可能是由于保守氨基酸突变导致。在非限制性实例中，本发明可以涉及包含与本文所述的抗体的序列至少95％、98％或99％相同的序列的抗体或其片段。
本发明的抗体或其片段还可以包含辅助重组抗体或其片段的表达、检测或纯化的额外的序列。可以使用本领域技术人员已知的任意此类序列或标签。例如并且不希望受到限制，抗体或其片段可以包含靶向序列或信号序列(例如但不限于ompa)、检测/纯化标签(例如但不限于c-myc、his5或his6)或它们的组合。在另一实例中，所述额外序列可以是生物素识别位点，如cronan等人在wo95/04069中或voges等人在wo/2004/076670中所述的位点。也如本领域技术人员已知的，接头序列可以与所述额外的序列或标签联合使用，或可以用作检测/纯化标签。
本发明的抗体或其片段还可以采用多价展示形式，本文中也称为多价呈现。多聚化可以通过本领域已知的任意适当方法实现。例如并且不希望以任何方式受到限制，可以使用自组装分子，如wo2003/046560中所述的那些，实现多聚化，其中通过表达包含本发明的抗体或其片段和ab5毒素家族b亚单位的五聚结构域(merritt&hol，1995)的融合蛋白而产生五抗体。多聚体还可以使用zhu等人(2010)所述的多聚化结构域而形成；该形式，在本文中称为“组合体(combody)”形式，是本发明的抗体或片段与导致多聚体分子的卷曲螺旋肽的融合体。多价展示的其他形式也包括在本发明中。例如并且不希望受到限制，抗体或其片段可以呈现为二聚体、三聚体或任意其他适当的寡聚体。这可以通过本领域已知的方法实现，例如，直接连接关联(nielson等人，2000)、c-jun/fos相互作用(dekruif&logtenberg，1996)、“旋钮入孔(knobintoholes)”相互作用(ridgway等人，1996)或使用不对称平台(vonkreudenstein等人，2014)。
本领域已知的另一种多聚化的方法是使用fc结构域使抗体或其片段二聚体化，所述fc结构域例如但不限于小鼠或人fc结构域。人fc结构域可以选自各种种类，包括但不限于igg、igm，或各种亚类，包括但不限于igg1、igg2等。以这种方法，fc基因与sdab基因一起被插入到载体中，从而产生sdab-fc融合蛋白(bell等人，2010；iqbal等人，2010)；重组表达融合蛋白，然后纯化。例如并且不希望以任何方式受到限制，多价展示形式可包括fc5-h7嵌合形式及其连接到fc结构域上的突变变体。此类抗体容易改造和制备，能够极大地延长sdab的血清半衰期，并且可以是极好的肿瘤成像剂(bell等人，2010)。
刚刚描述的多聚体复合物中的fc结构域可以是本领域已知的任意适当的fc片段。fc片段可以来自任意适当的来源；例如，fc可以是小鼠或人来源的。在具体的非限制性实例中，fc可以来自小鼠igg2b同种型或来自人igg1同种型(bell等人，2010；iqbal等人，2010)。在具体的非限制性实例中，刚刚描述的多聚化分离的或纯化的抗体或片段可以包含含有seqidno:20的序列的fc。
上述多聚体的每个亚单位可以包含相同的或不同的本发明的抗体或其片段，其可以具有相同的或不同的特异性。另外，需要时，多聚化结构域可以使用接头连接到所述抗体或抗体片段上；此类接头应该有足够的长度和适当的组成，从而提供两个分子的灵活连接，但是不应该妨碍抗体的抗原结合特性。
本文所述的抗体或其片段可以穿过血脑屏障。脑通过称为血脑屏障(bbb)的专门的内皮组织与身体的其余部分分隔开。bbb的内皮细胞通过紧密连接接合，并且有效防止多种治疗化合物进入脑。除了低速的囊泡转运之外，bbb的一个特定特征是在bbb的远腔(脑)侧存在酶屏障和atp依赖性转运蛋白的高水平表达，包括p-糖蛋白(gottesman等人，1993；watanabe，1995)，其主动转运各种分子从脑进入血流(samuels，1993)。只有小的(<500道尔顿)和疏水(pardridge，1995)分子能够更容易地穿过bbb。因此，上述抗体或其片段特异性结合表面受体、内化到脑内皮细胞中并且通过避开溶酶体降解进行胞吞转运作用穿过bbb的能力可用于神经学领域。
本发明还包括编码本文所述的分子的核酸序列。考虑遗传密码的简并性，许多核苷酸序列将具有编码所述多肽的作用，这是技术人员容易理解的。核酸序列可以进行密码子优化，用于在各种微生物体中表达。本发明还包括包含刚刚所述的核酸的载体。此外，本发明包括包含所述核酸和/或载体的细胞。
本发明进一步包括利用多种方法固定在表面上的分离的或纯化的抗体或其片段；例如并且不希望受到限制，抗体或片段可以通过his-标签偶联、生物素结合、共价结合、吸附等连接或偶联到表面上。本发明的抗体或其片段的固定可用于用于捕获、纯化或分离蛋白的各种应用。固体表面可以是任意适当的表面，例如但不限于微量滴定板的孔表面、表面等离子共振(spr)传感器芯片的通道、膜、珠子(诸如磁基珠子或琼脂糖基珠子或其他色谱树脂)、玻璃、塑料、不锈钢、膜或任意其他有用的表面，如纳米颗粒、纳米线和悬臂表面。
本发明还包括连接到货物分子上的上述抗体或其片段。所述货物分子可以是任意适当的分子，其通过所述抗体或其片段递送穿过bbb。所述货物分子可以具有约1kda至约200kda范围内的分子量；例如，货物分子可以具有约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200kda的分子量，或其间的任意分子量，或由任意两个提及的分子量限定的任意分子量范围。在具体的非限制性实例中，货物分子可具有1kda(例如但不限于小分子，如cy5.5)、1-10kda(例如但不限于肽，如甘丙肽，3kda)、约80kda(例如但不限于fc片段、酶、蛋白、抗体等)或约180kda(例如但不限于单克隆抗体)的分子量。
例如并且不希望受到任何方式的限制，货物分子可以是可检测试剂、治疗剂、药物、肽、酶、生长因子、细胞因子、受体陷阱、抗体或其片段(例如，igg、scfv、fab、vhh等)、化学化合物、碳水化合物部分、基于dna的分子(反义寡核苷酸、微小rna、sirna、质粒)、细胞毒性剂、病毒载体(腺病毒载体、慢病毒载体、反转录病毒载体)、负载由前述类型的货物分子中的任一种的一种或多种脂质体、或一种或多种纳米颗粒、纳米线、纳米管或量子点。上述货物分子可以是可检测试剂，例如，fc5抗体变体或其片段可以连接到放射性同位素、顺磁标记物、荧光团、荧光剂、近红外(nir；例如cy5.5)荧色物或染料、回声微泡体、亲和标记物、基于可检测的蛋白的分子、核苷酸、量子点、纳米颗粒、纳米线或纳米管或可以通过成像方法检测的任意其他适当的试剂上。所述抗体或其片段可以使用本领域已知的任何方法(重组技术、化学缀合等)连接到货物分子上。
本文所述的货物分子可以通过本领域已知的任意适当方法连接(本文也称为“缀合”)到抗体或其片段上。例如并且不希望受到限制，货物分子可以通过共价键或离子相互作用连接到肽上。连接可以通过化学交联反应或通过使用与任意肽表达系统(如基于细菌、酵母或哺乳动物细胞的系统)组合的重组dna技术的融合而实现。当将货物分子缀合到抗体或其片段上时，可以使用适当的接头。用于连接抗体或其片段与货物分子(如治疗剂或可检测试剂)的方法是本领域技术人员公知的。
在一个非限制性实例中，货物分子可以是可检测的标记物、放射性同位素、顺磁标记物(如钆或氧化铁)、荧光团、近红外(nir)荧色物或染料、回声微泡体、亲和标记物(例如生物素、抗生物素蛋白等)、酶或可以通过诊断成像方法检测的任意其他适当的试剂。在具体的非限制性实例中，抗igf1r-5或其片段可以连接到近红外荧光(nirf)成像染料上，所述成像染料例如并且不希望受到限制，cy5.5、alexa680、dylight680或dylight800。
上述方法中的体内检测步骤可以是用于诊断目的的全身成像或在特定部位的局部成像，诸如但不限于脑血管或脑瘤血管，以定量方式的局部成像，从而评估疾病进展或宿主对治疗方案的响应。上述方法的检测步骤可以是免疫组织化学或非侵入性(分子)诊断成像技术，其包括但不限于：
·光学成像；
·正电子发射计算机断层扫描术(pet)，其中所述可检测试剂是同位素，如11c、13n、15o、18f、64cu、62cu、124i、76br、82rb和68ga，其中18f是临床上最常使用的；
·单光子发射计算机断层扫描术(spect)，其中所述可检测试剂是放射性示踪剂，如99mtc、111in、123i、201tl、133xe，这取决于具体应用；
·磁共振成像(mri)，其中所述可检测试剂可以是，例如并且不限于钆、氧化铁纳米颗粒和碳包被的铁-钴纳米颗粒，由此增加mri检测斑块的灵敏性；
·对比增强的超声造影术(ceus)或超声，其中可检测试剂是至少一种有声学活性的并且充满气体的微泡体。超声是广泛用于人疾病筛查和早期检测的技术。其费用比mri或闪烁法低，并且由于不涉及射线而比分子成像方式(如放射性核素成像)安全。
本发明进一步提供将目的分子转运穿过血脑屏障的方法。所述方法包括向受试者施用连接到本文所述的抗体或其片段上的所述分子。分子可以是任意需要的分子，包括如之前所述的货物分子；分子可以使用任意适当的方法“连接”到抗体或其片段上，所述方法包括但不限于缀合或以融合蛋白的形式表达。施用可以通过任意适当的方法进行，例如，肠胃外施用包括但不限于静脉内(iv)、皮下(sc)和肌内(im)施用。以该方法，本发明的抗体或其片段将目的分子“摆渡”穿过bbb到其脑靶标。
本发明还包括包含一种或多于一种本文所述的分离的或纯化的抗体或其片段的组合物。所述组合物可以包含上文所述的单个抗体或片段，或可以是多种抗体或片段的混合物。此外，在包含本发明的多种抗体或片段的混合物的组合物中，所述多种抗体可以具有相同的特异性，或可以在其特异性方面不同；
所述组合物还可以包含药用稀释剂、赋型剂或运载体。稀释剂、赋型剂或运载体可以是本领域已知的任意适当的稀释剂、赋型剂或运载体，并且必须与组合物中的其他成分和递送所述组合物的方法相容，并且不对组合物的接受者有害。所述组合物可以任何适当的形式存在；例如，所述组合物可以混悬形式、粉末形式(例如但不限于冻干的或包封的)、胶囊或片剂形式提供。例如并且不希望受到限制，当组合物以混悬形式提供时，运载体可以包括水、盐水、适当的缓冲剂、或提高溶解度和/或稳定性的添加剂；重构以产生混悬液在适当ph的缓冲液中进行，以确保抗体或其片段的活力。干粉剂也可以包括提高稳定性的添加剂和/或增加容积/体积的运载体；例如并且不希望受到限制，干粉剂组合物可以包含蔗糖或海藻糖。在具体的非限制性实例中，组合物可以被这样配制，以将抗体或其片段递送到受试者的胃肠道。因此，组合物可以包含抗体或其片段的包封、定时释放或其他适当的递送技术。制备包含所述化合物的适当组合物在本领域技术人员的能力之内。
在下述实施例中将进一步举例说明本发明。然而，应该理解这些实施例仅用于举例说明目的，不应该以任何方式用于限制本发明的范围。
实施例1：fc5的人源化
为了避免在人中潜在的免疫原性，通过将vhh中的“骆驼科动物”残基突变而将美洲驼来源的fc5(seqidno:1)人源化。应该注意，为了人源化的目的，kabat编号(kabat等人，1991)用于鉴定cdr残基。
骆驼科动物vhh的3d结构建模。针对蛋白数据库(pdb)使用blast检索鉴定与fc5vhh相似的模板结构。利用基于作为模板的2x1o|a(pdb码|链id)结构同源性建模，近似得到fc5vhh的3d结构。然后通过将模板结构突变成fc5序列而建立fc5vhh结构；这包括在各个位置的32个突变(cdr中26个，框架区中6个)。然后通过使用amber力场的能量最小化和约束的逐步释放(从最先放松的cdr环到仅在最后阶段完全放松的框架区主链重原子)精化fc5vhh模型。然后通过monte-carlo-最小化(mcm)构象取样精化vhh模型的cdr-h3环，其中对cdr-h3区的二面角取样，然后能量最小化。
为骆驼科动物cdr选择人重链框架。通过针对人种系数据库(vbase)、针对其他序列数据库(genbank和swissprot)和针对人框架共有序列的标准序列同源性比较选择人重链框架。进行blast检索以得到仅在框架区(即，排除cdr)具有最高同源性同时匹配cdr长度的序列匹配。为fc5vhh鉴定的最接近的人框架对应于人vh-3亚组。除了人vh-3共有序列之外，还保留了最类似于fc5vhh的一些人种系vh-3框架序列。fc5vhh框架序列需要16个突变，从而达到用于100％框架人源化的共有人vh-3序列。
鉴定用于回复突变的框架残基。表征fc5vhh模型及其完全人源化的对应物，从而估测人性指数、抗原接触倾向性指数，以描述cdr、经典残基、不常见的框架残基、潜在的糖基化位点、包埋的残基、vernier区残基和对cdr的接近。分析这些数据表明抗igf1rvhh的几种人源化变体的设计，每种变体具有在各同位置的变化数目的回到亲本骆驼科动物残基的回复突变。总共为fc5vhh设计7种人源化的变体(fc5-h1、fc5-h2、fc5-h3、fc5-h4、fc5-h5、fc5-h6、fc5-h7)，其中变体包含多至7个回复突变(图1)。这些骆驼科动物回复突变残基中的一些被包埋在vhh结构域核心内部，并且因此预测其不诱导b细胞介导的免疫应答。
实施例2：fc5及其人源化变体的克隆、表达和纯化
将实施例1所述的fc5单结构域抗体(sdab)或其人源化变体(fc5-h1、fc5-h2、fc5-h3、fc5-h4、fc5-h5、fc5-h6、fc5-h7)克隆、转化、表达并以制剂形式纯化，用于体外测试。所有变体都以具有his5和c-myc标签的融合体表达，以分别允许通过使用hitrapchelatingtm柱的固定的金属亲和色谱纯化和通过免疫化学检测。
简言之，将编码sdabfc5(seqidno:1)或人源化变体的dna克隆到质粒psjf2h的bbsi/bamhi位点，以产生fc5的表达载体(muruganandam等人，2001)。通过使用引物fdtgiii，5’-gtgaaaaaattattattattcgcaattcct-3’(seqidno:10)和96giii，5’-ccctcatagttagcgtaacg-3’(seqidno:11)在373adnasequencerstretch(peappliedbiosystems)上进行核苷测序而确认dna构建体。
将构建体转化到大肠杆菌(e.coli)tg1菌株中，并且用单克隆接种100ml包含100μg/ml氨苄青霉素的m9培养基，将培养物在37℃以200rpm摇动过夜。将生长的细胞(25ml)转移到1l补充有5μg/ml维生素b1、0.4％酪蛋白氨基酸和100μg/ml氨苄青霉素的m9培养基(0.2％葡萄糖、0.6％na2hpo40.3％kh2po4、0.1％nh4cl、0.05％nacl、1mmmgcl2、0.1mmcacl2)中。将细胞培养物在室温以200rpm摇动24小时，然后补充100ml含有12％胰蛋白胨、24％酵母提取物和4％甘油的10x诱导培养基terrificbroth。通过加入异丙基-μ-d-硫代半乳糖吡喃苷(iptg；1mm)诱导蛋白表达。诱导后，将培养物在25℃再摇动72小时，并通过渗透休克法提取周质级分。
fc5及其人源化变体通过使用hitrapchelatingtm柱(amershampharmaciabiotech；piscataway，nj)的固定的金属亲和色谱纯化。以具有10-500mm咪唑梯度的10mmhepes缓冲液、500mmnacl、ph7.0洗脱结合的fc5或变体，并且将峰级分针对10mmhepes缓冲液、150mmnacl、3.4mmedta、ph7.4彻底透析。还确定了蛋白浓度。
实施例3：人源化fc5变体的生物物理表征
使用解链温度分析表征实施例2中制备的fc5vhh和人源化变体。
解链温度：使用通过cd光谱学的解链温度(tm)检测评价fc5vhh和人源化变体的热稳定性。使用配有peltier热电型温控系统的jascoj-815分光偏振计(jasco，easton，md，usa)进行实验。使用径长为1mm的cd小杯。在180-260nm的波长范围以50nm/min的扫描速度、4s的数字积分时间(dit)、1nm的带宽、1nm的数据间距(datapitch)和1s的积分时间记录光谱。为了测量解链温度或tm(greenfield，2006)，在30℃至96℃的温度范围记录cd光谱。所有的cd光谱减去对应于缓冲液光谱的空白。以在100mm磷酸钠缓冲液(ph7.4)中的50μg/mlvhh进行测量。对于所有变体，在210nm处监测热诱导的蛋白变性。通过所述的式(greenfield，2006a；2006b)得到折叠分数(ff)：
ff＝([θ]t–[θ]u)/([θ]f–[θ]u)式i
其中[θ]t是在任意温度下的摩尔椭圆率，[θ]f是完全折叠的蛋白在30℃的摩尔椭圆率，[θ]u是未折叠的蛋白在90℃的摩尔椭圆率。通过使用绘图软件graphpadprism(用于windows的4.02版本)的非线性回归曲线拟合(玻尔兹曼s形方程)，得到作为未折叠曲线(折叠分数，ff，相对温度)的中点的解链温度(tm)。基于假设两态系统的椭圆率数据确定vhh的解链温度(tm)，所述两态系统与观察到的对应于到变性的急剧转变的变性曲线一致。tm值视为折叠分数(ff)相对温度的s形变性曲线的中点。
结果显示在图2中。与亲本骆驼科动物fc5(<65℃)相比，人源化变体fc5-h1、fc5-h3、fc5-h4、fc5-h5、fc5-h6和fc5-h7表现出tm值得到改善(>65℃)——这是令人惊讶的结果，原因在于，这不是设计变体的靶向目标。在人源化变体中，fc5-h7表现出最好的重折叠能力，而与fc5相比，fc5-h3表现出11℃的tm增加。
实施例4：fc5突变变体与脑内皮细胞的结合
为了评价人源化对抗体与其细胞抗原的结合的影响，测量fc5及其人源化变体与sv-arbec细胞或人微血管脑内皮细胞(hbec-d3)的结合。
激光设置:488和640激活的，6.0mw；
通道设置:fl-2(488-540nm)电压600，灵敏度4，tiff文件存储和fl-4(650-690nm)电压600，灵敏度4，触发器4，tiff文件存储；
目标特征:fl-2(峰强度，平均强度，总强度，和基线)和fl-4(峰强度，平均强度，总强度和基线)；
群定义:目标–细胞过滤器(fl-4周长范围0-500nm和fl-2平均强度范围0-15000)；
群统计学:目标:目标数目，目标:平均值(fl-2峰，平均值，总强度和周长)和目标:平均fl-2基线。目标:中值(fl-2峰，平均值，和总强度)目标:平均值(fl-4峰，平均值，总强度和周长)和目标:平均fl-4基线。目标:中值(fl-4峰，平均值，和总强度)细胞:目标数目，细胞:平均值(fl-2峰，平均值，和总强度)和细胞:平均fl-2基线。细胞:中值(fl-2峰，平均值，和总强度)细胞:平均值(fl-4峰，平均值，和总强度)和细胞:平均fl-4基线。细胞:中值(fl-4峰，平均值，和总强度)。
将剩余的活细胞物质在4℃邻近测定板孵育，以在2小时和20小时的时间点监测细胞活力。在sv-arbec和hbec-d3两种目的细胞系中针对fc5和所有人源化变体重复mirrorball测定程序。用cellista软件(ttplabtech)和graphpadprism6软件程序分析数据。
fc5和人源化变体与sv-arbec细胞和hbec-d3细胞结合的结果显示在图3中(一些结果未显示)。同该测定中fc5与sv-arbec或与hbec-d3细胞非常微弱的结合相比，人源化fc5变体fc5-h1、fc5-h3、fc5-h4、fc5-h5、fc5-h6和fc5-h7均表现出与sv-arbec细胞的结合得到改善；人源化变体fc5-h3、fc5-h2和fc5-h7也表现出与hbec-d3的结合得到改善。显著地，fc5-h7表现出与sv-arbec细胞的结合以及还与hbec-d3细胞的结合得到高度改善，这表明该变体针对其在这些细胞上的受体的亲和力得到显著改善。
实施例5：fc5和fc5人源化变体穿过体外血脑屏障模型的转运
为了评价实施例2的人源化fc5变体是否穿过血脑屏障，使用如下所述的体外测定法。
按所述(garberg等人，2005；haqqani等人，2012)，使用sv40-永生化的成年大鼠脑内皮细胞(sv-arbec)来产生体外血脑屏障(bbb)模型。将sv-arbec(80,000个细胞/膜)接种在1ml生长培养基中的0.1mg/ml大鼠尾i型胶原蛋白包被的组织培养插入物(孔径为1μm；表面积为0.9cm2，falcon)上。插入物组件的底室含有2ml以1:1(v/v)比例补充有永生化的新生大鼠星形胶质细胞条件培养基的生长培养基。
测试等摩尔量(5.6μm)的阳性(fc5)或阴性对照(a20.1，艰难梭菌毒素a结合vhh；)和实施例2的人源化变体穿过该大鼠体外bbb模型的能力。在将等摩尔量的sdab暴露于bbb的腔侧后，在15、30和60分钟后从远腔侧取样。然后，通过质谱法(多个反应监测–同种型标记的内标；mrm–ilis)定量每个样品的sdab含量，见下文。
mrm-ilis:方法均如haqqani等人(2012)所述。简言之，为了开发对vhh的srm(选择的反应监测，也称为多个反应监测，mrm)测定，首先使用数据依赖性采集通过纳米lc-ms/ms分析每种vhh，以鉴定所有可电离的肽。对于每种肽，选择3至5种最强的碎片离子。开发初始srm测定以在埃摩尔量的消化物(约100-300amol)中监测这些片段。认为在低量显示可重现的强度比例的碎片(即，与较高量相比，具有pearsonr2≥0.95)是稳定的，并且选择其用于最终的srm测定。为了进一步优化该测定，还包括每种肽的洗脱时间，小心不要选择具有接近的m/z(质荷比)和洗脱时间的肽。
细胞培养基中vhh典型的多路srm分析涉及掺加已知量的ilis(0.1-10nm)，然后将100-400ng培养的培养基蛋白(0.3-1μl)注射到纳米lc-ms系统中。在离子阱中(并且弃掉剩余的不相关的离子)在靶标的特定洗脱时间选择每种靶标肽离子的前体m/z，之后碰撞诱导解离(cid)破碎，并且仅选择离子阱中需要的碎片离子用于通过检测器监测。对于定量分析，将由ltq(thermofisher)生成的原始文件转换为标准质谱数据格式mzxml，并且使用称为q-mrm(quantitative-mrm；参见haqqani等人2012)的内部软件提取强度，所述软件为matchrx软件的改进版本。对于每种vhh，对其由在整个洗脱时间内碎片m/z为0.25da之内的组合强度组成的每种碎片离子生成提取离子色谱图。为了得到每种碎片的最终强度值，合计所有在0.5分钟预计保留时间内的强度。如果它的肽中至少一种的碎片表现出预测的强度比，即，与其对应的纯vhh的最终强度值相比，最终强度值表现出强pearson相关性r2≥0.95和p<0.05，则将vhh定义为在样品中是可检测的。
如以前所述(haqqani等人，2012；gergov等人，2003)，将包含vhh混合物的培养基样品还原、烷基化并用胰蛋白酶消化。将消化物(胰蛋白酶解的肽)用乙酸(终浓度为5％)酸化，并在偶联ltqxletd或ltqorbitrapetd质谱仪(thermofisher，waltham，ma)的反相纳米acquityuplc(waters，milford，ma)上分析。将需要的样品等分试样注射并上样到300μmi.d.×0.5mm3μmpepmapsc18阱(thermofisher)上，然后以400nl/min的流速用0％-20％乙腈(在0.1％甲酸中)1分钟、20％-46％16分钟和46％-95％1分钟的梯度洗脱到100μmi.d.×10cm1.7μmbeh130c18纳米lc柱(waters)上。将洗脱的肽通过电喷雾离子化(esi)电离到质谱仪上，使用cid将肽离子破碎，用于ms/ms和srm分析。使用氦气作为碰撞气体以35％的标准化碰撞能量和30ms的活化时间，进行cid。使用6x103的自动增益控制(agc)目标值和200ms的最大积聚时间，通过仪器调整到线性离子阱中的离子注射时间。
在多路测定中用于fc5及其人源化变体和对照vhha20.1的检测和定量的特定的肽显示在表1中。
表1.在fc5、fc5-ilis、a20.1和fc5人源化变体的纳米lc-srm检测中所用的肽。在所述的不同研究中，测定是多路的，以不同的组合用于同时监测同一种样品；(a)重标记的肽；srm测定对于每种肽的检测和定量界限在1.5-2.5ng/ml范围内。1ng/ml对应约60-70pm的vhh.a20.1如hussack等人，2011b所述。
确定表观通透系数：定量的值能够直接绘图或者能够使用图4a给出的式[qr/dt＝在接收区室中相对时间累积的量；a＝细胞单层的面积；c0＝加药溶液的初始浓度]确定papp(表观通透系数)值并绘图。papp值通常用于确定分子穿过bbb的能力。papp值是化合物穿过脑内皮单层的比通透性的量度。
结果显示在图4b和c中。给出的结果是从一些独立的实验获得的平均papp值。阴性对照a20.1抗体具有非常低的papp值，表明该vhh穿过bbb模型的非特异性转运或旁细胞转运是最低的。fc5vhh表现出约100x10-6cm/min的papp值，而其人源化变体fc5-h3的papp值高45％，并且人源化变体fc5-h5的papp值高28％。
每种人源化变体的特征的总结显示在表2中。与骆驼科动物fc5相比，变体fc5-h1、fc5-h3、fc5-h4、fc5-h5、fc5-h6和fc5-h7表现出更高的解链温度。与骆驼科动物fc5相比，变体fc5-h1、fc5-h3和fc5-h7表现出针对大鼠和人脑内皮细胞二者的结合得到改善。与骆驼科动物fc5相比，变体fc5-h3和fc5-h5表现出体外血脑屏障穿过得到显著改善。
表2.与亲本骆驼科动物fc5抗体相比，人源化fc5变体的解链温度(tm)、细胞结合(sv-arbec和hbec-d3)和体外bbb通透性(papp)值的总结。sv-arbec和hbec-d3结合以在1.3μm的抗体浓度的mmfi单位表示。n.d.–没有确定
实施例6：人源化fc5-fc构建体的表达和纯化
制备、表达并纯化包含融合到igg1的人抗体fc片段的n端的fc5或fc5-h7的构建体。
将fc5或fc5-h7cdna克隆到含有人fc片段的哺乳动物表达载体ptt5(durocher2002)中。通过混合都在f17培养基中制备的25ml含有187.5μgptt5-ir5mfc2b、56.25μgptt-aktdd(活化的蛋白激酶b突变体)、18.75μgptto-gfp(用于监测转染效率)和112.5μg鲑鱼睾丸dna(sigma-aldrich)的质粒dna溶液；和25ml含有1.125mgpeiprotm(polyplustransfection)的pei溶液来预形成所得载体的复合物(polyplex)。在添加到细胞培养物中之前，将混合物孵育10分钟。用50ml复合物转染450ml稳定表达截短的ebna1蛋白(cho-3e7)并在f17培养基(invitrogen)中生长的cho细胞的培养物。转染后二十四小时，给培养物供应12.5ml40％(w/v)胰蛋白胨n1(organotechnie)溶液和1.25ml200mm丙戊酸溶液。转染后8天收集培养物，并且通过离心澄清。将澄清的培养基通过0.22μm膜过滤，然后将其应用到填装了5ml蛋白-amabselectsure树脂(gehealthcare)的柱上。上样后，将柱用5体积ph7.1的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤，并用100mmph3.0的柠檬酸钠缓冲液洗脱抗体。合并包含洗脱的抗体的积分，并通过上样到在pbs中平衡的脱盐econo-pac柱(biorad)上进行缓冲液交换。然后将脱盐的抗体通过millexgp(millipore)过滤器设备(0.22μm)而进行无菌过滤，并等分。
实施例7：人源化fc5-fc构建体的表征
如实施例4所述，使用
为了评价实施例6的fc融合的fc5-h7穿过血脑屏障，使用实施例5所述的体外测定和定量方法。结果表明与fc5-fc相比fc5-h7-fc融合体具有相似的papp(图5b)，这表明，fc5h7相较于fc5的增加的亲和性不影响其以二价形式穿过bbb的能力。
本文所述的实施方案和实施例是举例说明性的，并不意欲限制所要求的本发明的范围。本发明人旨在由权利要求书包括前述实施方案的变化，包括备选方案、改进和等价物。此外，所讨论的特征的组合可能不是本发明的方案所必需的。
序列表
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本文中和整个申请中引用的所有专利、专利申请和公布都通过引用结合于此。
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<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>用于纳米-lc-srm的肽
<400>18
asnthrleutyrleuglnmetasnserleuarg
1510
<210>19
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>用于纳米-lc-srm的肽
<400>19
leusercysalaalaserglyphelys
15
<210>20
<211>232
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>igg1fc
<400>20
alagluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocyspro
151015
alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys
202530
prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval
354045
valvalaspvalserhisgluglyprogluvallyspheasntrphis
505560
valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu
65707580
glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis
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115120125
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