含有阴道内微生物的组合物的制作方法

本发明涉及通过利用阴道微生物筛选和使用用于预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖风险的生物标志物。

背景技术：

在全世界，四分之三的女性人口正在经历炎症性女性疾病的感染，包括细菌性阴道炎，其中50％据报道会复发。此外，超过60％的女性阴道炎是无症状感染，并且由于抗生素、压力和绝经后的激素变化，对阴道炎的易感性大大增加。

感染引起的阴道炎的原因分为三个主要原因：细菌性阴道病(bv)、念珠菌性阴道炎(cv)和阴道毛滴虫。细菌性阴道炎是近年来最常见的阴道炎，据报道，细菌性阴道炎患者的阴道分泌物包括阴道阿托波菌(atopobiumvaginae)、巨球菌属(megasphaeraspp.)，阴道加德纳菌(gardnerellavaginalis)、伊格尔兹氏菌(eggerthella)属、类梭菌属、二路普雷沃氏菌(prevotellabivia)、微小消化链球菌(peptostreptococcusmicros)，以及已发现的类似的，阴道加德纳菌(gardnerellavaginalis)是细菌性阴道炎的主要原因。

女性阴道微生物群受各种因素(诸如种族、年龄、怀孕/分娩/喂养、病原体感染、生活方式、免疫和代谢异常等)影响。特别是，在包括阴道炎的典型女性疾病的情况下，在正常阴道中的细菌微生物群的集落结构中观察到显著变化，并且已破坏的细菌平衡的恢复对于预防和治疗女性疾病是必不可少的。根据个体的遗传特征和种族，关键指标(诸如乳酸杆菌(lactobacillus)群类型(将成年女性正常微生物群落细分为五组)和健康阴道中阴道环境的酸度)也是不同的。

通过使用下一代测序方法分析微生物，可以鉴定所有微生物物种，包括非培养微生物。这种方法是使用在所有细菌保守的16s核糖体rna基因(16srrna)，以及高变区鉴定微生物物种，并鉴定微生物基因组多样性与疾病之间的关系。这些微生物测定已经从传统的培养可能性限制中解放了现有细菌和疾病之间的关系，并且在从整体的角度对它们进行重新评估的方面已经取得了很大的进步。特别是，它们证明了肠道微生物与肥胖之间的流行关系。

过去，人类微生物群系与健康之间的关系或机制的研究主要是针对肠道微生物进行的。据推测，女性阴道微生物群与女性生殖器健康直接相关，并且根据种族具有不同的微生物群。迄今为止，该疾病的研究和对人类微生物群系的遗传影响仅限于肠道微生物群系，但尚未报道女性阴道微生物群系。

技术实现要素：

【技术问题】

本发明涉及用于诊断、预防或治疗女性生殖器疾病的组合物，其包括选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组中至少一种阴道微生物的可检测试剂的试剂，以及通过利用至少一种阴道微生物预测或诊断女性生殖器疾病风险的试剂盒。

本发明涉及用于诊断、预防或治疗肥胖的组合物，其包括选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组的至少一种阴道微生物的可检测试剂的试剂，以及通过至少利用阴道微生物预测或诊断肥胖风险的试剂盒。

【技术方案】

为了实现该目的，本发明的发明人进行了广泛的研究，通过使用大规模测序分析来确定女性子宫颈中存在的微生物群，并检查与女性生殖器疾病或肥胖的关系，以便开发用于预防/治疗女性生殖器疾病或肥胖的组合物或试剂盒。

本发明的一个实施方案是用于预测或诊断女性生殖器疾病风险的组合物，含所述组合物的试剂盒，或检测阴道中微生物的方法，以提供关于预测或诊断女性生殖器疾病风险的信息。

本发明的一个实施方案是用于预测或诊断肥胖风险的组合物，包含所述组何物的试剂盒，或检测阴道中微生物的方法，以提供关于预测或诊断肥胖风险的信息。

根据本发明的组合物，它可以用作生物标志物，该生物标志物可以通过使用女性阴道中阴道微生物群系来用于预测、预防、诊断或治疗女性生殖器疾病或肥胖。

在下文中，将更详细地描述本发明。

本发明的一个实施方案涉及用于预测或诊断女性生殖器疾病风险的组合物，其包括选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组中至少一种阴道微生物的可检测试剂。

施用组合物的女性生殖器疾病可以是选自由阴道炎、绝经(menopause)、宫颈炎和宫颈癌组成的组中，更优选绝经和/或阴道炎中的至少一种。

本发明的一个实施方案涉及用于预测或诊断肥胖的组合物，其包括选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组中至少一种阴道微生物的可检测试剂。

肥胖是一种脂肪在体内过多的堆积状态和剩余的卡路里转化为脂肪并积聚在人体的皮下组织或腹膜中的现象。本发明的组合物涉及通过不使用肠道微生物而是使用分布在女性生殖器中的阴道微生物来预测或诊断肥胖风险。特别是，通过使用阴道微生物，可以以更高的灵敏度预测或诊断肥胖的风险。

本发明的组合物的特征在于，组合物的待检测靶标微生物是源自女性阴道的微生物，其中微生物属于普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)。因此，该组合物的特征在于它应用于从女性阴道收集的样品。

优选地，乳酸杆菌(lactobacillus)是阴道优势种，其分泌乳酸或无菌液体以保护女性生殖器官免受有害细菌的侵害。据报道，根据最近的研究，普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)是口腔和生殖器官中的常驻菌群，与阴道炎症反应直接相关。sneathiaspp.最初用纤毛菌属(leptotrichia)分类，但作为sneathiaspp.的菌株单独分离。据报道，sneathiaspp.与生殖器疾病(诸如流产、早产、羊膜炎和阴道炎)有关。加德纳菌属(gardnerellaspp.)只有一种阴道加德纳菌，最初被归类为阴道嗜血杆菌(haemophilusvaginalis)，后来被归类为阴道棒状杆菌(corynebacteriumvaginalis)，最后被归类为加德纳菌属(gardnerellaspp.)。加德纳菌属(gardnerellaspp.)具有革兰氏阴性或革兰氏阳性的特性，并且不仅在女性生殖器中而且在血液、尿液和咽中都被检测到。

特别地，普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.和加德纳菌属(gardnerellaspp.)与女性生殖器疾病或肥胖中阴道菌群中的优势种-乳酸杆菌(lactobacillus)呈负相关。

本文中，术语“诊断标志物或用于诊断的标志物”是指将女性生殖器疾病或肥胖状态与正常状态区分开的参考物质，并且包括与正常样品进行比较，在具有女性生殖器疾病或肥胖的患者样品中表现出活性增加或减少的各种有机生物分子。为了本发明的目的，本发明的诊断组合物是指普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)，其在患有女性生殖器疾病的患者和患有肥胖的患者的两个样品中以特别高的水平表达，并且是指sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)和加德纳菌属(gardnerellaspp.)的微生物或微生物群，它们与普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)呈正相关。

过去，人类微生物群系与健康之间的关系或机制的研究主要是针对肠道微生物进行的。女性阴道微生物群与女性生殖器健康直接相关，并且根据种族具有不同的微生物群，因此被认为具有较大的遗传影响。迄今为止，该疾病和对人类微生物群系的遗传影响的研究仅限于肠道微生物群系，但尚未报道女性阴道微生物群系。然而，本发明基于以下发现：源自阴道的微生物可用作样品，并因此可以预测或诊断女性生殖器疾病和肥胖。

优选地，可检测试剂是指可用于在样品中检测普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)的存在的物质，女性生殖器疾病或肥胖的诊断生物标志物。例如，可检测试剂可以是选自由下项组成的组中的至少一种：引物、探针、反义寡核苷酸、适体和抗体，其可以特异性地检测有机生物分子(诸如蛋白质、核酸、脂质、糖脂、糖蛋白或糖类(单糖、二糖、二糖或多糖)等)。

在本发明中，微生物的可检测试剂可以是抗体，并且可以使用基于抗原-抗体反应的免疫学方法检测微生物。分析方法包括western印迹、酶联免疫吸附(elisa)、放射免疫测定(ria)、放射免疫扩散、ouchterlony免疫扩散，火箭免疫测定、免疫沉淀测定，补体结合测定，荧光激活细胞分选仪(facs)，蛋白质芯片等，但是不限于此。

优选地，能够检测微生物的试剂是微生物特异性引物。术语“引物”是指能够形成与模板链互补的碱基对的引物，并作为复制模板的起始点的7至50个碱基的核苷酸序列。通常合成引物，但可以用天然存在的核苷酸序列。引物的序列不一定必须与模板的序列完全相同，但只要它可以与模板杂交就足够互补。可以将不改变引物基本性质的额外特征掺入引物中。额外特征的实例包括但不限于甲基化、加帽、用其衍生物取代一个或更多个核苷酸，以及核苷酸修饰。

优选地，用于本发明的引物可以是能够扩增属于普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)和加德纳菌属(gardnerellaspp.)的菌株的16srrna的引物。例如，引物可以是表1中所示的引物。

[表1]

16srrna是原核核糖体的30s亚基。大多数16srrna在rrna中是保守的，而一些区域表现出高序列多样性。特别地，同一物种之间几乎没有多样性，但不同物种间的差异很大，因此能比较16srrna序列以有效鉴定原核生物。

风险预测是确定受试者是否可能患上女性生殖器疾病或肥胖，并确定女性生殖器疾病或肥胖的风险。它们可以临床地用于通过延迟疾病的发作或防止其发展，或通过选择最合适的治疗方法来做出治疗决定。此外，术语“诊断”是指确认病理状况的存在或特征。出于本发明的目的，诊断可以意味着确认是否已经发生女性生殖器疾病或肥胖。

本发明的一个优选实施方案提供了一种组合物，其包括用于普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)的可检测试剂，并且通过包括具有高检测特异性的所有菌株，可以高灵敏度地检测女性生殖器疾病或肥胖。

作为本发明的另一个实例，包含本发明的微生物检测剂的组合物可以以用于预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖的风险的试剂盒的形式提供。本发明的试剂盒不仅包括用于检测微生物的检测剂(诸如引物、探针、反义寡核苷酸，适体和/或抗体)，还包括可以合适用于分析方法的一种或更多种其他组分、溶液或设备。

对女性生殖器疾病或肥胖风险的预测或诊断的组合物的描述可以应用于用于预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖的风险的试剂盒。

作为一个具体实例，包括对本发明的微生物特异的引物的试剂盒可以是含有用于进行扩增反应(诸如pcr等)的必需要素的试剂盒。例如，用于pcr的试剂盒可在试管或其他合适的容器中使用、反应缓冲液、脱氧核苷酸(dntp)、酶(诸如taq聚合酶逆转录酶)、dnase，rna酶抑制剂、depc-水，和灭菌水等。

该试剂盒可以应用于从受试者的阴道取出的样品。特别地，在阴道中采集的样品可以是从子宫颈取出的阴道分泌物或羊水样品。

该试剂盒包括用于收集样品的收集设备，例如用于收集阴道分泌物或羊水样品的收集装置。收集装置的实例包括选自由刷子、吸收垫、拭子、注射器、勺子和羊水收集器组成的组中至少一个收集设备，但不限于此。

该试剂盒可以进一步包括指示说明书以要求从阴道取出受试者的样品用于预测或诊断女性生殖疾病或肥胖的风险。

作为另一个实例，为了提供预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖风险所需的信息，本发明提供了一种检测选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组中至少一种阴道微生物的方法。

关于用于预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖的风险的组合物的说明书可以类似地适用于检测微生物的方法。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括(a)收集受试者阴道中的测试样品的步骤；(b)提取来自样品的基因组dna的步骤；使经提取的基因组dna与对特异性引物进行反应的步骤，该特异性引物针对选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组中的至少一种阴道微生物；以及(c)扩增反应产物的步骤。

在上述步骤(a)中，术语“受试者的测试样品”是指取自患有女性生殖器疾病或肥胖或者预期患有女性生殖器疾病或肥胖的受试者的样品，例如，受试者的组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液或尿液，或优选阴道或子宫颈。

在步骤(b)中从受试者的测试样品中提取基因组dna可以通过应用本领域已知的一般技术进行。在步骤(c)中，对至少一种微生物特异的引物选自由对选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组中至少一种阴道微生物特异的引物组成的组。

步骤(c)中扩增反应产物的方法可以使用本领域已知的常规扩增技术进行，例如，聚合酶链反应(pcr)、sybr实时pcr、逆转录聚合酶链式反应、多重pcr、降落pcr、pcr、巢式pcr、加强pcr、实时pcr、部分展示pcr、cdna末端快速扩增、反向pcr、vectoretpcr、交错式热不对称pcr、连接酶链反应、限制性链反应、使用靶标碱基序列的转录选择性复制，但是本发明不限于此。

在步骤(c)中，可以进一步执行将测试样品的扩增产物的量与正常对照样品的扩增产物的量进行比较的步骤(e)，并且可以确定受试者是否存在女性生殖器疾病或肥胖的发生或高风险。

优选地，当选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)和加德纳菌属(gardnerellaspp.)组成的组中至少一种阴道微生物的扩增产物比正常对照样品中的高时，可预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖的发生或风险。

此外，普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)和加德纳菌属(gardnerellaspp.)与在阴道微生物群中是有益的乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)呈负相关。

在一个优选的实施方案中，本发明提供筛选用于女性生殖器疾病或肥胖的治疗剂或预防剂的方法，包括用预防或治疗女性生殖器疾病或肥胖的候选物质进行处理；检测至少一种阴道微生物的变化，所述阴道微生物选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组；当选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)和加德纳菌属(gardnerellaspp.)组成的组中至少一种阴道微生物的检测量减少时，或者当乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)的检测量增加时，确定候选物质作为女性生殖器疾病或肥胖的治疗剂或预防剂。

关于组合物的描述可以同样地应用于筛选治疗剂的方法。

具体地，本发明可以应用于在存在或不存在用于预防或治疗女性生殖器疾病或肥胖症的候选物质的情况下，比较取自受试者阴道的测试样品中的选自由普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)组成的组的至少一种微生物群落的变化的方法，并且该方法可以应用于筛选用于女性生殖器疾病或肥胖的治疗剂或预防剂的方法。换句话说，在存在或不存在用于预防或治疗女性生殖器疾病或肥胖的候选物质的情况下，样品中普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)中的每种形成微生物簇的程度被测量和比较，并且当在候选物质存在下形成微生物簇的程度降低时，可以将候选物质开发为女性生殖器疾病或肥胖的治疗剂或预防剂。

候选物质包括各种低分子量化合物、高分子量化合物、核酸分子(例如dna、rna、pna等)、蛋白质、糖和脂质，它们可以是用于女性生殖器疾病或肥胖的治疗剂或预防剂，但不限于此。

【发明效果】

本发明能够提供普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)的阴道微生物作为预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖风险的新生物标志物。与用肠道微生物进行的常规研究相比，阴道微生物可以用作开发和控制用于预防或治疗阴道中的女性生殖器健康或肥胖的具有优异的灵敏度的新药物的靶标。通过使用具有高检测灵敏度的阴道微生物的组合，可以更有效地预测或诊断女性生殖器疾病或肥胖。

附图说明

图1显示了基于16srrna的分析，根据绝经前/绝经后、阴道炎(bv)、宫颈炎(cervicits)、宫颈癌(hpv)和肥胖(bmi≥30)的阴道菌群分布的变化。

图2显示了可以显著改变阴道中微生物群结构的临床指数的nmds图。

图3显示评估绝经前和绝经后阴道中、肥胖的阴道菌群多样性的结果。

图4显示了根据绝经状态的特定阴道细菌的变化。

图5显示了根据阴道炎感染的特定阴道细菌的变化。

图6显示了根据肥胖的特定阴道细菌的变化。

图7显示了根据雌激素的处理的特定阴道细菌的变化。

图8显示了根据宫颈癌的特定阴道细菌的变化。

图9显示使用sparcc软件确认绝经前阴道中阴道微生物群落的发生模式的结果。

图10显示使用sparcc软件确认绝经后阴道中阴道微生物群落的发生模式的结果。

图11显示了分析喂食正常饮食的大鼠和喂食高脂肪饮食的肥胖大鼠的阴道微生物群落的多样性的结果。

图12显示了根据饮食的阴道微生物群落的单变量分析结果。

图13显示用正常饮食喂养的大鼠的血脂多糖的变化，其通过施用从喂食高脂肪饮食的大鼠获得的阴道微生物群落。

具体实施方式

在下文中，用参考实施例详细描述本发明。然而，以下实施例说明了本发明，并且本发明不受以下实施例的限制。

实施例1、研究受试者和样品收集

对于本发明，用刷子从韩国吐温队列(tweencohorts)的542只雌性相同的吐温沙异卵双胞胎(tweenssandfraternaltwins)及其家族收集子宫颈内的样品，并以-80℃的冷冻状态储存。将冷冻保存的样品转移到实验室，并使用试剂盒提取基因组dna。

实施例2、使用16srrna分析阴道微生物群落

使用表1中所示的515f/806r引物(seqidno:1和2)扩增从实施例1中提取的基因组dna，靶向细菌的v4区，然后使用illumina的miseq仪器获得核苷酸序列数据。

[表2]

通过利用qiime管道，对核苷酸序列数据进行分析，以确定遗传信息和阴道微生物群落结构，并然后观察阴道微生物群落与各种女性健康标志物的关系。

通过基于16srrna的分析获得的阴道微生物群落信息证实了根据绝经状态、阴道炎、宫颈炎、宫颈癌和肥胖的阴道微生物群落的变化。结果显示在图1中。作为分析因子关联的结果，证实可以显著改变阴道囊泡结构的临床指标是绝经、阴道炎和肥胖(图2)。通过使用nmds图分析影响健康的指标与阴道菌群的相关性，可以显著改变阴道微生物群结构的临床指标是绝经后状态、阴道炎感染和肥胖(图2)。

此外，确认肥胖增加了阴道微生物群落的多样性(图3)。这表明肥胖诱发的有害阴道微生物可能对女性生殖器健康产生负面影响，因为考虑到有益细菌，乳酸杆菌(lactobacillus)是阴道菌群中的优势种。

实施例3、阴道微生物群落与女性生殖器疾病或肥胖的相关性的分析

使用可以控制混淆变量的maaslin软件的多变量分析的结果，明确了阴道细菌鉴定的女性生殖器疾病或肥胖等。

使用maaslin软件，将双胞胎和家庭关系分配为随机变量以及其他健康因素作为校准变量，并分析每个健康因素与阴道微生物群落之间的相关性。结果显示在图4到8中。

从图4、5和8中可以看出，发现普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)与女性生殖器疾病，尤其是绝经、阴道炎和宫颈癌的相关性最高。在肥胖的情况下，普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)的一种p.copri，被发现是肥胖的第二高相关性(图6)。

除了绝经后状态、阴道炎感染和肥胖在nmds图中显示出显著相关性外，雌激素治疗呈负相关(r相关系数＝-0.004，q值：0.18)(图7)且hpv感染呈正相关(r相关系数＝0.1，q值：0.16)。

实施例4、阴道微生物群落的网络分析

使用用于组成数据的稀疏关联(sparcc)软件进行网络分析，以确定女性生殖器或肥胖组和正常组中阴道微生物群落的出现模式。

结果，通过额外的网络分析观察到阴道微生物群落之间的相互关系。结果发现，普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)和乳酸杆菌属(lactobacillusspp.)在绝经前(图9)和绝经后中的相关性最高(图10)。

实施例5、确认女性阴道微生物群落与肥胖之间关系的动物实验

进行动物实验以研究肥胖与女性阴道微生物群落之间的关系。给6周龄c57bl/6j大鼠喂食高脂饮食12周，分析阴道微生物群落。

用高脂饮食喂养的肥胖大鼠的阴道微生物群落分析显示阴道微生物群落的多样性增加(图11)。具体地，根据饮食的阴道菌群的单变量分析显示被称为对人类阴道环境的有害群体的革兰氏阴性菌，普雷沃氏菌属(prevotellaspp.)、sneathiaspp.、巨球菌属(megasphaeraspp.)、加德纳菌属(gardnerellaspp.)已经显著增加(图12)。

此外，为了研究肥胖改变的阴道微生物群落对宿主的影响，获得了喂食高脂肪饮食的肥胖大鼠的阴道微生物群落，并且在用普通饮食喂养的正常大鼠的阴道中施用五次。从施用的正常大鼠获得血液，并测量构成革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖，结果如图13所示。结果，施用高脂肪饮食喂养的肥胖大鼠的阴道微生物群落的正常大鼠血液中的脂多糖显著增加。这表明由肥胖诱导的革兰氏阴性生物可能对整个身体产生有害影响。

<110>首尔大学校产学协力团

<120>含有阴道内微生物的组合物

<130>opp20170785kr

<160>2

<170>kopatentin1.71

<210>1

<211>60

<212>dna

<213>505f/806r正向引物

<400>1

aatgatacggcgaccaccgagatctacactatggtaattgtgtgccagcmgccgcggtaa60

60

<210>2

<211>56

<212>dna

<213>505f/806r反向引物

<400>2

caagcagaagacggcatacgagatagtcagtcagccggactachvgggtwtctaat56