可编程CAS9-重组酶融合蛋白及其用途的制作方法

根据35u.s.c.§119(e)，本申请要求2016年8月9日提交的美国临时专利申请u.s.s.n.62/372,755和2017年2月7日提交的美国临时专利申请u.s.s.n.62/456,048的优先权，其每一个通过引用并入本文。政府资助本发明是在国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的拨款号r01eb022376和r35gm118062下得到政府支持完成的。政府拥有本发明的某些权利。发明背景高效、可编程且位点特异性同源重组仍然是遗传学和基因组编辑的长期目标。将重组导向感兴趣的基因座的早期尝试依赖于用与靶基因座同源的长侧翼序列转染供体dna。这种策略受到非常低的效率阻碍，并因此需要严格的选择来识别整合体。最近的努力利用了双链dna断裂(dsb)诱导同源性定向修复(hdr)的能力。归巢内切核酸酶和后来的可编程内切核酸酶如锌指核酸酶、tale核酸酶、cas9和fcas9已用于引入靶定的dsb并在供体dna存在下诱导hdr。然而，在大多数有丝分裂后细胞中，dsb诱导的hdr强烈下调并且通常效率低。此外，通过易错修复途径(例如非同源末端连接(nhej)或单链退火(ssa))修复dsb以比hdr更高的频率导致dsb位点处的核苷酸的随机插入或缺失(插入/缺失)。若细胞经受迫使细胞周期同步的条件或者若nhej中涉及的酶得以抑制，则可以提高hdr的效率。但是，此类情况可导致许多随机且不可预测的事件，从而限制了潜在的应用。本公开提供了融合蛋白，其可以重组含有侧翼为引导rna指定序列的最小重组酶核心位点的dna位点，并且代表朝向不依赖于内源性细胞机制或细胞状态的在未修饰的细胞中的可编程无痕(scarless)基因组编辑的步骤。发明概述本公开描述了融合蛋白的开发，所述融合蛋白包含引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域、任选的接头和重组酶催化域(例如，丝氨酸重组酶催化域如gin重组酶催化域、酪氨酸重组酶催化域，或任何演化的重组酶催化域)。该融合蛋白在侧翼为两个引导rna指定的dna序列的最小gix核心重组酶位点(nnnnaaasswwsstttnnnn,seqidno:19)上起作用。由所述融合蛋白介导的重组依赖于这两个引导rna，导致不同引导核苷酸:融合蛋白复合物之间的正交性，并且在培养的人细胞中在与人基因组中发现的dna序列匹配的dna序列上有效地发挥功能。本公开的融合蛋白还可以直接在人细胞(例如，培养的人细胞)的基因组上起作用，催化位于相隔约14千碱基之间的两个reccas9假位点(psuedosite)之间的缺失、插入、倒位、易位或重组。这项工作提供了工程化的酶，其可以在未修饰的基因组中以用户定义的单碱基对分辨率催化基因插入、缺失、倒位或染色体易位。在一个方面，本发明提供融合蛋白，其包含：(i)引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域；(ii)任选的接头；和(iii)重组酶催化域，如任何丝氨酸重组酶催化域(包括但不限于gin、sin、tn3、hin、β、γδ或phic31重组酶催化域)、任何酪氨酸重组酶域(包括但不限于cre或flp重组酶催化域)，或任何演化的重组酶催化域。引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域可以选自下组：核酸酶无活性的cas9(dcas9)域、核酸酶无活性的cpf1域、核酸酶无活性的argonaute域，及其变体。在某些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域是核酸酶无活性的cas9(dcas9)域。在某些实施方案中，dcas9域的氨基酸序列包含对应于seqidno:1中的d10a和/或h840a突变的突变。在另一个实施方案中，dcas9域的氨基酸序列包含对应于seqidno:1中的d10a突变的突变和对应于seqidno:1中的h840a突变的突变。在另一个实施方案中，dcas9域的氨基酸序列进一步不包括seqidno:1中所示的n-末端甲硫氨酸。在某些实施方案中，dcas9域的氨基酸序列包含seqidno:712。在一个实施方案中，dcas9域的氨基酸序列与seqidno:712具有大于95％的序列一致性。在一个实施方案中，dcas9域的氨基酸序列与seqidno:712具有大于96、97、98、99％或更高的序列一致性。在一些实施方案中，重组酶催化域是丝氨酸重组酶催化域或酪氨酸重组酶催化域。在一个实施方案中，重组酶催化域的氨基酸序列是gin重组酶催化域。在一些实施方案中，gin重组酶催化域包含对应于选自下组的一个或多个突变的突变：seqidno:713中的h106y、i127l、i136r和/或g137f突变。在实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于选自下组的两个或更多个突变的突变：seqidno:713中的i127l、i136r和/或g137f突变。在实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于seqidno:713中的i127l、i136r和g137f突变的突变。在另一个实施方案中，gin重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在具体的实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含seqidno:713。在另一个实施方案中，重组酶催化域的氨基酸序列是hin重组酶、β重组酶、sin重组酶、tn3重组酶、γδ重组酶、cre重组酶；flp重组酶；或phic31重组酶催化域。在一个实施方案中，cre重组酶的氨基酸序列是截短的。在另一个实施方案中，酪氨酸重组酶催化域是cre重组酶的25kda羧基端域。在另一个实施方案中，cre重组酶以氨基酸r118、a127、e138或r154开始(每种情况下其之前都是甲硫氨酸)。在一个实施方案中，重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在某些实施方案中，重组酶催化域是经演化的重组酶催化域。在一些实施方案中，重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在一些实施方案中，接头(例如第一、第二或第三接头)可以具有约0埃至约81埃的长度。接头通常具有约33埃至约81埃的长度。接头可以是肽的、非肽的或这两种类型的接头的组合。在某些实施方案中，接头是肽接头。在某些实施方案中，肽接头包含xten接头sgsetpgtsesatpes(seqidno:7)、sgsetpgtsesa(seqidno:8)或sgsetpgtsesatpeggsggs(seqidno:9)，包含三肽ggs的一个或多个重复的氨基酸序列，或任何以下氨基酸序列：vpfllepdningktc(seqidno:10)、gsagsaagsgef(seqidno:11)、sivaqlsrpdpa(seqidno:12)、mkiieqlpsa(seqidno:13)、vrhklkrvgs(seqidno:14)、ghgtgstgsgss(seqidno:15)、msrpdpa(seqidno:16)或ggsm(seqidno:17)。在另一个实施方案中，肽接头包含三肽ggs的一个或多个重复。在一个实施方案中，肽接头包含三肽ggs的一至五个重复。在另一个实施方案中，肽接头包含三肽ggs的六至十个重复。在具体的实施方案中，肽接头包含三肽ggs的八个重复。在另一个实施方案中，肽接头长约18至约27个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头长24个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头具有氨基酸序列ggsggsggsggsggsggsggsggs(seqidno:183)。在某些实施方案中，接头是非肽接头。在某些实施方案中，非肽接头包含聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(poe)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。在某些实施方案中，烷基接头具有式—nh—(ch2)s—c(o)—，其中s是1-100之间的任何整数，包括端点。在某些实施方案中，s是1-20的任何整数，包括端点。在另一个实施方案中，融合蛋白进一步包含核定位信号(nls)域。在某些实施方案中，nls域经由一个或多个第二接头与引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域或重组酶催化域结合。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的第二接头序列]-[nls域]-cooh。在某些实施方案中，融合蛋白与seqidno:719中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在具体的实施方案中，融合蛋白包含seqidno:719中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，融合蛋白由seqidno:719中所示的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，融合蛋白进一步包含一个或多个亲和标签。在一个实施方案中，亲和标签选自下组：flag标签、多组氨酸(多his)标签、多精氨酸(多arg)标签、myc标签和ha标签。在实施方案中，亲和标签是flag标签。在具体的实施方案中，flag标签具有序列pkkkrkv(seqidno:702)。在另一个实施方案中，一个或多个亲和标签经由一个或多个第三接头与引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域、重组酶催化域或nls域结合。在某些实施方案中，第三接头是肽接头。本文描述的融合蛋白的元件可以不做限制以任何顺序。在一些实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh、nh2-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh或nh2-[二分叉(bifurcated)或环状置换(circularlypermuted)的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在一些实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[nls域]-cooh、nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[nls域]-cooh或nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-cooh。在某些实施方案中，融合蛋白与seqidno:185中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在具体的实施方案中，融合蛋白具有seqidno:185中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，融合蛋白的重组酶催化域与seqidno:185的氨基酸1-142中所示的氨基酸序列(其与seqidno:713中所示的序列相同)具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在某些实施方案中，dcas9域与seqidno:185的氨基酸167-1533中所示的氨基酸序列(其与seqidno:712中所示的序列相同)具有大于90％、95％或99％的序列一致性。在某些实施方案中，本公开的融合蛋白与seqidno:185的氨基酸1-1544中所示的氨基酸序列(其与seqidno:719中所示的序列相同)具有大于90％、95％或99％的序列一致性。在一个实施方案中，融合蛋白与引导rna(grna)结合。在一个方面，本公开提供了本文所述的融合蛋白的二聚体。在某些实施方案中，二聚体与靶dna分子结合。在某些实施方案中，二聚体的每个融合蛋白与靶dna分子的相同链结合。在某些实施方案中，二聚体的每个融合蛋白与靶dna分子的相对链结合。在某些实施方案中，二聚体的grna与靶dna分子的重组酶位点侧翼的grna结合位点杂交。在某些实施方案中，重组酶位点包含res、gix、hix、six、resh、loxp、ftr或att核心或相关核心序列。在某些实施方案中，重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。在进一步的实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离为3至7个碱基对。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离为5至6个碱基对。在某些实施方案中，第一二聚体与第二二聚体结合，从而形成融合蛋白的四聚体。在一个方面，本公开提供了本文所述的融合蛋白的四聚体。在某些实施方案中，四聚体与靶dna分子结合。在某些实施方案中，每个二聚体与dna的相对链结合。在其他实施方案中，每个二聚体与dna的相同链结合。在另一个方面，本公开提供了用于两个dna分子之间的位点特异性重组的方法，其包括：(a)使第一dna与第一融合蛋白接触，其中引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第一grna，所述第一grna与第一dna的第一区域杂交；(b)使第一dna与第二融合蛋白接触，其中第二融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第二grna，所述第二grna与第一dna的第二区域杂交；(c)使第二dna与第三融合蛋白接触，其中第三融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第三grna，所述第三grna与第二dna的第一区域杂交；和(d)使第二dna与第四融合蛋白接触，其中第四融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第四grna，所述第四grna与第二dna的第二区域杂交；其中在使得dna重组的条件下，步骤(a)-(d)中融合蛋白的结合导致融合蛋白的重组酶催化域的四聚化，并且其中第一、第二、第三和/或第四融合蛋白是本文所述的任何融合蛋白。在一个实施方案中，第一和第二dna分子具有不同的序列。在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)的grna与第一dna的相对链杂交，并且步骤(c)和(d)的grna与第二dna的相对链杂交。在另一个实施方案中，其中步骤(a)和(b)的grna；和/或步骤(c)和(d)的grna与它们各自的dna的区域杂交，所述区域相隔不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90或不超过100个碱基对。在某些实施方案中，步骤(a)和(b)的grna；和/或步骤(c)和(d)的grna在重组酶位点侧翼的grna结合位点处与它们各自的dna的区域杂交(参见例如图1d)。在某些实施方案中，重组酶位点包含res、gix、hix、six、resh、loxp、ftr或att核心或相关核心序列。在某些实施方案中，重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离为3至7个碱基对。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离为5至6个碱基对。本文提供的用于位点特异性重组的方法也可以与单一dna分子一起使用。在一个方面，本公开提供了用于单一dna分子的两个区域之间的位点特异性重组的方法，其包括：(a)使dna与第一融合蛋白接触，其中引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第一grna，所述第一grna与dna的第一区域杂交；(b)使dna与第二融合蛋白接触，其中第二融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第二grna，所述第二grna与dna的第二区域杂交；(c)使dna与第三融合蛋白接触，其中第三融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第三grna，所述第三grna与dna的第三区域杂交；和(d)使dna与第四融合蛋白接触，其中第四融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域结合第四grna，所述第四grna与dna的第四区域杂交；其中在使得dna重组的条件下，步骤(a)-(d)中融合蛋白的结合导致融合蛋白的重组酶催化域的四聚化，并且其中第一、第二、第三和/或第四融合蛋白是所述的任何融合蛋白。在某些实施方案中，重组的单一dna分子的两个区域具有不同的序列。在另一个实施方案中，重组导致dna分子的区域的缺失。在具体的实施方案中，缺失的dna分子的区域易于在减数分裂中发生交换事件。在一个实施方案中，步骤(a)-(d)的第一和第二grna与dna的相同链杂交，并且步骤(a)-(d)的第三和第四grna与dna的相对链杂交。在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)的grna与dna的区域杂交，所述区域相隔不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90或不超过100个碱基对，并且步骤(c)和(d)的grna与dna的区域杂交，所述区域相隔不超过10、不超过15、不超过20、不超过25、不超过30、不超过40、不超过50、不超过60、不超过70、不超过80、不超过90或不超过100个碱基对。在某些实施方案中，步骤(a)和(b)的grna；和/或步骤(c)和(d)的grna与重组酶位点侧翼的grna结合位点杂交。在某些实施方案中，重组酶位点包含res、gix、hix、six、resh、loxp、ftr或att核心或相关核心序列。在一个实施方案中，重组酶位点包含gix核心或gix相关核心序列。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离为3至7个碱基对。在某些实施方案中，gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离为5至6个碱基对。本文所述的dna可以在细胞中。在某些实施方案中，细胞是真核细胞。在某些实施方案中，细胞是植物细胞。在某些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞可以是人细胞。在某些实施方案中，细胞在受试者中。在一些实施方案中，受试者可以是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，细胞可以是植物细胞。在一个方面，本公开提供了编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸。在某些实施方案中，本公开提供了包含编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸的载体。在另一个方面，本公开提供了包含用于表达本文所公开的任何融合蛋白的遗传构建体的细胞。在一个方面，本公开提供了包含本文所公开的任何融合蛋白的试剂盒。在另一个方面，本公开提供了包含编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸的试剂盒。在另一个方面，本公开提供了包含用于重组蛋白表达的载体的试剂盒，其中所述载体包含编码本文所公开的任何融合蛋白的多核苷酸。在另一个方面，本公开提供了包含细胞的试剂盒，所述细胞包含用于表达本文所公开的任何融合蛋白的遗传构建体。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含一个或多个grna和/或用于表达一个或多个grna的载体。如下所述，在某些实施方案的详细描述中阐述了本发明的某些实施方案的细节。根据定义、实施例、附图和权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。附图简述图1a-1d。实验设置的概述。用(图1a)在hu6启动子的控制下的引导rna表达载体、(图1b)在cmv启动子的控制下的reccas9表达载体和(图1c)reccas9报告质粒转染细胞。这些组分的共转染导致在靶位点处重新组装引导rna编程的reccas9(图1d)。这将介导polya终止子的缺失，允许gfp的转录。引导rna表达载体和引导rna序列缩写为grna。图2a-2f。融合接头长度和靶位点间隔区变体的优化。在这些实验中使用单一靶引导rna表达载体phu6-nt1或非靶载体phu6-bc74。序列可以在表6-9中找到。(图2a)显示靶位点的一部分，其中引导rna靶位点为黑色带有虚线下划线并且gix核心序列位点为黑色。假gix位点的任一侧的5'和3'序列是相同的，但是是反向的，并且被phu6-nt1识别。将gix假位点与5'和3'结合位点分开的碱基对间隔区的数量分别由x和y表示。该图分别描绘了seqidno:700和703。(图2b)z表示将ginβ与dcas9连接的ggs重复的数量。当x＝y时，对于连接gin催化域和dcas9域的接头(图2c)(ggs)2(seqidno:182)、(图2d)(ggs)5(seqidno:701)和(图2e)(ggs)8(seqidno:183)，评估reccas9活性。(图2f)测定reccas9在由不均匀碱基对间隔区(x≠y)组成的靶位点上的活性；包括x＝y＝6用于比较。所有实验一式三份进行，并从这些实验中减去背景荧光。egfp阳性细胞的百分比仅是那些转染的细胞的(即，表达组成型表达的irfp基因)，并且每个实验记录至少6,000个活事件(liveevent)。引导rna表达载体和引导rna序列缩写为“grna”。值和误差条分别代表三个独立生物学重复的平均值和标准偏差。图3a-3b。正向和反向引导rna对reccas9活性的依赖性。(图3a)在pcdh15内发现的序列替换了图1a-1d中测试的靶位点。在假gix核心位点的5'和3'侧两者上，引导rna可以靶向两个偏移序列。该图分别描绘了seqidno:704-705。(图3b)reccas9活性通过与所有四个引导rna表达载体对和个别引导rna载体与脱靶(o.t.)引导rna载体共转染reccas9表达载体和报告质粒来测量。脱靶正向物和反向物含有分别靶向clta和vegf的引导rna序列。还显示了用报告质粒转染但未用靶引导rna转染的对照实验。还显示了与不同引导rna表达载体共转染但不与reccas9表达载体共转染的报告质粒的结果。所有实验一式四份进行，并且不从这些实验中减去背景荧光。egfp阳性细胞的百分比仅是那些转染的细胞的(即，表达组成型表达的irfp基因)，并且每个实验记录至少6,000个活事件。引导rna表达载体和引导rna序列缩写为grna。值和误差条分别代表四个独立生物学重复的平均值和标准偏差。图4a-4d。reccas9可以靶向与人基因组中的序列相同的多个序列。(图4a)图1a-1d中所示的靶位点被人基因组内发现的序列替换。有关序列参见表6。将reccas9表达载体与引导rna载体对和报告质粒的所有组合共转化。脱靶引导rna载体也与reccas9表达载体和报告质粒共转化，并含有靶向clta和vegf的引导rna序列(参见例如guilingeretal.,fusionofcatalyticallyinactivecas9tofokinucleaseimprovesthespecificityofgenomemodification.naturebiotechnology,(2014)，其全部内容在此通过引用并入)。egfp阳性细胞的百分比反映了经转染的(irfp阳性)细胞的百分比。每个实验至少记录6,000个活事件。值和误差条分别代表至少三个独立的生物学重复的平均值和标准偏差。(图4b)再次进行转染实验，用specr替换reccas9表达载体和puc中的抗性标志物。共转染和温育后，提取附加型dna(episomaldna)，转化到大肠杆菌中并选择羧苄青霉素抗性。然后对菌落进行测序以确定(图4c)重组质粒与完全完整质粒的比率。(图4d)分离自转染细胞的附加型提取物的测序数据。列和行代表转染条件。每个单元格显示重组的质粒的百分比和比率。显示的值反映了两个独立的生物学重复的平均值和标准偏差。平均值和每个重复之间的平均差值显示为误差。引导rna表达载体和引导rna序列缩写为grna。图5a-5d。reccas9介导培养的人细胞中基因组dna的引导rna-和reccas9-依赖性缺失。(图5a)示意图显示位于染色体12的fam19a2基因座的内含子区域内的预测的reccas9靶位点和用于巢式pcr的引物的位置。该图分别从上到下和从左到右描绘了seqidno:706-709。(图5b)来自用指定表达载体转染的细胞的模板的巢式基因组pcr的代表性结果(n＝3个生物学重复；ntc＝无模板对照)。星号表示1.3-kb预测的初级pcr产物的位置。箭头表示二级pcr后预测的缺失产物。这两个图来自相同的凝胶，但经切割以去除空白泳道。(图5c)对用所有四种grna表达载体转染的细胞的巢式基因组pcr产生的pcr产物的sanger测序，并且reccas9表达载体与预测的重组后产物匹配。该图分别从上到下描绘了seqidno:710和711。(图5d)通过有限稀释巢式pcr测定的fam19a2基因座的估计的最小缺失效率。显示的值反映了三次重复的平均值和标准偏差。图6。报告质粒构建。goldengate组装用于构建本工作中描述的报告质粒。所有组装均以共同质粒pcalnl-egfp-esp3i开始，该质粒衍生自pcalnl-egfp并包含esp3i限制性位点。显示的片段侧翼为esp3i位点。esp3i消化产生一系列相容的、独特的4碱基对5'突出端，以便按所示顺序进行组装。为了组装靶位点，将esp3i(thermofisherscientific，waltham，ma)和五个片段加入到单个反应管中以允许esp3i消化和t7连接的迭代循环。然后用plasmid-safe-atp依赖性dna酶(epicentre，madison，wi)消化反应以减少背景。通过菌落pcr分析菌落以鉴定与预期的全长5部分组装产物匹配的pcr产物；然后将来自这些菌落的质粒送去进行sanger测序。对于图4中所示的基因组报告物，将片段1和2以及片段4和5组合成编码整个靶位点的两个gblock(idt，coralville，ia)片段(图中未显示)。然后如上所述完成组装。构建细节可以在支持材料的方法中找到。用于产生片段的寡核苷酸和gblock可以在表2中找到。图7a和7b。演化以靶向人基因组的rosa基因座中称为“36c6”的位点的cre重组酶与dcas9融合。然后将该融合物用于以引导rna依赖性方式重组含有rosa靶位点的基于质粒的报告物。图7a证明了使用野生型cre和36c6的接头优化的结果。显示靶向其关联报告物的ginb构建体用于参考。显示的1x2x、5x和8x接头是接头中ggs重复的数量。图7b显示了回复分析的结果，其证明了对与dcas9融合的36c6进行突变可以影响嵌合融合物的相对引导依赖性。显示靶向其关联报告物的ginb构建体用于参考。ggs-36c6：1xggs接头；2ggs-36c6(使用接头seqidno:181)：2xggs接头(使用接头seqidno:181)。图8。鉴定了人基因组中rosa26位点侧翼的pam，其可以支持dcas9结合(参见上图)。设计引导rna和质粒报告物以测试内源性前间隔区是否可以支持dcas9-36c6活性。显示靶向gix报告物的ginb构建体用于参考。混合：cas9和36c6之间所有5种接头变体的等份混合物。序列对应于seqidno:769(核苷酸序列)和770(氨基酸序列)。图9a-9b。cre重组酶的各种测试的截短的位置显示在图9a中。与dcas9融合的cre重组酶的截短的变体显示出可察觉的重组酶活性以及对lox质粒报告物系统中引导rna的存在的严格依赖性(图9b)。与dcas9融合的野生型cre显示为阳性对照。定义如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种”、“一个”和“该/所述”包括单数和复数。因此，例如，提及“试剂”包括单一试剂和多个此类试剂。非限制性、示例性rna-可编程dna结合蛋白包括cas9核酸酶、cas9切口酶、核酸酶无活性的cas9(dcas9)、casx、casy、cpf1、c2c1、c2c2、c2c3和argonaute。术语“cas9”或“cas9域”是指包含cas9蛋白或其片段的rna引导的核酸酶(例如，包含cas9的活性、无活性或部分活性的dna切割域，和/或cas9的grna结合域的蛋白质)。cas9具有两个切割域，其切割特定的dna链(例如有义链和反义链)。可以产生切割任一条链的cas9切口酶(包括但不限于spcas9的d10a和h840a)。可以不受限制地在本文所述的融合蛋白和方法中使用cas9域(例如，核酸酶活性cas9、核酸酶无活性的cas9或cas9切口酶)。此外，本文所述的任何引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以用作切口酶。cas9核酸酶有时也称为casn1核酸酶或crispr(聚簇规则间隔短回文重复)相关核酸酶。crispr是适应性免疫系统，其提供针对移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的保护。crispr簇含有间隔区，与先前的移动元件互补的序列，并靶向侵入核酸。crispr簇得以转录并加工成crisprrna(crrna)。在ii型crispr系统中，对pre-crrna的正确加工需要反式编码的小rna(tracrrna)、内源性核糖核酸酶3(rnc)和cas9蛋白。tracrrna充当用于pre-crrna的核糖核酸酶3辅助加工的引导。随后，cas9/crrna/tracrrna以内切核水解方式切割与间隔区互补的线性或环状dsdna靶标。首先以内切核水解方式切割不与crrna互补的靶链，然后以3'-5'外切核水解方式修剪(trim)。在自然界中，dna结合和切割通常需要蛋白质和这两种rna。然而，单一引导rna(“sgrna”或简称“gnra”)可以经工程化以将crrna和tracrrna两者的方面并入单一rna种类中。参见例如jinekm.,chylinskik.,fonfarai.,hauerm.,doudnaj.a.,charpentiere.science337:816-821(2012)，其全部内容通过引用并入本文。cas9识别crispr重复序列中的短基序(pam或前间隔区相邻基序)，以帮助区分自我与非自我。cas9核酸酶序列和结构是本领域技术人员熟知的(参见例如“completegenomesequenceofanm1strainofstreptococcuspyogenes.”ferrettietal.,j.j.,mcshanw.m.,ajdicd.j.,savicd.j.,savicg.,lyonk.,primeauxc.,sezates.,suvorova.n.,kentons.,laih.s.,lins.p.,qiany.,jiah.g.,najarf.z.,renq.,zhuh.,songl.,whitej.,yuanx.,cliftons.w.,roeb.a.,mclaughlinr.e.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.98:4658-4663(2001)；“crisprrnamaturationbytrans-encodedsmallrnaandhostfactorrnaseiii.”deltchevae.,chylinskik.,sharmac.m.,gonzalesk.,chaoy.,pirzadaz.a.,eckertm.r.,vogelj.,charpentiere.,nature471:602-607(2011)；和“aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.”jinekm.,chylinskik.,fonfarai.,hauerm.,doudnaj.a.,charpentiere.science337:816-821(2012)，其各自的全部内容通过引用并入本文)。已经在各种物种中描述了cas9直系同源物，包括但不限于酿脓链球菌(s.pyogenes)和嗜热链球菌(s.thermophilus)。基于本公开，其他合适的cas9核酸酶和序列对于本领域技术人员将是显而易见的，并且此类cas9核酸酶和序列包括来自chylinski,rhun,andcharpentier,“thetracrrnaandcas9familiesoftypeiicrispr-casimmunitysystems”(2013)rnabiology10:5,726-737中公开的生物体和基因座的cas9序列；其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，cas9核酸酶具有无活性的(例如失活的)dna切割域，也就是说，cas9是切口的酶。作为一个实例，cas9核酸酶(例如cas9切口酶)可以切割与grna结合的dna链。作为另一个实例，cas9核酸酶(例如cas9切口酶)可以切割不与grna结合的dna链。在另一个实施方案中，任何引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以具有无活性的(例如失活的)dna切割域，即，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是切口酶。作为一个实例，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以切割与grna结合的dna链。作为另一个实例，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以切割不与grna结合的dna链。另外的示例性cas9序列可以在2017年4月27日公开的题为“evolvedcas9proteinsforgeneediting”的国际公开号wo/2017/070633中找到。核酸酶失活的cas9蛋白可以互换地称为“dcas9”蛋白(相当于核酸酶-“死亡的”cas9)。在一些实施方案中，dcas9对应于，或部分或全部包含如下以seqidno:1所示的氨基酸。在一些实施方案中，提供了dcas9的变体(例如seqidno:1的变体)。例如，在一些实施方案中，提供了具有除d10a和h840a之外的突变的dcas9变体，其例如导致核酸酶失活的cas9(dcas9)。举例来说，此类突变包括d10和h840处的其他氨基酸取代，或cas9的核酸酶域内的其他取代(例如，hnh核酸酶亚域和/或ruvc1亚域中的取代)。在一些实施方案中，提供了dcas9的变体或同源物(例如seqidno:1的变体)，其与seqidno:10至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％。在一些实施方案中，提供了dcas9的变体(例如seqidno:1的变体)，其具有比seqidno:1短或长约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或更多的氨基酸序列。dcas9(d10a和h840a):mdkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdaivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:1)用于生成具有无活性的dna切割域的cas9蛋白(或其片段)的方法是已知的(参见例如jineketal.,science.337:816-821(2012)；qietal.,“repurposingcrisprasanrna-guidedplatformforsequence-specificcontrolofgeneexpression”(2013)cell.28；152(5):1173-83，其各自的全部内容通过引用并入本文)。例如，已知cas9的dna切割域包括两个亚域，即hnh核酸酶亚域和ruvc1亚域。hnh亚域切割与grna互补的链，而ruvc1亚域切割非互补链。这些亚域内的突变可以沉默cas9的核酸酶活性。例如，突变d10a和h840a完全使酿脓链球菌cas9的核酸酶活性失活(参见例如，jineketal.,science.337:816-821(2012)；qietal.,cell.28；152(5):1173-83(2013))。在一些实施方案中，提供了包含cas9的片段的蛋白质。例如，在一些实施方案中，蛋白质包含两个cas9域的一个：(1)cas9的grna结合域；或(2)cas9的dna切割域。在一些实施方案中，包含cas9或其片段的蛋白质称为“cas9变体”。cas9变体与cas9或其片段共享同源性。例如，cas9变体与野生型cas9至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％。在一些实施方案中，cas9变体包含cas9的片段(例如，grna结合域或dna切割域)，使得该片段与野生型cas9的相应的片段至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％。在一些实施方案中，野生型cas9对应与来自酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9(ncbi参考序列：nc_017053.1，seqidno:2(核苷酸)；seqidno:3(氨基酸))。在一些实施方案中，cas9域包含与野生型cas9至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，与野生型cas9相比，cas9域包含具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、21、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，与野生型cas9相比，cas9域包含具有至少10、至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100或至少1200个相同的连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，cas9变体包含cas9的片段(例如，grna结合域或dna切割域)，使得该片段与野生型cas9的相应的片段至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约96％相同、至少约97％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同。在一些实施方案中，片段是相应的野生型cas9的氨基酸长度的至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％相同、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。在一些实施方案中，片段的长度为至少100个氨基酸。在一些实施方案中，片段的长度为至少100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250或1300个氨基酸。atggataagaaatactcaataggcttagatatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgattataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttggcagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggcagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaatctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtagagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagagaaatggcttgtttgggaatctcattgctttgtcattgggattgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatagtgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaagcgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgagggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggcgcctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggggatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagatattcaaaaagcacaggtgtctggacaaggccatagtttacatgaacagattgctaacttagctggcagtcctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaaattgttgatgaactggtcaaagtaatggggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctacaaaatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatcacattgttccacaaagtttcattaaagacgattcaatagacaataaggtactaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataatttaacgaaagctgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaattggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaatactaaatacgatgaaaatgataaacttattcgagaggttaaagtgattaccttaaaatctaaattagtttctgacttccgaaaagatttccaattctataaagtacgtgagattaacaattaccatcatgcccatgatgcgtatctaaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaaacttgaatcggagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttcgtaaaatgattgctaagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaaatatttcttttactctaatatcatgaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctaatcgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggcgagattttgccacagtgcgcaaagtattgtccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagtacagacaggcggattctccaaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttattgctcgtaaaaaagactgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagcttattcagtcctagtggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgttaaagagttactagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgactttttagaagctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaatatagtctttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaattacaaaaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagtcattatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggagcagcataagcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcgtgttattttagcagatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaaccaatacgtgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatcttggagctcccgctgcttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatacgtctacaaaagaagttttagatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaacacgcattgatttgagtcagctaggaggtgactga(seqidno:2)mdkkysigldigtnsvgwavitddykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfgsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkkladstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqiynqlfeenpinasrvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekrnglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnseitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgayhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedrgmieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqghslheqianlagspaikkgilqtvkivdelvkvmghkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsfikddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:3)在一些实施方案中，野生型cas9对应于，或包含seqidno:4(核苷酸)和/或seqidno:5(氨基酸)。atggataaaaagtattctattggtttagacatcggcactaattccgttggatgggctgtcataaccgatgaatacaaagtaccttcaaagaaatttaaggtgttggggaacacagaccgtcattcgattaaaaagaatcttatcggtgccctcctattcgatagtggcgaaacggcagaggcgactcgcctgaaacgaaccgctcggagaaggtatacacgtcgcaagaaccgaatatgttacttacaagaaatttttagcaatgagatggccaaagttgacgattctttctttcaccgtttggaagagtccttccttgtcgaagaggacaagaaacatgaacggcaccccatctttggaaacatagtagatgaggtggcatatcatgaaaagtacccaacgatttatcacctcagaaaaaagctagttgactcaactgataaagcggacctgaggttaatctacttggctcttgcccatatgataaagttccgtgggcactttctcattgagggtgatctaaatccggacaactcggatgtcgacaaactgttcatccagttagtacaaacctataatcagttgtttgaagagaaccctataaatgcaagtggcgtggatgcgaaggctattcttagcgcccgcctctctaaatcccgacggctagaaaacctgatcgcacaattacccggagagaagaaaaatgggttgttcggtaaccttatagcgctctcactaggcctgacaccaaattttaagtcgaacttcgacttagctgaagatgccaaattgcagcttagtaaggacacgtacgatgacgatctcgacaatctactggcacaaattggagatcagtatgcggacttatttttggctgccaaaaaccttagcgatgcaatcctcctatctgacatactgagagttaatactgagattaccaaggcgccgttatccgcttcaatgatcaaaaggtacgatgaacatcaccaagacttgacacttctcaaggccctagtccgtcagcaactgcctgagaaatataaggaaatattctttgatcagtcgaaaaacgggtacgcaggttatattgacggcggagcgagtcaagaggaattctacaagtttatcaaacccatattagagaagatggatgggacggaagagttgcttgtaaaactcaatcgcgaagatctactgcgaaagcagcggactttcgacaacggtagcattccacatcaaatccacttaggcgaattgcatgctatacttagaaggcaggaggatttttatccgttcctcaaagacaatcgtgaaaagattgagaaaatcctaacctttcgcataccttactatgtgggacccctggcccgagggaactctcggttcgcatggatgacaagaaagtccgaagaaacgattactccatggaattttgaggaagttgtcgataaaggtgcgtcagctcaatcgttcatcgagaggatgaccaactttgacaagaatttaccgaacgaaaaagtattgcctaagcacagtttactttacgagtatttcacagtgtacaatgaactcacgaaagttaagtatgtcactgagggcatgcgtaaacccgcctttctaagcggagaacagaagaaagcaatagtagatctgttattcaagaccaaccgcaaagtgacagttaagcaattgaaagaggactactttaagaaaattgaatgcttcgattctgtcgagatctccggggtagaagatcgatttaatgcgtcacttggtacgtatcatgacctcctaaagataattaaagataaggacttcctggataacgaagagaatgaagatatcttagaagatatagtgttgactcttaccctctttgaagatcgggaaatgattgaggaaagactaaaaacatacgctcacctgttcgacgataaggttatgaaacagttaaagaggcgtcgctatacgggctggggacgattgtcgcggaaacttatcaacgggataagagacaagcaaagtggtaaaactattctcgattttctaaagagcgacggcttcgccaataggaactttatgcagctgatccatgatgactctttaaccttcaaagaggatatacaaaaggcacaggtttccggacaaggggactcattgcacgaacatattgcgaatcttgctggttcgccagccatcaaaaagggcatactccagacagtcaaagtagtggatgagctagttaaggtcatgggacgtcacaaaccggaaaacattgtaatcgagatggcacgcgaaaatcaaacgactcagaaggggcaaaaaaacagtcgagagcggatgaagagaatagaagagggtattaaagaactgggcagccagatcttaaaggagcatcctgtggaaaatacccaattgcagaacgagaaactttacctctattacctacaaaatggaagggacatgtatgttgatcaggaactggacataaaccgtttatctgattacgacgtcgatcacattgtaccccaatcctttttgaaggacgattcaatcgacaataaagtgcttacacgctcggataagaaccgagggaaaagtgacaatgttccaagcgaggaagtcgtaaagaaaatgaagaactattggcggcagctcctaaatgcgaaactgataacgcaaagaaagttcgataacttaactaaagctgagaggggtggcttgtctgaacttgacaaggccggatttattaaacgtcagctcgtggaaacccgccaaatcacaaagcatgttgcacagatactagattcccgaatgaatacgaaatacgacgagaacgataagctgattcgggaagtcaaagtaatcactttaaagtcaaaattggtgtcggacttcagaaaggattttcaattctataaagttagggagataaataactaccaccatgcgcacgacgcttatcttaatgccgtcgtagggaccgcactcattaagaaatacccgaagctagaaagtgagtttgtgtatggtgattacaaagtttatgacgtccgtaagatgatcgcgaaaagcgaacaggagataggcaaggctacagccaaatacttcttttattctaacattatgaatttctttaagacggaaatcactctggcaaacggagagatacgcaaacgacctttaattgaaaccaatggggagacaggtgaaatcgtatgggataagggccgggacttcgcgacggtgagaaaagttttgtccatgccccaagtcaacatagtaaagaaaactgaggtgcagaccggagggttttcaaaggaatcgattcttccaaaaaggaatagtgataagctcatcgctcgtaaaaaggactgggacccgaaaaagtacggtggcttcgatagccctacagttgcctattctgtcctagtagtggcaaaagttgagaagggaaaatccaagaaactgaagtcagtcaaagaattattggggataacgattatggagcgctcgtcttttgaaaagaaccccatcgacttccttgaggcgaaaggttacaaggaagtaaaaaaggatctcataattaaactaccaaagtatagtctgtttgagttagaaaatggccgaaaacggatgttggctagcgccggagagcttcaaaaggggaacgaactcgcactaccgtctaaatacgtgaatttcctgtatttagcgtcccattacgagaagttgaaaggttcacctgaagataacgaacagaagcaactttttgttgagcagcacaaacattatctcgacgaaatcatagagcaaatttcggaattcagtaagagagtcatcctagctgatgccaatctggacaaagtattaagcgcatacaacaagcacagggataaacccatacgtgagcaggcggaaaatattatccatttgtttactcttaccaacctcggcgctccagccgcattcaagtattttgacacaacgatagatcgcaaacgatacacttctaccaaggaggtgctagacgcgacactgattcaccaatccatcacgggattatatgaaactcggatagatttgtcacagcttgggggtgacggatcccccaagaagaagaggaaagtctcgagcgactacaaagaccatgacggtgattataaagatcatgacatcgattacaaggatgacgatgacaaggctgcagga(seqidno:4)mdkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:5)在一些实施方案中，cas9是指来自以下的cas9：溃疡棒杆菌(corynebacteriumulcerans)(ncbirefs:nc_015683.1,nc_017317.1)；白喉棒杆菌(corynebacteriumdiphtheria)(ncbirefs:nc_016782.1,nc_016786.1)；spiroplasmasyrphidicola(ncbiref:nc_021284.1)；间型普雷沃氏菌(prevotellaintermedia)(ncbiref:nc_017861.1)；台湾螺原体(spiroplasmataiwanense)(ncbiref:nc_021846.1)；海豚链球菌(streptococcusiniae)(ncbiref:nc_021314.1)；波罗的海贝尔氏菌(belliellabaltica)(ncbiref:nc_018010.1)；psychroflexustorquisi(ncbiref:nc_018721.1)；嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)(ncbiref:yp_820832.1)、无害李斯特氏菌(listeriainnocua)(ncbiref:np_472073.1)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)(ncbiref:yp_002344900.1)或脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)(ncbiref:yp_002342100.1)或者是指来自任何其他生物体的cas9。cas9识别靶dna序列中crispr重复序列中的短基序(pam基序)。如本文所用，“pam基序”或“前间隔区相邻基序”是指在crispr细菌适应性免疫系统中直接在由cas9核酸酶靶向的dna序列之后的dna序列。pam是入侵病毒或质粒的组分，但不是细菌crispr基因座的组分。自然地，若其后没有pam序列，则cas9不会成功结合或切割靶dna序列。pam是靶向组分(在细菌基因组中未发现)，其区分细菌自我与非自我dna，从而防止crispr基因座被cas9核酸酶活性靶向和破坏。野生型酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)cas9识别规范pam序列(例如来自嗜热链球菌(streptococcusthermophiles)、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌或齿垢密螺旋体(treponemadenticolaor)的cas9)及其cas9变体已在本领域中描述为具有不同的或更放松的pam需求。通常，cas9蛋白，例如来自酿脓链球菌的cas9(spcas9)，需要规范的nggpam序列来结合特定的核酸区域，其中“ngg”中的“n”是腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、鸟嘌呤(g)或胞嘧啶(c)，并且g是鸟嘌呤。这可以限制在基因组内编辑期望的碱基的能力。在一些实施方案中，本文提供的碱基编辑融合蛋白需要定位于精确的位置处，例如，其中靶碱基在4碱基区域(例如“脱氨基作用窗口”)内，其在pam的上游的约15个碱基。参见komor,a.c.,etal.,“programmableeditingofatargetbaseingenomicdnawithoutdouble-strandeddnacleavage”nature533,420-424(2016)，其全部内容在此通过引用并入。在一些实施方案中，脱氨基作用窗口在2、3、4、5、6、7、8、9或10碱基区域内。在一些实施方案中，脱氨基作用窗口在pam的上游的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碱基。因此，在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白可以含有能够结合不含规范的(例如，ngg)pam序列的核苷酸序列的cas9域。本领域中已经描述了结合非规范pam序列的cas9域，并且其对于熟练技术人员而言将是显而易见的。例如，结合非规范pam序列的cas9域已经描述于kleinstiver,b.p.,etal.,“engineeredcrispr-cas9nucleaseswithalteredpamspecificities”nature523,481-485(2015)；和kleinstiver,b.p.,etal.,“broadeningthetargetingrangeofstaphylococcusaureuscrispr-cas9bymodifyingpamrecognition”naturebiotechnology33,1293-1298(2015)；每篇的全部内容在此通过引用并入。还参见：klenstiveretal.,nature529,490–495,2016；ranetal.,nature,apr9；520(7546):186–191,2015；houetal.,procnatlacadsciusa,110(39):15644-9,2014；prykhozhijetal.,plosone,10(3):e0119372,2015；zetscheetal.,cell163,759–771,2015；gaoetal.,naturebiotechnology,doi:10.1038/nbt.3547,2016；wantetal.,nature461,754–761,2009；chavezetal.,doi:dxdotdoidotorg/10.1101/058974；fagerlundetal.,genomebiol.2015；16:25,2015；zetscheetal.,cell,163,759–771,2015；和swartsetal.,natstructmolbiol,21(9):743-53,2014，其每一个的全部内容通过引用并入本文。因此，本公开的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以识别多种pam序列，包括但不限于：ngg、ngan(seqidno:741)、ngng(seqidno:742)、ngag(seqidno:743)、ngcg(seqidno:744)、nngrrt(seqidno:745)、ngrrn(seqidno:746)、nnnrrt(seqidno:747)、nnngatt(seqidno:748)、nnagaaw(seqidno:749)、naaac(seqidno:750)、ttn、tttn(seqidno:751)和ytn，其中y是嘧啶，并且n是任何核碱基。具有不同的pam特异性的rna-可编程dna结合蛋白的一个实例是来自普雷沃氏菌(prevotella)和弗朗西斯菌(francisella)1(cpf1)的聚簇规则间隔短回文重复。与cas9类似，cpf1也是2类crispr效应物。已经显示，cpf1介导了强大的dna干扰，其具有与cas9不同的特征。cpf1是缺乏tracrrna的单一rna引导的内切核酸酶，并且它利用富含t的前间隔区相邻基序(ttn、tttn(seqidno:751)或ytn)。此外，cpf1经由交错的dna双链断裂切割dna。在16种cpf1家族蛋白中，来自氨基酸球菌(acidaminococcus)和毛螺菌(lachnospiraceae)的两种酶显示在人细胞中具有有效的基因组编辑活性。本文还提供了核酸酶无活性的cpf1(dcpf1)变体，其可以用作rna-可编程dna结合蛋白域。cpf1蛋白具有ruvc样内切核酸酶域，其类似于cas9的ruvc域，但不具有hnh内切核酸酶域，并且cpf1的n端不具有cas9的alpha螺旋识别叶(lobe)。它在zetscheetal.,cell,163,759–771,2015(其全部内容通过引用并入本文)中显示，cpf1的ruvc样域负责切割两条dna链并且ruvc样域的失活使cpf1核酸酶活性失活。例如，对应于新凶手弗朗西斯菌(francisellanovicida)cpf1(seqidno:714)中的d917a、e1006a或d1255a的突变使cpf1核酸酶活性失活。在一些实施方案中，本公开的dcpf1包含对应于seqidno:714中d917a、e1006a、d1255a、d917a/e1006a、d917a/d1255a、e1006a/d1255a或d917a/e1006a/d1255a的突变。应当理解，可以根据本公开使用使cpf1的ruvc域失活的任何突变，例如取代突变、缺失或插入。在一些实施方案中，本公开的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域对pam序列没有需求。此类引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白的一个实例可以是来自格氏嗜盐碱杆菌(natronobacteriumgregoryi)的argonaute蛋白(ngago)。ngago是ssdna引导的内切核酸酶。ngago结合约24个核苷酸的5′磷酸化ssdna(gdna)，以将其引导至其靶位点，并将在gdna位点处产生dna双链断裂。与cas9相比，ngago-gdna系统不需要前间隔区相邻基序(pam)。使用核酸酶无活性的ngago(dngago)可以极大地扩展可以靶向的密码子。ngago的表征和使用已经描述于gaoetal.,natbiotechnol.epub2016may2.pubmedpmid:27136078；swartsetal.,nature.507(7491)(2014):258-61；和swartsetal.,nucleicacidsres.43(10)(2015):5120-9，其每个的全部内容通过引用并入本文。格氏嗜盐碱杆菌argonaute的序列提供于seqidno:718中。本文还提供了具有放松的pam需求的cas9变体(无pam(pamless)的cas9)。与如seqidno:1提供的酿脓链球菌cas9相比，无pam的cas9对靶序列表现出增加的活性，所述靶序列在其3'端处不包含规范的pam(ngg)，例如增加的活性为至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍、至少5,000倍、至少10,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍、至少500,000倍或至少1,000,000倍。因此，本公开的dcas9或cas9切口酶可以进一步包含放松pam需求的突变，例如，对应于seqidno:1中a262t、k294r、s409i、e480k、e543d、m694i或e1219v的突变。应当理解，另外的cas9蛋白(例如，核酸酶死亡的cas9(dcas9)、cas9切口酶(ncas9)或核酸酶活性cas9)，包括其变体和同源物，都在本公开的范围内。示例性cas9蛋白包括但不限于下文提供的那些。在一些实施方案中，cas9蛋白是核酸酶死亡的cas9(dcas9)。在一些实施方案中，dcas9包含如下所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，cas9蛋白是cas9切口酶(ncas9)。在一些实施方案中，ncas9包含如下所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，cas9蛋白是核酸酶活性cas9。在一些实施方案中，核酸酶活性cas9包含如下所示的氨基酸序列。示例性的催化无活性的cas9(dcas9)：dkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdaivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:752)示例性的cas9切口酶(ncas9)：dkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:753)示例性的催化活性cas9：dkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:754)在一些实施方案中，cas9是指来自构成单细胞原核微生物的域和界的古生菌(arehaea)(例如纳古生菌(nanoarchaea))的cas9。在一些实施方案中，cas9是指casx或casy，其已经描述于例如bursteinetal.,“newcrispr–cassystemsfromuncultivatedmicrobes.”cellres.2017feb21.doi:10.1038/cr.2017.21，其全部内容在此通过引用并入。使用基因组分辨的宏基因组学，鉴定了许多crispr-cas系统，包括在生命的古生菌域中首次报告的cas9。这种趋异的cas9蛋白在研究很少的纳古生菌中作为活性crispr-cas系统的一部分发现。在细菌中，发现了两个以前未知的系统，crispr-casx和crispr-casy，它们是迄今发现的最紧凑的系统之一。在一些实施方案中，cas9是指casx或casx的变体。在一些实施方案中，cas9是指casy或casy的变体。应当理解，其他rna引导的dna结合蛋白可以用作引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白，并且在本公开的范围内。在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域可以是casx或casy蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域是casx蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域是casy蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域包含与天然存在的casx或casy蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域是天然存在的casx或casy蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域包含与本文所述的示例性casx或casy蛋白的任一个至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域包含本文所述的示例性casx或casy蛋白的任一个的氨基酸序列。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他细菌物种的casx和casy。casx(uniprot.org/uniprot/f0nn87；uniprot.org/uniprot/f0nh53)>tr|f0nn87|f0nn87_sulihcrispr相关的casx蛋白os＝冰岛硫化叶菌(sulfolobusislandicus)(菌株hve10/4)gn＝sih_0402pe＝4sv＝1mevplynifgdnyiiqvateaenstiynnkveiddeelrnvlnlaykiaknnedaaaerrgkakkkkgeegetttsniilplsgndknpwtetlkcynfpttvalsevfknfsqvkeceevsapsfvkpefyefgrspgmvertrrvklevephyliiaaagwvltrlgkakvsegdyvgvnvftptrgilysliqnvngivpgikpetafglwiarkvvssvtnpnvsvvriytisdavgqnpttinggfsidltkllekryllserleaiarnalsissnmreryivlanyiyeyltgskrledllyfanrdlimnlnsddgkvrdlklisayvngelirgeg(seqidno:755)>tr|f0nh53|f0nh53_sulircrispr相关的蛋白质,casxos＝冰岛硫化叶菌(菌株rey15a)gn＝sire_0771pe＝4sv＝1mevplynifgdnyiiqvateaenstiynnkveiddeelrnvlnlaykiaknnedaaaerrgkakkkkgeegetttsniilplsgndknpwtetlkcynfpttvalsevfknfsqvkeceevsapsfvkpefykfgrspgmvertrrvklevephylimaaagwvltrlgkakvsegdyvgvnvftptrgilysliqnvngivpgikpetafglwiarkvvssvtnpnvsvvsiytisdavgqnpttinggfsidltkllekrdllserleaiarnalsissnmreryivlanyiyeyltgskrledllyfanrdlimnlnsddgkvrdlklisayvngelirgeg(seqidno:756)casy(ncbi.nlm.nih.gov/protein/apg80656.1)>apg80656.1crispr相关的蛋白质casy[未培养的parcubacteria组细菌]mskrhprisgvkgyrlhaqrleytgksgamrtikyplysspsggrtvpreivsainddyvglyglsnfddlynaekrneekvysvldfwydcvqygavfsytapgllknvaevrggsyeltktlkgshlydelqidkvikflnkkeisrangsldklkkdiidcfkaeyrerhkdqcnkladdiknakkdagaslgerqkklfrdffgiseqsendkpsftnplnltccllpfdtvnnnrnrgevlfnklkeyaqkldknegslemweyigignsgtafsnflgegflgrlrenkitelkkammditdawrgqeqeeelekrlrilaaltiklrepkfdnhwggyrsdingklsswlqnyinqtvkikedlkghkkdlkkakeminrfgesdtkeeavvssllesiekivpddsaddekpdipaiaiyrrflsdgrltlnrfvqredvqealikerleaekkkkpkkrkkksdaedeketidfkelfphlakplklvpnfygdskrelykkyknaaiytdalwkavekiyksafssslknsffdtdfdkdffikrlqkifsvyrrfntdkwkpivknsfapycdivslaenevlykpkqsrsrksaaidknrvrlpsteniakagialarelsvagfdwkdllkkeeheeyidlielhktalalllavtetqldisaldfvengtvkdfmktrdgnlvlegrflemfsqsivfselrglaglmsrkefitrsaiqtmngkqaellyiphefqsakittpkemsrafldlapaefatslepeslseksllklkqmryyphyfgyeltrtgqgidggvaenalrlekspvkkreikckqyktlgrgqnkivlyvrssyyqtqflewflhrpknvqtdvavsgsflidekkvktrwnydaltvalepvsgservfvsqpftifpeksaeeegqrylgidigeygiaytaleitgdsakildqnfisdpqlktlreevkglkldqrrgtfampstkiarireslvhslrnrihhlalkhkakivyelevsrfeegkqkikkvyatlkkadvyseidadknlqttvwgklavaseisasytsqfcgackklwraemqvdetittqeligtvrvikggtlidaikdfmrppifdendtpfpkyrdfcdkhhiskkmrgnsclficpfcranadadiqasqtiallryvkeekkvedyferfrklknikvlgqmkki(seqidno:757)术语“缀合”是指两个实体的缔合，例如两个分子，诸如两个蛋白质、两个域(例如，结合域和切割域)，或蛋白质和试剂，例如蛋白质结合域和小分子的缔合。在一些方面，缔合在蛋白质(例如，rna-可编程核酸酶)和核酸(例如，引导rna)之间。缔合可以是例如经由直接或间接的(例如，经由接头)共价连接。在一些实施方案中，缔合是共价的。在一些实施方案中，两个分子经由连接两个分子的接头缀合。例如，在两个蛋白质彼此缀合(例如，经工程化的核酸酶的结合域和切割域)以形成蛋白质融合物的一些实施方案中，这两个蛋白质可以经由多肽接头(例如，将一个蛋白质的c端连接到另一个蛋白质的n端的氨基酸序列)缀合。如本文在核酸序列的背景下使用的术语“共有序列”是指表示在多个相似序列中的每个位置处发现的最频繁的核苷酸残基的经计算的序列。通常，通过序列比对确定共有序列，其中相似的序列彼此比较并计算相似的序列基序。在重组酶靶位点序列的背景下，在一些实施方案中，重组酶靶位点的共有序列可以是通过给定的重组酶最频繁地结合或以最高亲和力结合的序列。如本文所用的术语“工程化的”是指已人为设计、生产、制备、合成和/或制造的蛋白质分子、核酸、复合物、物质或实体。因此，工程化的产品是天然不存在的产品。如本文所用，术语“有效量”是指足以引起期望的生物学反应的生物活性剂的量。在一些实施方案中，重组酶的有效量可以指足以诱导在由重组酶特异性结合并重组的靶位点处的重组的重组酶的量。如熟练技术人员将理解的，试剂，例如核酸酶、重组酶、杂合蛋白、融合蛋白、蛋白质二聚体、蛋白质(或蛋白质二聚体)和多核苷酸的复合物，或多核苷酸的有效量可以随各种因素而变化，诸如例如随期望的生物学反应、特定等位基因、基因组、靶位点、靶定的细胞或组织和使用的试剂而变化。如本文所用，“引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白”是指能够结合dna的蛋白质、多肽或域，并且与其靶dna序列的结合由引导核苷酸序列介导。“引导核苷酸”可以是rna或dna分子(例如，单链dna或ssdna分子)，其与靶序列互补并且可以将dna结合蛋白引导至靶序列。因此，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以是rna-可编程dna结合蛋白，或ssdna-可编程dna结合蛋白。“可编程”意指dna结合蛋白可以被编程以结合引导核苷酸靶标的任何dna序列。本文提及的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以是本领域已知的任何引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白而没有限制，其包括但不限于，二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白。术语“环状置换”是指其中蛋白质中氨基酸的顺序已经改变，导致具有改变的连接性(connectivity)但相似的(整体)三维形状的蛋白质结构的蛋白质。当原始的n和c末端氨基酸经由肽键连接时形成环状置换；然后肽序列在肽序列内的另一个位置中断裂，产生新的n和c端。环状置换可以通过许多过程发生，包括演化事件、翻译后修饰或人工工程化突变。例如，环状置换可以用于改善蛋白质的催化活性或热稳定性。环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可与本文所述的任何实施方案一起使用。术语“二分叉”通常是指分成两部分的单体蛋白质。通常，两个部分都是单体蛋白质的功能所需要的。二分叉的蛋白质可以或不可以自身二聚化以重建功能性蛋白质。二分叉可以通过许多过程发生，包括演化事件、翻译后修饰或人工工程化突变。当与二分叉域融合时，其他蛋白质域可以用于强制二分叉蛋白质的重新组装。在一些情况下，其相互作用依赖于小分子的蛋白质域可以与每个二分叉域融合，导致二分叉蛋白质的小分子调节的二聚化。如本文所用，术语“同源的”是本领域理解的术语，其是指在核苷酸和/或氨基酸序列的水平上高度相关的核酸或多肽。彼此同源的核酸或多肽称为“同源物”。两个序列之间的同源性可以通过本领域技术人员已知的序列比对方法确定。根据本发明，若两个序列对于至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少120、至少150或至少200个氨基酸的至少一段(stretch)，至少约50-60％相同，例如在一个或另一个序列中包含的所有残基的至少约50-60％中共享相同的残基(例如氨基酸残基)、至少约70％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同，则认为它们是同源的。如本文所用，术语“序列一致性”或“序列一致性百分比”可以分别指给定dna或蛋白质中与参照序列相同的核酸或氨基酸残基的百分比。参见例如：christopherm.holman,proteinsimilarityscore:asimplifiedversionoftheblastscoreasasuperioralternativetopercentidentityforclaiminggenusesofrelatedproteinsequences,21santaclaracomputer&hightech.l.j.55,60(2004)，以其全部内容通过引用并入本文。如本文所用，术语“接头”是指连接两个分子或部分，例如融合蛋白的两个域，诸如例如核酸酶无活性的cas9域和核酸编辑域(例如腺苷脱氨酶)的键(例如共价键)、化学基团或分子。在一些实施方案中，接头连接rna-可编程核酸酶的grna结合域，包括cas9核酸酶域和核酸编辑蛋白的催化域。在一些实施方案中，接头连接dcas9和核酸编辑蛋白。通常，接头位于两个基团、分子或其他部分之间或侧翼有两个基团、分子或其他部分，并且经由共价键与每一个连接，从而连接两者。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头的长度为5-100个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150或150-200个氨基酸。也考虑了更长或更短的接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列sgsetpgtsesatpes(seqidno:7)，其也可以称为xten接头。在一些实施方案中，接头包含氨基酸序列sggs(seqidno:758)。在一些实施方案中，接头包含(sggs)n(seqidno:758)、(gggs)n(seqidno:759)、(ggggs)n(seqidno:722)、(g)n、(eaaak)n(seqidno:723)、(ggs)n或(xp)n基序，或这些中任何的组合，其中n独立地是1和30之间的整数，并且其中x是任何氨基酸。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。如本文所用，术语“突变”是指序列(例如核酸或氨基酸序列)内的残基用另一个残基取代或序列内一个或多个残基的缺失或插入。本文通常通过鉴定初始残基，随后是序列内残基的位置和新取代的残基的身份来描述突变。用于产生本文提供的氨基酸取代(突变)的各种方法在本领域中是熟知的，并且由例如greenandsambrook,molecularcloning:alaboratorymanual(4thed.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2012))提供。术语“核定位序列”或“nls”是指促进蛋白质输入细胞核(例如通过核转运)的氨基酸序列。核定位序列是本领域已知的，并且对于熟练技术人员是显而易见的。例如，nls序列描述于2001年11月23日提交的plank等人的国际pct申请pct/ep2000/011690，2001年5月31日公布为wo/2001/038547，其内容通过引用并入本文，用于其对示例性的核定位序列的公开内容。在一些实施方案中，nls包含氨基酸序列pkkkrkv(seqidno:702)或mdsllmnrrkflyqfknvrwakgrretylc(seqidno:761)。如本文所用，术语“核酸酶”是指能够切割连接核酸分子中两个核苷酸残基的磷酸二酯键的试剂，例如蛋白质。在一些实施方案中，“核酸酶”是指具有无活性的dna切割域，使得核酸酶不能切割磷酸二酯键的蛋白质。在一些实施方案中，核酸酶是蛋白质，例如，可以结合核酸分子并切割连接核酸分子内的核苷酸残基的磷酸二酯键的酶。核酸酶可以是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的内切核酸酶，或切割在多核苷酸链的末端处的磷酸二酯键的外切核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是结合和/或切割特定核苷酸序列(其在本文中也称为“识别序列”、“核酸酶靶位点”或“靶位点”)内的特定磷酸二酯键的位点特异性核酸酶。在一些实施方案中，核酸酶是rna引导的(即，rna-可编程)核酸酶，其与具有与靶位点互补的序列的rna(例如，引导rna，“grna”)缔合(例如，结合)，从而提供核酸酶的序列特异性。在一些实施方案中，核酸酶识别单链靶位点，而在其他实施方案中，核酸酶识别双链靶位点，例如双链dna靶位点。许多天然存在的核酸酶(例如许多天然存在的dna限制性核酸酶)的靶位点是本领域技术人员熟知的。核酸酶蛋白质通常包含介导蛋白质与核酸底物相互作用并且在一些情况下，还特异性结合靶位点的“结合域”，以及催化核酸骨架内的磷酸二酯键的切割的“切割域”。在一些实施方案中，核酸酶蛋白质可以以单体形式结合和切割核酸分子，而在其他实施方案中，核酸酶蛋白质必须二聚化或多聚化以切割靶核酸分子。天然存在的核酸酶的结合域和切割域，以及可以融合以产生结合特定靶位点的核酸酶的模块结合域和切割域是本领域技术人员熟知的。例如，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白(诸如rna-可编程核酸酶(例如cas9))或具有无活性dna切割域的cas9蛋白的结合域可以用作结合域(例如，结合grna以直接结合靶位点)以特异性结合所期望的靶位点，并与切割域融合或缀合。如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”是指包含核碱基和酸性部分(例如核苷、核苷酸或核苷酸的聚合物)的化合物。通常，聚合核酸，例如包含三个或更多个核苷酸的核酸分子是线性分子，其中相邻的核苷酸经由磷酸二酯连接彼此连接。在一些实施方案中，“核酸”是指个别的核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含三个或更多个个别核苷酸残基的寡核苷酸链。如本文所用，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以可互换地使用以指核苷酸的聚合物(例如，至少三个核苷酸的串)。在一些实施方案中，“核酸”涵盖rna以及单链和/或双链dna。核酸可以是天然存在的，例如在基因组、转录物、mrna、trna、rrna、sirna、snrna、质粒、粘粒、染色体、染色单体或其他天然存在的核酸分子的背景下。另一方面，核酸分子可以是非天然存在的分子，例如重组dna或rna、人工染色体、工程化的基因组或其片段，或合成的dna、rna、dna/rna杂交体，或包括非天然存在的核苷酸或核苷。此外，术语“核酸”、“dna”、“rna”和/或相似术语包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯主链之外的类似物。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，例如具有化学修饰的碱基或糖、和主链修饰的类似物。除非另有说明，核酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如硫代磷酸酯和5'-n-亚磷酰胺连接)。术语“正交”是指最低限度相互作用(若有的话)的生物组分。若grna引导的reccas9蛋白不与其他潜在的重组酶位点相互作用或最低限度地相互作用，则含有不同grna结合位点的重组酶靶位点是正交的。术语“正交性”指的是系统组分可以独立变化而不影响其他组分的效能的构思。复合物的grna引导的性质使得与reccas9蛋白复合的该组grna分子能够仅在grna引导的位点处引导重组酶活性。通过该组grna分子对靶定重组酶位点上的酶活性的完全或近完全的依赖性来证明该系统的正交性。如本文所用，术语“药物组合物”是指可以在治疗和/或预防疾病或病症的背景下施用于受试者的组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含活性成分，例如与cas9蛋白融合的重组酶，或其片段(或编码此类融合物的核酸)和任选的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含发明的cas9变体/融合(例如fcas9)蛋白和适于将cas9变体/融合蛋白靶向到靶核酸的grna。在一些实施方案中，靶核酸是基因。在一些实施方案中，靶核酸是与疾病相关的等位基因，其中等位基因通过cas9变体/融合蛋白的作用而被切割。在一些实施方案中，等位基因是clta基因、vegf基因、pcdh15基因或fam19a2基因的等位基因。参见例如实施例。如本文所用，术语“增殖性疾病”是指其中细胞或组织稳态受到干扰，使得细胞或细胞群表现出异常升高的增殖速率的任何疾病。增殖性疾病包括过度增殖性疾病，如新生前期增生性状况和新生性疾病。新生性疾病的特征是细胞的异常增殖，并包括良性和恶性新生物两者。恶性新生物也称为癌症。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法可用于治疗增殖性疾病。例如，在一些实施方案中，药物组合物包含cas9(例如，fcas9)蛋白和适合于将cas9蛋白靶向到vegf等位基因的grna，其中等位基因通过cas9蛋白的作用而失活。参见例如实施例。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常，蛋白质、肽或多肽将是至少三个氨基酸长。蛋白质、肽或多肽可以指个别的蛋白质或蛋白质的集合。蛋白质、肽或多肽中的一个或多个氨基酸可以被修饰，例如通过添加化学实体如碳水化合物基团、羟基、磷酸基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团，用于缀合、官能化或其他修饰的接头等。蛋白质、肽或多肽也可以是单个分子或者可以是多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可以仅仅是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可以是天然存在的、重组的或合成的，或其任何组合。如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质域的杂合多肽。一种蛋白质可以位于融合蛋白的氨基端(n端)部分或羧基端(c端)蛋白质，从而分别形成“氨基端融合蛋白”或“羧基端融合蛋白”。本文提供的任何蛋白质可以通过本领域已知的任何方法产生。例如，本文提供的蛋白质可以经由重组蛋白质表达和纯化产生，其特别适用于包含肽接头的融合蛋白。用于重组蛋白质表达和纯化的方法是熟知的，并且包括greenandsambrook,molecularcloning:alaboratorymanual(4thed.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2012))描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。本文提及的特定融合蛋白是reccas9，一种通过将催化无活性的dcas9融合至重组酶的催化域创建的rna编程的小丝氨酸重组酶，其能够在哺乳动物细胞中发挥功能。如本文所讨论的“假gix”位点或“gix假位点”是类似于gix重组酶的天然dna识别序列的特定的假回文核心dna序列。参见例如n.d.f.grindley,k.l.whiteson,p.a.rice,mechanismsofsite-specificrecombination.annurevbiochem75,567-605(2006)，以其全部内容通过引用并入本文。类似地，“假hix”或“hix假位点”；“假six”或“six假位点”；“假resh”或“resh假位点”；“假res”或“res假位点”；“假loxp”或“loxp假位点”；“假att”或“att假位点”；“假ftr”或“ftr假位点”是类似于hin重组酶、β重组酶、sin重组酶、tn3或γδ重组酶、cre重组酶、λ噬菌体整合酶或flp重组酶的天然dna识别序列的特定的假回文核心dna序列。术语“rna-可编程核酸酶”和“rna引导的核酸酶”在本文中可互换使用，并且是指与一个或多个不是切割靶标的rna形成复合物(例如，结合或缔合)的核酸酶。在一些实施方案中，当与rna形成复合物时，rna-可编程核酸酶可以称为核酸酶:rna复合物。通常，结合的rna称为引导rna(grna)。grna可以作为两个或更多个rna的复合物或者作为单个rna分子存在。作为单个rna分子存在的grna可以称为单引导rna(sgrna)，尽管“grna”可互换使用以指作为单个分子或作为两个或更多个分子的复合物存在的引导rna。通常，作为单一rna种类存在的grna包含两个域：(1)与靶核酸共享同源性(例如，并引导cas9复合物与靶物的结合)的域；和(2)结合cas9蛋白的域。在一些实施方案中，域(2)对应已知为tracrrna的序列，并且包含茎-环结构。例如，在一些实施方案中，域(2)与jineketal.,science337:816-821(2012)的图1e中描绘的tracrrna同源，其全部内容通过引用并入本文。grna的其他实例(例如包括域2的那些)可以在2013年9月6日提交的题为“switchablecas9nucleasesandusesthereof”的美国临时专利申请u.s.s.n.61/874,682；2013年9月6号提交的题为“deliverysystemforfunctionalnucleases”的美国临时专利申请u.s.s.n.61/874,746；2013年3月15日提交的题为“methodsandcompositionsforrna-directedtargetdnamodificationandforrna-directedmodulationoftranscription”的pct申请wo2013/176722；和2013年3月20日提交的题为“rna-directeddnacleavagebythecas9-crrnacomplex”的pct申请wo2013/142578中找到，每篇的全部内容通过引用以其整体并入本文。本文提供了grna的其他实例。参见例如实施例。在一些实施方案中，grna包含域(1)和(2)中的两个或更多个，并且可以称为“延伸的grna”。例如，延伸的grna将例如结合两个或更多个cas9蛋白并在两个或更多个不同区域处结合靶核酸，如本文所述。grna包含与靶位点互补的核苷酸序列，其介导核酸酶/rna复合物与所述靶位点的结合，提供了核酸酶:rna复合物的序列特异性。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是rna-可编程核酸酶如(crispr相关系统)(crispr-associatedsystem)cas9内切核酸酶，例如来自酿脓链球菌的cas9(csn1)(参见例如“completegenomesequenceofanm1strainofstreptococcuspyogenes.”ferrettij.j.,mcshanw.m.,ajdicd.j.,savicd.j.,savicg.,lyonk.,primeauxc.,sezates.,suvorova.n.,kentons.,laih.s.,lins.p.,qiany.,jiah.g.,najarf.z.,renq.,zhuh.,songl.,whitej.,yuanx.,cliftons.w.,roeb.a.,mclaughlinr.e.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.98:4658-4663(2001)；“crisprrnamaturationbytrans-encodedsmallrnaandhostfactorrnaseiii.”deltchevae.,chylinskik.,sharmac.m.,gonzalesk.,chaoy.,pirzadaz.a.,eckertm.r.,vogelj.,charpentiere.,nature471:602-607(2011)；和“aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.”jinekm.,chylinskik.,fonfarai.,hauerm.,doudnaj.a.,charpentiere.science337:816-821(2012)，每篇的全部内容通过引用并入本文。因为rna-可编程核酸酶(例如cas9)使用rna:dna杂交来确定靶dna切割位点，所以这些蛋白质原则上能够切割由引导rna规定的任何序列。使用rna-可编程核酸酶例如cas9进行位点特异性切割(例如，以修饰基因组)的方法是本领域已知的(参见例如cong,l.etal.multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science339,819-823(2013)；mali,p.etal.rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9.science339,823-826(2013)；hwang,w.y.etal.efficientgenomeeditinginzebrafishusingacrispr-cassystem.naturebiotechnology31,227-229(2013)；jinek,m.etal.rna-programmedgenomeeditinginhumancells.elife2,e00471(2013)；dicarlo,j.e.etal.genomeengineeringinsaccharomycescerevisiaeusingcrispr-cassystems.nucleicacidsresearch(2013)；jiang,w.etal.rna-guidededitingofbacterialgenomesusingcrispr-cassystems.naturebiotechnology31,233-239(2013)；每篇的全部内容通过引用并入本文)。如本文所用，术语“重组酶”是指介导重组酶识别序列之间dna的重组的位点特异性酶，所述重组导致重组酶识别序列之间的dna片段的切除、整合、倒位或交换(例如，易位)。重组酶可以分为两个不同的家族：丝氨酸重组酶(例如，解离酶和转化酶)和酪氨酸重组酶(例如整合酶)。丝氨酸重组酶的实例包括但不限于，hin、gin、tn3、β-six、cinh、para、γδ、bxb1、φc31、tp901、tg1、r4、mr11、a118、u153和gp29。酪氨酸重组酶的实例包括但不限于，cre、flp、r、lambda、hk101、hk022和psam2。本文提及的gin重组酶可以是本领域已知的任何gin重组酶，其包括但不限于t.gajetal.,acomprehensiveapproachtozinc-fingerrecombinasecustomizationenablesgenomictargetinginhumancells.nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)中提出的gin重组酶,其通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中，gin重组酶催化域与seqidno:713中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在另一个实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于h106y，和/或i127l，和/或i136r和/或g137f的突变。在另一个实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于h106y、i127l、i136r和g137f的突变。在进一步的实施方案中，gin重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在具体的实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含seqidno:713。gin重组酶与gix靶位点(本文也称为“gix核心”、“最小gix核心”或“gix相关核心”序列)结合。最小gix核心重组酶位点是nnnnaaasswwsstttnnnn(seqidno:19)，其中n定义为任何氨基酸，w是a或t，并且s是g或c。gix靶位点可以包括本领域已知的任何其他突变。在某些实施方案中，gix靶位点与seqidno:19中所示的氨基酸序列具有大于90％、95％或99％的序列一致性。gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离可以是1至10个碱基对、3至7个碱基对、5至7个碱基对或5至6个碱基对。gix核心或gix相关核心序列与至少一个grna结合位点之间的距离可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基对。丝氨酸和酪氨酸重组酶的名称源自重组酶用来攻击dna，并在链交换期间与dna共价连接的保守亲核氨基酸残基。重组酶具有许多应用，包括基因敲除/敲入的创建和基因治疗应用。参见例如brownetal.,“serinerecombinasesastoolsforgenomeengineering.”methods.2011；53(4):372-9；hiranoetal.,“site-specificrecombinasesastoolsforheterologousgeneintegration.”appl.microbiol.biotechnol.2011；92(2):227-39；chavezandcalos,“therapeuticapplicationsoftheφc31integrasesystem.”curr.genether.2011；11(5):375-81；turanandbode,“site-specificrecombinases:fromtag-and-target-totag-and-exchange-basedgenomicmodifications.”fasebj.2011；25(12):4088-107；venkenandbellen,“genome-widemanipulationsofdrosophilamelanogasterwithtransposons,flprecombinase,andφc31integrase.”methodsmol.biol.2012；859:203-28；murphy,“phagerecombinasesandtheirapplications.”adv.virusres.2012；83:367-414；zhangetal.,“conditionalgenemanipulation:creatinganewbiologicalera.”j.zhejianguniv.sci.b.2012；13(7):511-24；karpenshifandbernstein,“fromyeasttomammals:recentadvancesingeneticcontrolofhomologousrecombination.”dnarepair(amst).2012；1；11(10):781-8；每篇的全部内容以其整体在此通过引用并入。本文提供的重组酶不意味着是可以用于本发明的实施方案的重组酶的排他性实例。通过挖掘新的正交重组酶的数据库或设计具有限定的dna特异性的合成重组酶，可以扩展本发明的方法和组合物(参见例如，grothetal.,“phageintegrases:biologyandapplications.”j.mol.biol.2004；335,667-678；gordleyetal.,“synthesisofprogrammableintegrases.”proc.natl.acad.sci.usa.2009；106,5053-5058；每篇的全部内容以其整体在此通过引用并入)。可用于本文所述方法和组合物的重组酶的其他实例是本领域技术人员已知的，并且预期发现或产生的任何新重组酶能够用于本发明的不同实施方案中。在一些实施方案中，重组酶的催化域与核酸酶失活的rna-可编程核酸酶(例如，dcas9或其片段)融合，使得重组酶域不包含核酸结合域或不能结合随后导致酶促催化的靶核酸(例如，重组酶域经工程化改造以使其不具有特异性dna结合活性)。缺乏dna结合活性的部分的重组酶和独立于辅助蛋白起作用的重组酶以及其工程化方法是已知的，并且包括klippeletal.,“isolationandcharacterisationofunusualginmutants.”emboj.1988；7:3983–3989:burkeetal.,“activatingmutationsoftn3resolvasemarkinginterfacesimportantinrecombinationcatalysisanditsregulation.molmicrobiol.2004；51:937–948；olorunnijietal.,“synapsisandcatalysisbyactivatedtn3resolvasemutants.”nucleicacidsres.2008；36:7181–7191；rowlandetal.,“regulatorymutationsinsinrecombinasesupportastructure-basedmodelofthesynaptosome.”molmicrobiol.2009；74:282–298；akopianetal.,“chimericrecombinaseswithdesigneddnasequencerecognition.”procnatlacadsciusa.2003；100:8688–8691；gordleyetal.,“evolutionofprogrammablezincfinger-recombinaseswithactivityinhumancells.jmolbiol.2007；367:802–813；gordleyetal.,“synthesisofprogrammableintegrases.”procnatlacadsciusa.2009；106:5053–5058；arnoldetal.,“mutantsoftn3resolvasewhichdonotrequireaccessorybindingsitesforrecombinationactivity.”emboj.1999；18:1407–1414；gajetal.,“structure-guidedreprogrammingofserinerecombinasednasequencespecificity.”procnatlacadsciusa.2011；108(2):498-503；和proudfootetal.,“zincfingerrecombinaseswithadaptablednasequencespecificity.”plosone.2011；6(4):e19537描述的那些；每篇的全部内容在此通过引用并入。例如，解离酶-转化酶组的丝氨酸重组酶(例如tn3和γδ解离酶以及hin和gin转化酶)具有模块化结构，它们具有部分自主的催化和dna结合域(参见例如，grindleyetal.,“mechanismofsite-specificrecombination.”annrevbiochem.2006；75:567–605，其全部内容通过引用并入)。因此，这些重组酶的催化域适合于与如本文所述的核酸酶失活的rna-可编程核酸酶(例如，dcas9或其片段)重组，例如，在分离不需要任何辅助因素(例如dna结合活性)的“激活性”重组酶突变体之后(参见例如，klippeletal.,“isolationandcharacterisationofunusualginmutants.”emboj.1988；7:3983–3989:burkeetal.,“activatingmutationsoftn3resolvasemarkinginterfacesimportantinrecombinationcatalysisanditsregulation.molmicrobiol.2004；51:937–948；olorunnijietal.,“synapsisandcatalysisbyactivatedtn3resolvasemutants.”nucleicacidsres.2008；36:7181–7191；rowlandetal.,“regulatorymutationsinsinrecombinasesupportastructure-basedmodelofthesynaptosome.”molmicrobiol.2009；74:282–298；akopianetal.,“chimericrecombinaseswithdesigneddnasequencerecognition.”procnatlacadsciusa.2003；100:8688–8691)。另外，许多其他具有n端催化域和c端dna结合域的天然丝氨酸重组酶是已知的(例如，phic31整合酶、tnpx转座酶、is607转座酶)，并且它们的催化域可以增选用于工程化如本文所述的可编程位点特异性重组酶(参见例如，smithetal.,“diversityintheserinerecombinases.”molmicrobiol.2002；44:299–307，其全部内容通过引用并入)。类似地，酪氨酸重组酶(例如cre、λ整合酶)的核心催化域是已知的，并且可以类似地增选以工程化如本文所述的可编程位点特异性重组酶(参见例如guoetal.,“structureofcrerecombinasecomplexedwithdnainasite-specificrecombinationsynapse.”nature.1997；389:40–46；hartungetal.,“cremutantswithaltereddnabindingproperties.”jbiolchem1998；273:22884–22891；shaikhetal.,“chimerasoftheflpandcrerecombinases:testsofthemodeofcleavagebyflpandcre.jmolbiol.2000；302:27–48；rongrongetal.,“effectofdeletionmutationontherecombinationactivityofcrerecombinase.”actabiochimpol.2005；52:541–544；kilbrideetal.,“determinantsofproducttopologyinahybridcre-tn3resolvasesite-specificrecombinationsystem.”jmolbiol.2006；355:185–195；warrenetal.,“achimericcrerecombinasewithregulateddirectionality.”procnatlacadsciusa.2008105:18278–18283；vanduyne,“teachingcretofollowdirections.”procnatlacadsciusa.2009jan6；106(1):4-5；numrychetal.,“acomparisonoftheeffectsofsingle-baseandtriple-basechangesintheintegrasearm-typebindingsitesonthesite-specificrecombinationofbacteriophageλ.”nucleicacidsres.1990；18:3953–3959；tirumalaietal.,“therecognitionofcore-typednasitesbyλintegrase.”jmolbiol.1998；279:513–527；aiharaetal.,“aconformationalswitchcontrolsthednacleavageactivityofλintegrase.”molcell.2003；12:187–198；biswasetal.,“astructuralbasisforallostericcontrolofdnarecombinationbyλintegrase.”nature.2005；435:1059–1066；和warrenetal.,“mutationsintheamino-terminaldomainofλ-integrasehavedifferentialeffectsonintegrativeandexcisiverecombination.”molmicrobiol.2005；55:1104–1112；每篇的全部内容通过引用并入)。在核酸修饰(例如，基因组修饰)的背景下，术语“重组”用于指通过重组酶蛋白质(例如，本文提供的本发明的重组酶融合蛋白)的作用修饰两个或更多个核酸分子或单个核酸分子的两个或更多个区域的过程。重组尤其可以导致核酸的插入、倒位、切除或易位，例如在一个或多个核酸分子之中或之间。如本文中在蛋白质或核酸的背景中使用，术语“重组体(recombinant)”是指自然界中不存在，但是作为人工程化的产物的蛋白质或核酸。例如，在一些实施方案中，重组蛋白质或核酸分子包含相比于任何天然存在的序列包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个突变的氨基酸或核苷酸序列。如本文所用，术语“受试者”是指个体生物体，例如个体哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是啮齿动物。在一些实施方案中，受试者是绵羊、山羊、牛、猫或狗。在一些实施方案中，受试者是脊椎动物、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫、苍蝇或线虫。在一些实施方案中，受试者是研究动物。在一些实施方案中，受试者是经遗传工程化的，例如基因遗传化的非人受试者。受试者可以是任何一个性别和处于任何发展阶段的。在一些实施方案中，受试者是经遗传工程化的，例如基因遗传化的非人受试者。受试者可以是任何一个性别和处于任何发展阶段的。如本文在核酸酶的背景中使用，术语“靶核酸”和“靶基因组”分别指包含给定核酸酶的至少一个靶位点的核酸分子或基因组。在包含(核酸酶失活的)rna-可编程核酸酶和重组酶域的融合物的背景中，“靶核酸”和“靶基因组”分别指一个或多个包含至少一个靶位点的核酸分子或基因组。在一些实施方案中，靶核酸包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个或至少八个靶位点。在一些实施方案中，靶核酸包含四个靶位点。术语“靶位点”是指由重组酶(例如本文提供的dcas9-重组酶融合蛋白)结合并重组(例如在靶位点处或附近)的核酸分子内的序列。靶位点可以是单链或双链的。例如，在一些实施方案中，四个重组酶单体协调以重组靶核酸，每个单体与由grna引导的(核酸酶失活的)cas9蛋白融合。在此类实例中，每个cas9域由不同的grna引导以结合靶核酸，因此靶核酸包含四个靶位点，每个位点通过分开的dcas9-重组酶融合物靶向(从而协调重组靶核酸的四个重组酶单体)。对于rna引导的核酸酶失活的cas9(或其grna结合域)和本发明的cas9的融合物，在一些实施方案中，靶位点可以是17-20个碱基对加上3个碱基对pam(例如，nnn，其中n独立地代表任何核苷酸)。通常，pam的第一个核苷酸可以是任何核苷酸，而两个下游核苷酸是根据特定的rna引导的核酸酶指定的。用于rna引导的核酸酶(例如cas9)的示例性靶位点(例如，包含pam)是本领域技术人员已知的并且包括但不限于nng、ngn、nag和ngg，其中每个n独立地是任何核苷酸。另外，来自不同物种(例如嗜热链球菌而不是酿脓链球菌)的cas9核酸酶识别包含序列nggng(seqidno:763)的pam。另外的pam序列是已知的，包括但不限于nnagaaw(seqidno:749)和naar(seqidno:771)(参见例如，esveltandwang,molecularsystemsbiology,9:641(2013)，其全部内容通过引用并入本文)。在一些方面，rna引导的核酸酶(诸如例如cas9)的靶位点可以包含结构[nz]-[pam]，其中每个n独立地是任何核苷酸，并且z是1和50之间的整数，包括端点。在一些实施方案中，z是至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。在一些实施方案中，z是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。在一些实施方案中，z是20。在某些实施方案中，可以使用“无pam的”rna引导的核酸酶(例如，无pam的cas9)或如本文进一步描述的具有放松pam需求的rna引导的核酸酶。在一些实施方案中，“靶位点”还可以指核酸分子内被核酸酶结合但未切割的序列。例如，本文描述的某些实施方案提供包含无活性(或失活)cas9dna切割域的蛋白质。此类蛋白质(例如，当还包括cas9rna结合域时)能够结合由grna指定的靶位点；然而，因为dna切割位点被灭活，所以靶位点不被特定蛋白质切割。在一些实施方案中，此类蛋白质与重组酶(或重组酶的催化域)缀合、融合或结合，所述重组酶介导靶核酸的重组。在一些实施方案中，实际上切割或重组的序列将取决于介导核酸分子的切割或重组的蛋白质(例如，重组酶)或分子，并且在一些情况下，例如可与结合失活的cas9蛋白的接近性或距离有关。如本文所用，术语“转录激活物样效应物”(tale)是指包含dna结合域的细菌蛋白质，所述dna结合域含有包含高度可变的双氨基酸基序(重复可变双残基，rvd)的高度保守的33-34个氨基酸的序列。rvd基序决定了对核酸序列的结合特异性，并且可以根据本领域技术人员已知的方法进行工程化以特异性结合所期望的dna序列(参见例如，miller,jeffrey；et.al.(february2011).“atalenucleasearchitectureforefficientgenomeediting”.naturebiotechnology29(2):143–8；zhang,feng；et.al.(february2011).“efficientconstructionofsequence-specifictaleffectorsformodulatingmammaliantranscription”naturebiotechnology29(2):149–53；geiβler,r.；scholze,h.；hahn,s.；streubel,j.；bonas,u.；behrens,s.e.；boch,j.(2011),shiu,shin-han.ed.“transcriptionalactivatorsofhumangeneswithprogrammabledna-specificity”.plosone6(5):e19509；boch,jens(february2011).“talesofgenometargeting”.naturebiotechnology29(2):135–6；boch,jens；et.al.(december2009).“breakingthecodeofdnabindingspecificityoftal-typeiiieffectors”.science326(5959):1509–12；和moscou,matthewj.；adamj.bogdanove(december2009).“asimpleciphergovernsdnarecognitionbytaleffectors”science326(5959):1501；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。氨基酸序列和dna识别之间的简单关系允许通过选择含有适当rvd的重复区段的组合来工程化改造特定的dna结合域。如本文所用，术语“转录激活物样元件核酸酶”(talen)是指包含转录激活物样效应物dna结合域至dna切割域，例如foki域的人工核酸酶。已经报告了许多用于产生工程化tale构建体的模块化组装方案(参见例如，zhang,feng；et.al.(february2011).“efficientconstructionofsequence-specifictaleffectorsformodulatingmammaliantranscription”.naturebiotechnology29(2):149–53；geiβler,r.；scholze,h.；hahn,s.；streubel,j.；bonas,u.；behrens,s.e.；boch,j.(2011),shiu,shin-han.ed.“transcriptionalactivatorsofhumangeneswithprogrammabledna-specificity”.plosone6(5):e19509；cermak,t.；doyle,e.l.；christian,m.；wang,l.；zhang,y.；schmidt,c.；baller,j.a.；somia,n.v.etal.(2011).“efficientdesignandassemblyofcustomtalenandothertaleffector-basedconstructsfordnatargeting”.nucleicacidsresearch；morbitzer,r.；elsaesser,j.；hausner,j.；lahaye,t.(2011).“assemblyofcustomtale-typednabindingdomainsbymodularcloning”.nucleicacidsresearch；li,t.；huang,s.；zhao,x.；wright,d.a.；carpenter,s.；spalding,m.h.；weeks,d.p.；yang,b.(2011).“modularlyassembleddesignertaleffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes”.nucleicacidsresearch.；weber,e.；gruetzner,r.；werner,s.；engler,c.；marillonnet,s.(2011).bendahmane,mohammed.ed.“assemblyofdesignertaleffectorsbygoldengatecloning”.plosone6(5):e19722；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。术语“治疗/处理”是指如本文所述旨在逆转、缓解疾病或病症或其一种或多种症状、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或病症或其一种或多种症状进展的临床干预。如本文所用，术语“治疗/处理”是指如本文所述旨在逆转、缓解疾病或病症或其一种或多种症状、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制疾病或病症或其一种或多种症状进展的临床干预。在一些实施方案中，可以在一种或多种症状已经得以形成之后和/或疾病已经得到诊断之后施用治疗。在其他实施方案中，可以在没有症状的情况下施用治疗，例如用于预防或延迟症状的发作或抑制疾病的发作或进展。例如，可以在症状发作之前(例如，鉴于症状的历史和/或鉴于遗传或其他易感性因素)施用治疗于易感个体。治疗也可以在症状消退后继续进行，例如以预防或延迟其复发。术语“载体”是指包含一种或多种本发明的重组多核苷酸的多核苷酸，例如编码本文提供的cas9蛋白(或其融合物)和/或grna的那些。载体包括但不限于质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体和噬菌粒。载体可以能够在宿主细胞中复制，并且可以进一步通过一个或多个内切核酸酶限制性位点来表征，在该位点处可以切割载体并且可以在其中插入所期望的核酸序列。载体可以含有一种或多种适用于鉴定和/或选择已经用或尚未用载体转化或用载体进行基因组修饰的细胞的标志物序列。标志物包括例如编码增加或降低对抗生素(例如，卡那霉素、氨苄青霉素)或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测定法检测的酶(例如，β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或萤光素酶)的基因，以及可见地影响转化或转染细胞、宿主、菌落或噬斑的表型的基因。适用于转化本发明所囊括的宿主细胞(例如大肠杆菌、哺乳动物细胞如cho细胞、昆虫细胞等)的任何载体，例如属于puc系列、pgem系列、pet系列、pbad系列、ptet系列或pgex系列的载体。在一些实施方案中，载体适合于转化宿主细胞用于重组蛋白质生产。用于选择和工程化用于表达蛋白质(例如，本文提供的蛋白质)的载体和宿主细胞、转化细胞和表达/纯化重组蛋白质的方法是本领域熟知的，并且由例如greenandsambrook,molecularcloning:alaboratorymanual(4thed.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2012))提供。如本文所用，术语“锌指”是指以折叠和一个或多个稳定化折叠的锌离子的配位为特征的小核酸结合蛋白结构基序。锌指涵盖极其多种不同的蛋白质结构(参见例如kluga,rhodesd(1987).“zincfingers:anovelproteinfoldfornucleicacidrecognition”.coldspringharb.symp.quant.biol.52:473–82，其全部内容通过引用并入本文)。可以设计锌指以结合核苷酸的特定序列，并且可以设计包含一系列锌指的融合物的锌指阵列以结合实际上任何所期望的靶序列。此类锌指阵列可以形成蛋白质(例如核酸酶)的结合域，例如，在与核酸切割域缀合的情况下。不同类型的锌指基序是本领域技术人员已知的，包括但不限于cys2his2、gagknuckle、trebleclef、锌带(zincribbon)、zn2/cys6和taz2域样基序(参见例如krishnass,majumdari,grishinnv(january2003).“structuralclassificationofzincfingers:surveyandsummary”.nucleicacidsres.31(2):532–50)。通常，单一锌指基序结合核酸分子的3或4个核苷酸。因此，包含2个锌指基序的锌指域可以结合6-8个核苷酸，包含3个锌指基序的锌指域可以结合9-12个核苷酸，包含4个锌指基序的锌指域可以结合12-16个核苷酸，等等。可以采用任何合适的蛋白质工程化技术来改变锌指的dna结合特异性和/或设计新的锌指融合物以结合长度为3至30个核苷酸的实际任何所期望的靶序列(参见例如paboco,peisache,grantra(2001).“designandselectionofnovelcys2his2zincfingerproteins”.annualreviewofbiochemistry70:313–340；jamiesonac,millerjc,paboco(2003).“drugdiscoverywithengineeredzinc-fingerproteins”.naturereviewsdrugdiscovery2(5):361–368；和liuq,segaldj,ghiarajb,barbascf(may1997).“designofpolydactylzinc-fingerproteinsforuniqueaddressingwithincomplexgenomes”.proc.natl.acad.sci.u.s.a.94(11)；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。工程化锌指阵列和切割核酸的蛋白域之间的融合可以用于产生“锌指核酸酶”。锌指核酸酶通常包含结合核酸分子内特定靶位点的锌指域和切割由结合域结合的靶位点内或附近的核酸分子的核酸切割域。典型的工程化锌指核酸酶包含具有3和6个之间的个别锌指基序的结合域和长度范围为9个碱基对至18个碱基对的结合靶位点。在期望结合和切割给定基因组中独特的靶位点的情况下，较长的靶位点特别有吸引力。如本文所用，术语“锌指核酸酶”是指包含与包含锌指阵列的结合域缀合的核酸切割域的核酸酶。在一些实施方案中，切割域是ii型限制性内切核酸酶foki的切割域。可以设计锌指核酸酶以靶向给定核酸分子中的实际任何所期望的序列用于切割，并且设计锌指结合域以在复杂基因组的背景下结合独特位点的可能性允许活细胞中靶向切割单个基因组位点，例如，以实现治疗价值的靶向基因组改变。由于非同源dna修复途径的易错特性，将双链断裂靶向到期望的基因组基因座可以用于将移码突变引入基因的编码序列中。可以通过本领域技术人员熟知的方法产生锌指核酸酶以靶向感兴趣的位点。例如，可以通过组合已知特异性的个别锌指基序来设计具有所期望的特异性的锌指结合域。与dna结合的锌指蛋白zif268的结构已经为该领域的大量工作提供了信息，并且已经描述了为64个可能的碱基对三联体中的每一个获得锌指，然后混合和匹配这些模块化锌指以设计具有任何所期望的序列特异性的蛋白质的构思(pavletichnp,paboco(may1991).“zincfinger-dnarecognition:crystalstructureofazif268-dnacomplexat2.1a”.science252(5007):809–17，其全部内容并入本文)。在一些实施方案中，将各自识别3碱基对dna序列的单独的锌指组合以产生3-、4-、5-或6-指阵列，其识别长度范围为9个碱基对至18个碱基对的靶位点。在一些实施方案中，考虑了更长的阵列。在其他实施方案中，组合识别6-8个核苷酸的2指模块以产生4-、6-或8-锌指阵列。在一些实施方案中，采用细菌或噬菌体展示来开发识别所期望的核酸序列的锌指域，例如，长度为3-30bp的所期望的核酸酶靶位点。在一些实施方案中，锌指核酸酶包含经由接头(例如多肽接头)彼此融合或以其他方式彼此缀合的锌指结合域和切割域。接头的长度决定了切口与由锌指域结合的核酸序列的距离。若使用较短的接头，则切割域将使核酸切割得更接近结合的核酸序列，而较长的接头将导致切口和结合的核酸序列之间更大的距离。在一些实施方案中，锌指核酸酶的切割域必须二聚化以切割结合的核酸。在一些此类实施方案中，二聚体是两个单体的异源二聚体，每个单体包含不同的锌指结合域。例如，在一些实施方案中，二聚体可以包含一个包含与foki切割域缀合的锌指域a的单体，和一个包含与foki切割域缀合的锌指域b的单体。在该非限制性实例中，锌指域a结合靶位点的一侧上的核酸序列，锌指域b结合靶位点的另一侧上的核酸序列，并且二聚化foki域切割锌指域结合位点之间的核酸。发明详述从以下实施例将更全面地理解本发明的这些和其他实施方案的功能和优点。以下实施例旨在说明本发明的益处并描述特定实施方案，但并不旨在举例说明本发明的全部范围。因此，应当理解，实施例不意味着限制本发明的范围。引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白本文描述的融合蛋白和方法可以使用任何可编程的dna结合域。在一些实施方案中，可编程dna结合蛋白域包含锌指核酸酶(zfn)或转录激活物样效应域(tale)的dna结合域。在一些实施方案中，可编程dna结合蛋白域可以由引导核苷酸序列编程，并因此称为“引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域”。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是核酸酶无活性的cas9，或dcas9。如本文所用，dcas9涵盖cas9，其在其核酸酶活性中完全无活性，或在其核酸酶活性中部分无活性(例如，cas9切口酶)。因此，在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是cas9切口酶。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是核酸酶无活性的cpf1。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是核酸酶无活性的argonaute。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是dcas9域。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是cas9切口酶。在一些实施方案中，dcas9域包含seqidno:2或seqidno:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，dcas9域包含与本文提供的cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于seqidno:1中d10x(x是除d以外的任何氨基酸)和/或h840x(x是除h以外的任何氨基酸)的突变。在一些实施方案中，dcas9域包含与本文提供的cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于seqidno:1中d10a和/或h840a的突变。在一些实施方案中，cas9切口酶包含与本文提供的cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于seqidno:1中d10x(x是除以外的任何氨基酸d)的突变和对应于seqidno:1中位置840的位置处的组氨酸。在一些实施方案中，cas9切口酶包含与本文提供的cas9域的任一个至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同，并且包含对应于seqidno:1中d10a的突变和对应于seqidno:1中位置840的位置处的组氨酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，提供了dcas9或cas9切口酶的变体或同源物(例如，分别是seqidno:2或seqidno:3的变体)，其分别与seqidno:2或seqidno:3至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同、至少约99.5％相同或至少约99.9％相同，并且包含对应于seqidno:1中d10a和/或h840a的突变。在一些实施方案中，提供了cas9的变体(例如，seqidno:2的变体)，其具有比seqidno:2短或长约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或更多个的氨基酸序列，条件是dcas9变体包含对应于seqidno:1中的d10a和/或h840a的突变。在一些实施方案中，提供了cas9切口酶的变体(例如，seqidno:3的变体)，其具有比seqidno:3短或长约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸、约40个氨基酸、约50个氨基酸、约75个氨基酸、约100个氨基酸或更多个的氨基酸序列，条件是dcas9变体包含对应于d10a的突变并且包含对应于seqidno:1中位置840的位置处的组氨酸。基于本公开和本领域的知识，另外的合适的核酸酶无活性的dcas9域对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且在本公开的范围内。此类另外的示例性合适的核酸酶无活性的cas9域包括但不限于seqidno:1中的d10a/h840a、d10a/d839a/h840a、d10a/d839a/h840a/n863a突变体域(参见例如，prashantetal.,naturebiotechnology.2013；31(9):833-838，其通过引用并入本文)，或k603r(参见例如，chavezetal.,naturemethods12,326–328,2015，其通过引用并入本文)。在一些实施方案中，本文所述的核碱基编辑器包含与野生型cas9域相比，具有降低的cas9域与dna的糖-磷酸主链之间的静电相互作用的cas9域。在一些实施方案中，cas9域包含降低cas9域与dna的糖-磷酸主链之间的缔合的一个或多个突变。在一些实施方案中，本文所述的核碱基编辑器包含dcas9(例如，具有seqidno:1中d10a和h840a突变)或cas9切口酶(例如，具有seqidno:1中d10a突变)，其中dcas9或cas9切口酶进一步包含seqidno:10中提供的氨基酸序列的n497x、r661x、q695x和/或q926x突变，或seqidno:11-260中提供的任何氨基酸序列中相应的突变的一个或多个，其中x是任何氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的核碱基编辑器包含dcas9(例如，具有seqidno:1中d10a和h840a突变)或cas9切口酶(例如，具有seqidno:1中d10a突变)，其中dcas9或cas9切口酶进一步包含seqidno:10中提供的氨基酸序列的n497a、r661a、q695a和/或q926a突变，或seqidno:11-260中提供的任何氨基酸序列中相应的突变的一个或多个。在一些实施方案中，cas9域(例如本文提供的任何核碱基编辑器的cas9域)包含如seqidno:720中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核碱基编辑器包含如seqidno:721中所示的氨基酸序列。具有高保真度的cas9域在本领域中是已知的，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如，具有高保真度的cas9域已经描述于kleinstiver,b.p.,etal.“high-fidelitycrispr-cas9nucleaseswithnodetectablegenome-wideoff-targeteffects.”nature529,490-495(2016)；和slaymaker,i.m.,etal.“rationallyengineeredcas9nucleaseswithimprovedspecificity.”science351,84-88(2015)中；其每一个的全部内容通过引用并入本文。具有降低的cas9与dna主链之间的静电相互作用的cas9变体dkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtafdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgalsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmalihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetraitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:720)高保真度核碱基编辑器mssetgpvavdptlrrriephefevffdprelrketcllyeinwggrhsiwrhtsqntnkhvevnfiekftteryfcpntrcsitwflswspcgecsraiteflsryphvtlfiyiarlyhhadprnrqglrdlissgvtiqimteqesgycwrnfvnyspsneahwpryphlwvrlyvlelyciilglppclnilrrkqpqltfftialqschyqrlpphilwatglksgsetpgtsesatpesdkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtafdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgalsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmalihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdhivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetraitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:721)cas9蛋白识别靶dna序列内的短基序(pam基序)，其是cas9-dna相互作用所需要的，但不是由与引导rna核苷酸序列的互补性确定的。如本文所用，“pam基序”或“前间隔区相邻基序”是指直接在与引导rna寡核苷酸序列互补的dna序列后5'-或3'-的dna序列。若其随后没有合适的pam序列，cas9将不会成功结合、切割或切口靶dna序列。不希望受任何特定理论的束缚，cas9酶中的特定氨基酸残基负责与pam的碱基相互作用并确定pam特异性。因此，这些残基或附近残基的变化导致不同或放松的pam特异性。改变或放松pam特异性可以转变cas9可以结合的位置，如基于本公开对于本领域技术人员显而易见的。野生型酿脓链球菌cas9识别规范pam序列(5'-ngg-3')。其他cas9核酸酶(例如来自嗜热链球菌(streptococcusthermophiles)、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)或齿垢密螺旋体(treponemadenticolaor)的cas9)及其cas9变体已在本领域中描述为具有不同的或更放松的pam需求。例如，在kleinstiveretal.,nature523,481–485,2015；klenstiveretal.,nature529,490–495,2016；ranetal.,nature,apr9；520(7546):186–191,2015；kleinstiveretal.,natbiotechnol,33(12):1293-1298,2015；houetal.,procnatlacadsciusa,110(39):15644-9,2014；prykhozhijetal.,plosone,10(3):e0119372,2015；zetscheetal.,cell163,759–771,2015；gaoetal.,naturebiotechnology,doi:10.1038/nbt.3547,2016；wantetal.,nature461,754–761,2009；chavezetal.,doi:dx.doidotorg/10.1101/058974；fagerlundetal.,genomebiol.2015；16:25,2015；zetscheetal.,cell,163,759–771,2015；和swartsetal.,natstructmolbiol,21(9):743-53,2014中，其每一个通过引用并入本文。因此，本公开的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以识别多种pam序列，包括但不限于在由引导rna确定的dna序列的3'或5'末端上的pam序列。例如，序列可以是：ngg、ngan(seqidno:741)、ngng(seqidno:742)、ngag(seqidno:743)、ngcg(seqidno:744)、nngrrt(seqidno:745)、ngrrn(seqidno:746)、nnnrrt(seqidno:747)、nnngatt(seqidno:748)、nnagaaw(seqidno:749)、naaac(seqidno:750)、ttn、tttn(seqidno:751)和ytn，其中y是嘧啶，r是嘌呤，并且n是任何核碱基。本公开的一些方面提供了rna-可编程dna结合蛋白，其可以用于将蛋白质(例如碱基编辑器)引导至特定核酸(例如dna或rna)序列。核酸可编程dna结合蛋白包括但不限于cas9(例如dcas9和ncas9)、casx、casy、cpf1、c2c1、c2c2、c2c3和argonaute。具有不同的pam特异性的rna-可编程dna结合蛋白的一个实例是来自普雷沃氏菌(prevotella)和弗朗西斯菌(francisella)1(cpf1)的聚簇规则间隔短回文重复。与cas9类似，cpf1也是2类crispr效应物。已经显示，cpf1介导了强大的dna干扰，其具有与cas9不同的特征。cpf1是缺乏tracrrna的单个rna引导的内切核酸酶，并且它可以利用富含t的前间隔区相邻基序(例如ttn、tttn(seqidno:751)或ytn)，其在由引导rna确定的dna序列的5’端上。此外，cpf1经由交错的dna双链断裂切割dna。在16种cpf1家族蛋白中，来自氨基酸球菌(acidaminococcus)和毛螺菌(lachnospiraceae)的两种酶显示在人细胞中具有有效的基因组编辑活性。cpf1蛋白是本领域已知的并且先前已有描述，例如yamanoetal.,“crystalstructureofcpf1incomplexwithguidernaandtargetdna.”cell(165)2016,p.949-962；其全部内容在此通过引用并入。在本组合物和方法中也有用的是核酸酶无活性的cpf1(dcpf1)变体，其可以用作引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域。cpf1蛋白具有ruvc样内切核酸酶域，其类似于cas9的ruvc域，但不具有hnh内切核酸酶域，并且cpf1的n端不具有cas9的alfa螺旋识别叶(lobe)。它在zetscheetal.,cell,163,759–771,2015(其通过引用并入本文)中显示，cpf1的ruvc样域负责切割两条dna链并且ruvc样域的失活使cpf1核酸酶活性失活。例如，对应于新凶手弗朗西斯菌(francisellanovicida)cpf1(seqidno:714)中的d917a、e1006a或d1255a的突变使cpf1核酸酶活性失活。在一些实施方案中，本公开的dcpf1包含对应于seqidno:714中d917a、e1006a、d1255a、d917a/e1006a、d917a/d1255a、e1006a/d1255a或d917a/e1006a/d1255a的突变。在其他实施方案中，本公开的cpf1切口酶可以包含对应于seqidno:714中d917a、e1006a、d1255a、d917a/e1006a、d917a/d1255a、e1006a/d1255a或d917a/e1006a/d1255a的突变。有用于本公开的实施方案的cpf1切口酶可以包含其他突变和/或本领域已知的其他突变。应当理解，可以根据本公开使用使cpf1的ruvc域完全或部分失活的任何突变，例如取代突变、缺失或插入，以及cpf1的这些突变可以产生例如dcpf1或cpf1切口酶。因此，在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是核酸酶无活性的cpf1(dcpf1)。在一些实施方案中，dcpf1包含seqidno:714-717的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，dcpf1包含与seqidno:714-717的任一个至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列，并且包含对应于seqidno:714中d917a、e1006a、d1255a、d917a/e1006a、d917a/d1255a、e1006a/d1255a或d917a/e1006a/d1255a的突变。根据本公开，来自其他细菌物种的cpf1也可以用作dcpf1或cpf1切口酶。野生型新凶手弗朗西斯菌cpf1(seqidno:714)(d917、e1006和d1255是粗体且加下划线的)新凶手弗朗西斯菌cpf1d917a(seqidno:715)新凶手弗朗西斯菌cpf1e1006a(seqidno:716)新凶手弗朗西斯菌cpf1d1255a(seqidno:717)除了cas9和cpf1之外，shmakovetal.,“discoveryandfunctionalcharacterizationofdiverseclass2crisprcassystems”,mol.cell,2015nov5；60(3):385–397已经描述了三种不同的2类crispr-cas系统(c2c1、c2c2和c2c3)，其全部内容在此通过引用并入。两个系统(c2c1和c2c3)的效应物含有与cpf1相关的ruvc样内切核酸酶域。第三个系统，c2c2含有具有两个预测的hepnrna酶域的效应物。与c2c1产生crisprrna不同，成熟crisprrna的产生是不依赖tracrrna的。c2c1依赖于crisprrna和tracrrna两者用于dna切割。已显示细菌性c2c2对于crisprrna成熟具有独特的rna酶活性，不同于其rna激活的单链rna降解活性。这些rna酶功能彼此不同，并且与cpf1的crisprrna加工行为不同。参见例如，east-seletsky,etal.,“twodistinctrnaseactivitiesofcrispr-c2c2enableguide-rnaprocessingandrnadetection”,nature,2016oct13；538(7624):270-273，其全部内容在此通过引用并入。leptotrichiashahii中c2c2的体外生化分析已显示，c2c2由单个crisprrna引导，并且可以编程以切割携带互补前间隔区的ssrna靶标。两个保守的hepn域中的催化残基介导切割。催化残基中的突变产生催化无活性的rna结合蛋白。参见例如abudayyehetal.,“c2c2isasingle-componentprogrammablerna-guidedrna-targetingcrispreffector”,science,2016aug5；353(6299)，其全部内容在此通过引用并入。已经报告了与嵌合单分子引导rna(sgrna)复合的酸土脂环酸芽孢杆菌(alicyclobaccillusacidoterrastris)c2c1(aacc2c1)的晶体结构。参见例如，liuetal.,“c2c1-sgrnacomplexstructurerevealsrna-guideddnacleavagemechanism”,mol.cell,2017jan19；65(2):310-322，其全部内容在此通过引用并入。还已经报告了在与靶dna结合的酸土脂环酸芽孢杆菌c2c1中作为三元复合物的晶体结构。参见例如，yangetal.,“pam-dependenttargetdnarecognitionandcleavagebyc2c1crispr-casendonuclease”,cell,2016dec15；167(7):1814-1828，其全部内容在此通过引用并入。具有靶dna链和非靶dna链两者的aacc2c1的催化能力构象已被独立地捕获定位在单个ruvc催化袋内，其中c2c1介导的切割导致靶dna的交错的七核苷酸断裂。c2c1三元复合物与先前鉴定的cas9和cpf1对应物之间的结构比较证明了crispr-cas9系统使用的机制的多样性。在一些实施方案中，本文提供的任何融合蛋白的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白可以是c2c1、c2c2或c2c3蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是c2c1蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是c2c2蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是c2c3蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白包含与天然存在的c2c1、c2c2或c2c3蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白是天然存在的c2c1、c2c2或c2c3蛋白。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白包含本文所述的任何c2c1、c2c2或c2c3蛋白至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白包含本文所述的c2c1、c2c2或c2c3蛋白的任一个的氨基酸序列。应当理解，根据本公开也可以使用来自其他细菌物种的c2c1、c2c2或c2c3。c2c1(uniprot.org/uniprot/t0d7a2#)sp|t0d7a2|c2c1_aliagcrispr相关的内切核酸酶c2c1os＝酸土脂环酸芽孢杆菌(菌株atcc49025/dsm3922/cip106132/ncimb13137/gd3b)gn＝c2c1pe＝1sv＝1mavksikvklrlddmpeiraglwklhkevnagvryytewlsllrqenlyrrspngdgeqecdktaeeckaellerlrarqvenghrgpagsddellqlarqlyellvpqaigakgdaqqiarkflspladkdavgglgiakagnkprwvrmreagepgweeekekaetrksadrtadvlraladfglkplmrvytdsemssvewkplrkgqavrtwdrdmfqqaiermmsweswnqrvgqeyaklveqknrfeqknfvgqehlvhlvnqlqqdmkeaspgleskeqtahyvtgralrgsdkvfekwgklapdapfdlydaeiknvqrrntrrfgshdlfaklaepeyqalwredasfltryavynsilrklnhakmfatftlpdatahpiwtrfdklggnlhqytflfnefgerrhairfhkllkvengvarevddvtvpismseqldnllprdpnepialyfrdygaeqhftgefggakiqcrrdqlahmhrrrgardvylnvsvrvqsqseargerrppyaavfrlvgdnhrafvhfdklsdylaehpddgklgsegllsglrvmsvdlglrtsasisvfrvarkdelkpnskgrvpfffpikgndnlvavhersqllklpgeteskdlraireerqrtlrqlrtqlaylrllvrcgsedvgrrerswaklieqpvdaanhmtpdwreafenelqklkslhgicsdkewmdavyesvrrvwrhmgkqvrdwrkdvrsgerpkirgyakdvvggnsieqieylerqykflkswsffgkvsgqviraekgsrfaitlrehidhakedrlkkladriimealgyvyaldergkgkwvakyppcqlilleelseyqfnndrppsennqlmqwshrgvfqelinqaqvhdllvgtmyaafssrfdartgapgircrrvparctqehnpepfpwwlnkfvvehtldacplraddliptgegeifvspfsaeegdfhqihadlnaaqnlqqrlwsdfdisqirlrcdwgevdgelvliprltgkrtadsysnkvfytntgvtyyerergkkrrkvfaqeklseeeaellveadeareksvvlmrdpsgiinrgnwtrqkefwsmvnqriegylvkqirsrvplqdsacentgdi(seqidno:762)c2c2(uniprot.org/uniprot/p0doc6)>sp|p0doc6|c2c2_lepsdcrispr相关的内切核糖核酸酶c2c2os＝leptotrichiashahii(菌株dsm19757/ccug47503/cip107916/jcm16776/lb37)gn＝c2c2pe＝1sv＝1mgnlfghkrwyevrdkkdfkikrkvkvkrnydgnkyilninennnkekidnnkfirkyinykkndnilkeftrkfhagnilfklkgkegiiriennddfleteevvlyieaygkseklkalgitkkkiideairqgitkddkkieikrqeneeeieidirdeytnktlndcsiilriiendeletkksiyeifkninmslykiiekiienetekvfenryyeehlrekllkddkidviltnfmeirekiksnleilgfvkfylnvggdkkksknkkmlvekilninvdltvediadfvikelefwnitkriekvkkvnneflekrrnrtyiksyvlldkhekfkierenkkdkivkffveniknnsikekiekilaefkidelikklekelkkgncdteifgifkkhykvnfdskkfskksdeekelykiiyrylkgriekilvneqkvrlkkmekieiekilnesilsekilkrvkqytlehimylgklrhndidmttvntddfsrlhakeeldlelitffastnmelnkifsreninndenidffggdreknyvldkkilnskikiirdldfidnknnitnnfirkftkigtnernrilhaiskerdlqgtqddynkviniiqnlkisdeevskalnldvvfkdkkniitkindikiseennndikylpsfskvlpeilnlyrnnpknepfdtietekivlnaliyvnkelykklileddleeneskniflqelkktlgnideideniienyyknaqisaskgnnkaikkyqkkviecyigylrknyeelfdfsdfkmniqeikkqikdindnktyeritvktsdktivinddfeyiisifallnsnavinkirnrffatsvwlntseyqniidildeimqlntlrnecitenwnlnleefiqkmkeiekdfddfkiqtkkeifnnyyediknniltefkddingcdvlekklekivifddetkfeidkksnilqdeqrklsninkkdlkkkvdqyikdkdqeikskilcriifnsdflkkykkeidnliedmesenenkfqeiyypkerknelyiykknlflnignpnfdkiyglisndikmadakflfnidgknirknkiseidailknlndklngyskeykekyikklkenddffakniqnknyksfekdynrvseykkirdlvefnylnkiesylidinwklaiqmarferdmhyivnglrelgiiklsgyntgisraypkrngsdgfytttayykffdeesykkfekicygfgidlsenseinkpenesirnyishfyivrnpfadysiaeqidrvsnllsystrynnstyasvfevfkkdvnldydelkkkfklignndilerlmkpkkvsvlelesynsdyiknliielltkientndtl(seqidno:764)在一些实施方案中，本公开的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白对pam序列没有需求。此类引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白的一个实例可以是来自格氏嗜盐碱杆菌(natronobacteriumgregoryi)的argonaute蛋白(ngago)。ngago是ssdna引导的内切核酸酶。ngago结合约24个核苷酸的5′磷酸化ssdna(gdna)，以将其引导至其靶位点，并将在gdna位点处产生dna双链断裂。与cas9相比，ngago-gdna系统不需要前间隔区相邻基序(pam)。使用核酸酶无活性的ngago(dngago)可以极大地扩展可以靶向的密码子。ngago的表征和使用已经描述于gaoetal.,natbiotechnol.,2016jul；34(7):768-73.pubmedpmid:27136078；swartsetal.,nature.507(7491)(2014):258-61；和swartsetal.,nucleicacidsres.43(10)(2015):5120-9，其每一个通过引用并入本文。格氏嗜盐碱杆菌argonaute的序列提供于seqidno:718中。野生型格氏嗜盐碱杆菌argonaute(seqidno:718)mtvidldstttadeltsghtydisvtltgvydntdeqhprmslafeqdngerryitlwknttpkdvftydyatgstyiftnidyevkdgyenltatyqttvenataqevgttdedetfaggepldhhlddalnetpddaetesdsghvmtsfasrdqlpewtlhtytltatdgaktdteyarrtlaytvrqelytdhdaapvatdglmlltpeplgetpldldcgvrveadetrtldyttakdrllarelveeglkrslwddylvrgidevlskepvltcdefdlherydlsvevghsgraylhinfrhrfvpkltladidddniypglrvkttyrprrghivwglrdecatdslntlgnqsvvayhrnnqtpintdlldaieaadrrvvetrrqghgddavsfpqellavepnthqikqfasdgfhqqarsktrlsasrcsekaqafaerldpvrlngstvefssefftgnneqqlrllyengesvltfrdgargahpdetfskgivnppesfevavvlpeqqadtckaqwdtmadllnqagapptrsetvqydafsspesislnvagaidpsevdaafvvlppdqegfadlasptetydelkkalanmgiysqmayfdrfrdakifytrnvalgllaaaggvafttehampgdadmfigidvsrsypedgasgqiniaatatavykdgtilghsstrpqlgeklqstdvrdimknailgyqqvtgespthivihrdgfmnedldpateflneqgveydiveirkqpqtrllavsdvqydtpvksiaainqnepratvatfgapeylatrdggglprpiqiervagetdietltrqvyllsqshiqvhnstarlpittayadqasthatkgylvqtgafesnvgfl本文还提供了具有放松的pam需求的cas9变体(无pam的cas9)。与如seqidno:1提供的酿脓链球菌cas9相比，无pam的cas9对靶序列表现出增加的活性，所述靶序列在其3'端处不包括规范的pam(例如，ngg)序列，例如活性增加至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍、至少1,000倍、至少5,000倍、至少10,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍、至少500,000倍或至少1,000,000倍。此类具有放松的pam需求的cas9变体描述于2015年10月23日提交的美国临时申请，ussn62/245,828；2016年1月15日提交的62/279,346；2016年3月22日提交的62/311,763；2016年4月13日提交的62/322,178；和2016年6月30日提交的62/357,332，其每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中，可用于本公开的dcas9或cas9切口酶可以进一步包含放松pam需求的突变，例如，对应于seqidno:1中a262t、k294r、s409i、e480k、e543d、m694i或e1219v的突变。本文讨论的一般结构中使用的“-”可以表示存在任选的接头。如本文所用，术语“接头”是指连接两个分子或部分，例如融合蛋白的两个域，诸如例如引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域和重组酶催化域的化学基团或分子。通常，接头位于两个基团、分子或其他部分之间或侧翼有两个基团、分子或其他部分，并且经由共价键与每一个连接，从而连接两者。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头的长度为5-100个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150或150-200个氨基酸。也考虑了更长或更短的接头。接头可以是本领域已知的任何形式。例如，街头可以是来自网站诸如www[dot]ibi[dot]vu[dot]nl/programs/linkerdbwww/或来自www[dot]ibi[dot]vu[dot]nl/programs/linkerdbwww/src/database.txt的接头。接头也可以是非结构化的、结构化的、螺旋形的或延伸的。在一些实施方案中，引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域和重组酶催化域经由接头彼此融合。可以采用引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域和重组酶催化域之间的各种接头长度和柔性度(例如，范围为从形式(gggs)n(seqidno:759)、(ggggs)n(seqidno:722)、(ggs)n和(g)n的柔性接头至形式(eaaak)n(seqidno:723)、sgsetpgtsesatpes(seqidno:724)的更刚性接头(参见例如guilingeretal.,nat.biotechnol.2014；32(6):577-82；其全部内容通过引用并入本文)、(xp)n或任何这些的组合，其中x是任何氨基酸并且n独立地是1至30之间的整数，以便实现对于特定应用的活性的最佳长度。在一些实施方案中，n独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，或者若存在超过一个接头或超过一个接头基序，其任何组合。在一些实施方案中，接头包含(ggs)n基序，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，接头包含(ggs)n基序，其中n是1、3或7。在一些实施方案中，接头包含xten接头。xten接头可以具有序列sgsetpgtsesatpes(seqidno:7)、sgsetpgtsesa(seqidno:8)或sgsetpgtsesatpeggsggs(seqidno:9)。在一些实施方案中，接头包含选自下组的氨基酸序列，其包括但不限于agvf(seqidno:772)、gflg(seqidno:773)、fk、al、alal(seqidno:774)和alala(seqidno:775)。在一些实施方案中，合适的接头基序和配置包括描述于chenetal.,fusionproteinlinkers:property,designandfunctionality.advdrugdelivrev.2013；65(10):1357-69(其通过引用并入本文)中的那些。在一些实施方案中，接头可以包含任何以下氨基酸序列：vpfllepdningktc(seqidno:10)、gsagsaagsgef(seqidno:11)、sivaqlsrpdpa(seqidno:12)、mkiieqlpsa(seqidno:13)、vrhklkrvgs(seqidno:14)、ghgtgstgsgss(seqidno:15)、msrpdpa(seqidno:16)、gsagsaagsgef(seqidno:7)、sgsetpgtsesa(seqidno:8)、sgsetpgtsesatpeggsggs(seqidno:9)和ggsm(seqidno:17)。基于本公开，另外的合适的接头序列对于本领域技术人员而言将是显而易见的。在某些实施方案中，接头可以具有约33埃至约81埃的长度。在另一个实施方案中，接头可以具有约54埃至约81埃的长度。在进一步的实施方案中，接头可以具有约63至约81埃的长度。在另一个实施方案中，接头可以具有约65埃至约75埃的长度。在一些实施方案中，接头可以具有约1.20kda至约1.85kda的重量。在某些实施方案中，接头可以具有约1.40kda至约1.85kda的重量。在某些实施方案中，接头可以具有约1.60kda至约1.7kda的重量。在一些实施方案中，接头是一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)。在一些实施方案中，接头是有机分子、基团、聚合物或化学部分。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，肽接头是具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50或更多个氨基酸的任何段的氨基酸。在某些实施方案中，肽接头为18至27个氨基酸长。在具体的实施方案中，肽接头为24个氨基酸长。在一些实施方案中，肽接头包含三肽gly-gly-ser的重复，例如包含序列(ggs)n，其中n表示至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个重复。在一些实施方案中，接头包含序列(ggs)6(seqidno:6)。在一些实施方案中，肽接头是16个残基的“xten”接头或其变体(参见例如，实施例；和schellenbergeretal.arecombinantpolypeptideextendstheinvivohalf-lifeofpeptidesandproteinsinatunablemanner.nat.biotechnol.27,1186–1190(2009))。在一些实施方案中，xten接头包含序列sgsetpgtsesatpes(seqidno:7)、sgsetpgtsesa(seqidno:8)或sgsetpgtsesatpeggsggs(seqidno:9)。在一些实施方案中，肽接头选自vpfllepdningktc(seqidno:10)、gsagsaagsgef(seqidno:11)、sivaqlsrpdpa(seqidno:12)、mkiieqlpsa(seqidno:13)、vrhklkrvgs(seqidno:14)、ghgtgstgsgss(seqidno:15)、msrpdpa(seqidno:16)；或ggsm(seqidno:17)。在一些实施方案中，接头是非肽接头。在某些实施方案中，非肽接头包含以下的一个或多个：聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(poe)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。在一个实施方案中，烷基接头具有式—nh—(ch2)s—c(o)—，其中s可以是任何整数。在进一步的实施方案中，s可以是1-20的任何整数。重组酶催化域用于本公开的组合物和方法的重组酶催化域可以来自任何重组酶。用于所公开的方法和组合物的合适的重组酶催化域可以获得自例如但不限于酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶。本文提供的一些示例性合适的重组酶包括，例如但不限于，gin重组酶(作用于gix位点)、hin重组酶(作用于hix位点)、β重组酶(作用于6个位点)、sin重组酶(作用于resh位点)、tn3重组酶(作用于res位点)、γδ重组酶(作用于res位点)、来自噬菌体p1的cre重组酶(作用于loxp位点)；真菌来源的flp重组酶(作用于ftr位点)；和phic31整合酶(作用于att位点)。示例性合适的重组酶的非限制性序列可以在下面找到。cre重组酶序列msnlltvhqnlpalpvdatsdevrknlmdmfrdrqafsehtwkmllsvcrswaawcklnnrkwfpaepedvrdyllylqarglavktiqqhlgqlnmlhrrsglprpsdsnavslvmrrirkenvdagerakqalafertdfdqvrslmensdrcqdirnlaflgiayntllriaeiarirvkdisrtdggrmlihigrtktlvstagvekalslgvtklverwisvsgvaddpnnylfcrvrkngvaapsatsqlstralegifeathrliygakddsgqrylawsghsarvgaardmaragvsipeimqaggwtnvnivmnyirnldsetgamvrlledgd(seqidno:725)flp重组酶mpqfgilcktppkvlvrqfverferpsgekialcaaeltylcwmithngtaikratfmsyntiisnslsfdivnkslqfkyktqkatileaslkklipaweftiipyygqkhqsditdivsslqlqfesseeadkgnshskkmlkallsegesiweitekilnsfeytsrftktktlyqflflatfincgrfsdiknvdpksfklvqnkylgviiqclvtetktsvsrhiyffsargridplvyldeflrnsepvlkrvnrtgnsssnkqeyqllkdnlvrsynkalkknapysifaikngpkshigrhlmtsflsmkglteltnvvgnwsdkrasavarttythqitaipdhyfalvsryyaydpiskemialkdetnpieewqhieqlkgsaegsirypawngiisqevldylssyinrri(seqidno:726)γδ重组酶(gammadelta解离酶)mrlfgyarvstsqqsldiqvralkdagvkanriftdkasgsssdrkgldllrmkveegdvilvkkldrlgrdtadmiqlikefdaqgvsirfiddgistdgemgkmvvtilsavaqaerqrilertnegrqeamakgvvfgrkr(seqidno:727)γδ重组酶(e124q突变)mrlfgyarvstsqqsldiqvralkdagvkanriftdkasgsssdrkgldllrmkveegdvilvkkldrlgrdtadmiqlikefdaqgvsirfiddgistdgemgkmvvtilsavaqaerqrilqrtnegrqeamakgvvfgrkr(seqidno:728)γδ重组酶(e102y/e124q突变)mrlfgyarvstsqqsldiqvralkdagvkanriftdkasgsssdrkgldllrmkveegdvilvkkldrlgrdtadmiqlikefdaqgvsirfiddgistdgymgkmvvtilsavaqaerqrilqrtnegrqeamakgvvfgrkr(seqidno:729)β重组酶makigyarvsskeqnldrqlqalqgvskvfsdklsgqsverpqlqamlnyiregdivvvteldrlgrnnkeltelmnaiqqkgatlevldlpsmngiedenlrrlinnlvielykyqaeserkrikerqaqgieiakskgkfkgrqh(seqidno:730)β重组酶(n95d突变)makigyarvsskeqnldrqlqalqgvskvfsdklsgqsverpqlqamlnyiregdivvvteldrlgrnnkeltelmnaiqqkgatlevldlpsmdgiedenlrrlinnlvielykyqaeserkrikerqaqgieiakskgkfkgrqh(seqidno:731)sin重组酶miigyarvssldqnlerqlenlktfgaekiftekqsgksienrpilqkalnfvrmgdrfivesidrlgrnynevihtvnylkdkevqlmitslpmmnevignplldkfmkdliiqilamvseqerneskrrqaqgiqvakekgvykgrpl(seqidno:732)sin重组酶(q87r/q115r突变)miigyarvssldqnlerqlenlktfgaekiftekqsgksienrpilqkalnfvrmgdrfivesidrlgrnynevihtvnylkdkevrlmitslpmmnevignplldkfmkdliirilamvseqerneskrrqaqgiqvakekgvykgrpl(seqidno:733)tn3重组酶mrlfgyarvstsqqsldlqvralkdagvkanriftdkasgsstdregldllrmkvkegdvilvkkldrlgrdtadmlqlikefdaqgvavrfiddgistdgdmgqmvvtilsavaqaerrrilertnegrqeaklkgikfgrrr(seqidno:734)tn3重组酶(g70s/d102y、e124q突变)mrlfgyarvstsqqsldlqvralkdagvkanriftdkasgsstdregldllrmkvkegdvilvkkldrlsrdtadmlqlikefdaqgvavrfiddgistdgymgqmvvtilsavaqaerrrilqrtnegrqeaklkgikfgrrr(seqidno:735)hin重组酶matigyirvstidqnidlqrnaltsancdrifedrisgkianrpglkralkyvnkgdtlvvwkldrlgrsvknlvaliselhergahfhsltdsidtssamgrfffhvmsalaemerelivertlaglaaaraqgrlggrpv(seqidno:736)hin重组酶(h107y突变)matigyirvstidqnidlqrnaltsancdrifedrisgkianrpglkralkyvnkgdtlvvwkldrlgrsvknlvaliselhergahfhsltdsidtssamgrfffyvmsalaemerelivertlaglaaaraqgrlggrpv(seqidno:737)phic31重组酶mdtyagaydrqsrerenssaaspatqrsanedkaadlqreverdggrfrfvghfseapgtsafgtaerpeferilnecragrlnmiivydvsrfsrlkvmdaipivsellalgvtivstqegvfrqgnvmdlihlimrldashkesslksakildtknlqrelggyvggkapygfelvsetkeitrngrmvnvvinklahsttpltgpfefepdvirwwwreikthkhlpfkpgsqaaihpgsitglckrmdadavptrgetigkktassawdpatvmrilrdpriagfaaeviykkkpdgtpttkiegyriqrdpitlrpveldcgpiiepaewyelqawldgrgrgkglsrgqailsamdklycecgavmtskrgeesikdsyrcrrrkvvdpsapgqhegtcnvsmaaldkfvaerifnkirhaegdeetlallweaarrfgklteapeksgeranlvaeradalnaleelyedraagaydgpvgrkhfrkqqaaltlrqqgaeerlaeleaaeapklpldqwfpedadadptgpkswwgrasvddkrvfvglfvdkivvtksttgrgqgtpiekrasitwakpptdddeddaqdgtedvaatga(seqidno:738)与所公开的组合物和方法一起使用的重组酶还可以包括其他突变。该公开的一些方面提供了包含与本文所讨论的重组酶序列的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列的重组酶，其中与本文所讨论的重组酶序列的序列相比，重组酶的氨基酸序列包含至少一个突变。在一些实施方案中，与本文所讨论的重组酶序列的序列相比，重组酶的氨基酸序列包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个突变。例如，γδ重组酶可以包含来自列表的一个或多个突变：r2a、e56k、g101s、e102y、m103i或e124q。在一个实施方案中，γδ重组酶可以包含e102y突变、e124q突变或e102y和e124q突变两者。在另一个实施方案中，β重组酶可以包含一个或多个突变，其包括但不限于n95d。参见例如，sirketal.,“expandingthezinc-fingerrecombinaserepertoire:directedevolutionandmutationalanalysisofserinerecombinasespecificitydeterminants”nuclacidsres(2014)42(7):4755-4766。在另一个实施方案中，sin重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：q87r、q115r或q87r和q115r。在另一个实施方案中，tn3重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：g70s、d102y、e124q及其任何组合。在另一个实施方案中，hin重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：h107y。在另一个实施方案中，sin重组酶可以具有一个或多个突变，其包括但不限于：h107y。与所公开的组合物和方法一起使用的任何重组酶催化域可以与天然(或野生型)氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。例如，在某些实施方案中，gin重组酶催化域与seqidno:713中所示的氨基酸序列具有大于85％、90％、95％、98％或99％的序列一致性。在另一个实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于h106y，和/或i127l，和/或i136r和/或g137f的突变。在另一个实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含对应于h106y、i127l、i136r和g137f的突变。在进一步的实施方案中，gin重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。在具体的实施方案中，gin重组酶催化域的氨基酸序列包含seqidno:713。用于本公开的组合物和方法的重组酶催化域可以来自演化的重组酶。如本文所用，术语“演化的重组酶”是指已经改变(例如，通过突变)以识别非天然dna靶序列的重组酶。可以演化的合适的重组酶包括例如但不限于酪氨酸重组酶和丝氨酸重组酶(例如，本文讨论的任何重组酶)。可以通过本文提供的方法和策略演化的一些示例性合适的重组酶包括例如但不限于，gin重组酶(作用于gix位点)、hin重组酶(作用于hix位点)、β重组酶(作用于6个位点)、sin重组酶(作用于resh位点)、tn3重组酶(作用于res位点)、γδ重组酶(作用于res位点)、来自噬菌体p1的cre重组酶(作用于loxp位点)；λ噬菌体整合酶(作用于att位点)；真菌来源的flp重组酶(作用于ftr位点)；phic31整合酶；dre重组酶，bxb1；和原核β-重组酶。例如，可以改变与本公开的组合物和方法一起使用的演化的重组酶以与非规范重组酶靶序列相互作用(例如，结合和重组)。作为非限制性实例，非规范重组酶靶序列可以是天然存在的，诸如例如哺乳动物基因组中“安全港(safeharbor)”基因组基因座内的序列，例如已知对基因修饰耐受而没有任何不期望的影响的基因组基因座。靶向此类序列的重组酶允许例如在特定基因组位置处靶向插入核酸构建体，而不需要常规的时间和劳动密集型基因靶向规程，例如经由同源重组技术。此外，本文提供的定向演化策略可以用于演化具有改变的活性谱的重组酶，例如，有利于核酸序列的整合而不是该序列的切除的重组酶，或反之亦然。与其野生型对应物相比，演化的重组酶表现出改变的靶序列偏好，可以用于靶向用于重组酶活性的实际任何靶序列。因此，演化的重组酶可以用于修饰例如细胞或受试者的基因组内的任何序列。因为重组酶可以影响异源核酸分子插入到靶核酸分子中、从核酸分子中切除核酸序列、倒位或替换核酸序列，所以本文提供的技术能够以多种方式(例如，整合、缺失、倒位、交换核酸序列)有效修饰基因组靶标。来自与本公开的方法和组合物一起使用的演化的重组酶的催化域包含与野生型重组酶的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，其中与野生型重组酶的序列相比，演化的重组酶的氨基酸序列包含至少一个突变，并且其中演化的重组酶识别dna重组酶靶序列，其与规范重组酶靶序列相差至少一个核苷酸。在一些实施方案中，演化的重组酶识别dna重组酶靶序列，其与规范重组酶靶序列(例如，res、gix、hix、six、resh、loxp、ftr或att核心或相关核心序列)相差至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20至少25或至少30个核苷酸。在一些实施方案中，演化的重组酶识别dna重组酶靶序列，其与规范重组酶靶序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方案中，仅重组酶的一部分用于本文所述的融合蛋白和方法中。作为非限制性实施方案，仅重组酶的c端部分可以用于本文所述的融合蛋白和方法中。在具体的实施方案中，cre重组酶的25kda羧基末端域可以用于组合物和方法中。参见例如，hoessetal,“dnaspecificityofthecrerecombinaseresidesinthe25kdacarboxyldomainoftheprotein,”j.mol.bio.1990dec20,216(4):873-82，其出于所有目的通过引用并入本文。cre重组酶的25kda羧基末端域是从蛋白质的r118延伸至羧基末端的部分。在一些实施方案中，用于本发明融合蛋白和方法的cre重组酶的25kda羧基末端域可以与cre重组酶的规范25kda羧基末端域相差至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个氨基酸。在一些实施方案中，用于本发明融合蛋白和方法的cre重组酶的25kda羧基末端域可以与cre重组酶的规范25kda羧基末端域相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施方案中，仅cre重组酶的25kda羧基末端域的一部分可以用于本文所述的融合蛋白和方法中。例如，使用的cre重组酶的部分可以是r130至蛋白质的羧基末端、t140至蛋白质的羧基末端、e150至蛋白质的羧基末端、n160至蛋白质的羧基末端、t170至蛋白质的羧基末端、i180至蛋白质的羧基末端、g190至蛋白质的羧基末端、t200至蛋白质的羧基末端、e210至蛋白质的羧基末端、l220至蛋白质的羧基末端、v230至蛋白质的羧基末端、c240至蛋白质的羧基末端、p250至蛋白质的羧基末端、a260至蛋白质的羧基末端、r270至蛋白质的羧基末端、g280至蛋白质的羧基末端、s290至蛋白质的羧基末端、a300至蛋白质的羧基末端或m310至蛋白质的羧基末端。作为另一组非限制性实例，使用的cre重组酶的部分可以是r118-e340、r118-s330、r118-i320、r118-m310、r118-a300、r118-s290、r118-g280、r118-r270、r118-a260、r118-p250、r118-c240、r118-v230、r118-l220或r118-e210。作为进一步的一组非限制性实例，使用的cre重组酶的部分可以是r118-e210、g190-r270、e210-s290、p250-m310或r270至蛋白质的羧基末端。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白和方法中使用的cre重组酶可以在任何位置截短。在具体的实施方案中，本文所述的融合蛋白和方法中使用的cre重组酶可以截短，使得它以氨基酸r118、a127、e138或r154开始)(每种情况下其之前都是甲硫氨酸)。在另一组非限制性实施方案中，本文所述的融合蛋白和方法中使用的cre重组酶可以在r118、a127、e138或r154的10个氨基酸、9个氨基酸、8个氨基酸、7个氨基酸、6个氨基酸、5个氨基酸、4个氨基酸、3个氨基酸、2个氨基酸或1个氨基酸内截短。在一些实施方案中，重组酶靶序列为10-50个核苷酸之间长。在一些实施方案中，重组酶是cre重组酶、hin重组酶或flp重组酶。在一些实施方案中，规范重组酶靶序列是loxp位点(5′-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3′(seqidno:739)。在一些实施方案中，规范重组酶靶序列是frt位点(5'-gaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-3′)(seqidno:740)。在一些实施方案中，与野生型重组酶的序列相比，演化的重组酶的氨基酸序列包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个突变。在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含左半位点、间隔区序列和右半位点的dna重组酶靶序列，并且其中左半位点不是右半位点的回文序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含天然存在的序列的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含在哺乳动物的基因组中的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别包含在人的基因组中的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别在哺乳动物的基因组中仅发生一次的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的重组酶识别哺乳动物的基因组中的dna重组酶靶序列，其与基因组中的任何其他位点相差至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个核苷酸。在一些实施方案中，演化的重组酶识别位于安全港基因组基因座中的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，安全港基因组基因座是rosa26基因座。在一些实施方案中，演化的重组酶识别位于与疾病或病症相关的基因组基因座中的dna重组酶靶序列。在某些实施方案中，演化的重组酶可以靶向人基因组的rosa基因座中的位点(例如36c6)。此类重组酶的非限制性组可以在例如，2017年1月26日公开的国际pct公开wo2017/015545a1,题为“evolutionofsitespecificrecombinases,”中找到，其为此目的通过引用并入本文。在一些实施方案中，与野生型重组酶的序列相比，演化的重组酶的氨基酸序列包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个突变。编码36c6的核苷酸序列以粗体显示如下；编码ggs接头的那些以斜体显示；编码dcas9接头的那些为黑色；编码flag标签和nls的那些分别用下划线和小写字母表示。dcas9-36c6(核苷酸)(seqidno:765)dcas9-36c6(氨基酸)(seqidno:766)本公开的一些方面提供了演化的重组酶(例如cre重组酶)，其包含与本文讨论的重组酶序列(例如cre重组酶)的序列至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少97％相同的氨基酸序列，其中与本文讨论的重组酶(例如cre重组酶)的序列相比，重组酶(例如cre重组酶)的氨基酸序列包含至少一个突变，并且其中重组酶(例如cre重组酶)识别与规范loxp位点5′-ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat-3′(seqidno:739)相差至少一个核苷酸的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，与本文讨论的重组酶(例如cre重组酶)序列的序列相比，演化的重组酶(例如cre重组酶)的氨基酸序列包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个突变，并且识别与规范靶位点(例如loxp位点)相差至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个核苷酸的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别包含左半位点、间隔区序列和右半位点的dna重组酶靶序列，并且其中左半位点不是右半位点的回文序列。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别包含天然存在的序列的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别包含在哺乳动物的基因组中的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别包含在人的基因组中的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别在哺乳动物的基因组中仅包含一次的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别哺乳动物的基因组中的dna重组酶靶序列，其与基因组中的任何其他位点相差至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15个核苷酸。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别位于安全港基因组基因座中的dna重组酶靶序列。在一些实施方案中，安全港基因组基因座是rosa26基因座。在一些实施方案中，演化的cre重组酶识别位于与疾病或病症相关的基因组基因座中的dna重组酶靶序列。与本发明方法和组合物一起使用的另外的演化的重组酶(及其制备方法)可以在例如美国专利申请号15/216,844中找到，其通过引用并入本文。对于提供重组酶催化域或演化的重组酶催化域两者，另外的合适的重组酶对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且此类合适的重组酶包括但不限于描述于hiranoetal.,site-specificrecombinasesastoolsforheterologousgeneintegration.applmicrobiolbiotechnol.2011oct；92(2):227-39；foggetal.,newapplicationsforphageintegrases.jmolbiol.2014jul29；426(15):2703；brownetal.,serinerecombinasesastoolsforgenomeengineering.methods.2011apr；53(4):372-9；smithetal.,site-specificrecombinationbyphic31integraseandotherlargeserinerecombinases.biochemsoctrans.2010apr；38(2):388-94；grindleyetal.,mechanismsofsite-specificrecombination.annurevbiochem.2006；75:567-605；smithetal.,diversityintheserinerecombinases.molmicrobiol.2002apr；44(2):299-307；graingeetal.,theintegrasefamilyofrecombinase:organizationandfunctionoftheactivesite.molmicrobiol.1999aug；33(3):449-56；gopauletal.,structureandmechanisminsite-specificrecombination.curropinstructbiol.1999feb；9(1):14-20；coxetal.,conditionalgeneexpressioninthemouseinnerearusingcre-loxp.jassocresotolaryngol.2012jun；13(3):295-322；birlingetal.,site-specificrecombinasesformanipulationofthemousegenome.methodsmolbiol.2009；561:245-63；和mishinam,sakimurak.conditionalgenetargetingonthepurec57bl/6geneticbackground.neuroscires.2007jun；58(2):105-12中的那些；其每一个的全部内容通过引用并入本文。融合蛋白的结构本公开的融合蛋白可以是本文所述的元件的任何组合和顺序。示例性融合蛋白包括但不限于任何以下结构：nh2-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-cooh、nh2-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh、nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh、nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[任选的接头序列]-[nls域]-cooh、nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[nls域]-cooh或nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构：nh2-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[任选的亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[亲和标签]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[亲和标签]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-cooh。在一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域]-[接头序列]-[重组酶催化域]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh.在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[任选的接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白具有结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[任选的nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[任选的亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[任选的接头序列]-[nls域]-[任选的接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。在另一个实施方案中，融合蛋白包含结构nh2-[亲和标签]-[接头序列]-[nls域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的n端部分]-[接头序列]-[重组酶催化域]-[接头序列]-[二分叉或环状置换的引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域的c端部分]-cooh。融合蛋白可以进一步包含一个或多个亲和标签。本文提供的合适的亲和标签包括但不限于生物素羧化酶载体蛋白(bccp)标签、myc标签、钙调蛋白标签、flag标签、血凝素(ha)标签、多组氨酸标签(也称为组氨酸标签或his标签)、多精氨酸(多arg)标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)-标签、nus标签、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)标签、绿色荧光蛋白(gfp)标签、硫氧还蛋白标签、s标签、softag(例如，softag1、softag3)、strep标签、生物素连接酶标签、flash标签、v5标签和sbp标签。另外的合适的序列对于本领域技术人员而言将是显而易见的。flag标签可以具有序列pkkkrkv(seqidno:702)。一个或多个亲和标签经由一个或多个第三接头与引导核苷酸序列-可编程dna结合蛋白域、重组酶催化域或nls域结合。第三接头可以是本文所述的任何肽接头。例如，第三接头可以是肽接头。作为非限制性组的实例，第三接头可以包含xten接头sgsetpgtsesatpes(seqidno:7)、sgsetpgtsesa(seqidno:8)或sgsetpgtsesatpeggsggs(seqidno:9)，包含三肽ggs的一个或多个重复的氨基酸序列，或任何以下氨基酸序列：vpfllepdningktc(seqidno:10)、gsagsaagsgef(seqidno:11)、sivaqlsrpdpa(seqidno:12)、mkiieqlpsa(seqidno:13)、vrhklkrvgs(seqidno:14)、ghgtgstgsgss(seqidno:15)、msrpdpa(seqidno:16)或ggsm(seqidno:17)。在某些实施方案中，第三接头包含三肽ggs的一个或多个重复。在实施方案中，第三接头包含三肽ggs的一个至五个重复。在实施方案中，第三接头包含三肽ggs的一个重复。在具体的实施方案中，第三接头具有序列ggs。第三接头也可以是非肽接头。在某些实施方案中，非肽接头包含聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、共聚(乙烯/丙烯)二醇、聚氧乙烯(poe)、聚氨酯、聚磷腈、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙醚、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、脂质聚合物、甲壳质、透明质酸、肝素或烷基接头。在其他实施方案中，烷基接头具有式—nh—(ch2)s—c(o)—，其中s可以是1和100之间的任何整数，包括端点。在具体的实施方案中，s是1和20之间的任何整数，包括端点。本公开的融合蛋白与seqidno:185的氨基酸1-1544中所示的氨基酸序列(其与seqidno:719中所示的序列相同)具有大于90％、95％或99％的序列一致性。mligyvrvstndqntdlqrnalvcagceqifedklsgtrtdrpglkralkrlqkgdtlvvwkldrlgrsmkhlislvgelrerginfrsltdsidtsspmgrfffyvmgalaemereliiertmaglaaarnkgrrfgrppkggsggsggsggsggsggsggsggsdkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdaivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggdggsdykddddk终止(seqidno:719)在二聚化(或多聚化)的蛋白质，诸如例如核酸酶失活的cas9(或cas9grna结合域)与重组酶(或重组酶的催化域)之间的融合的背景下，靶位点通常包含左半位点(由一种蛋白质结合)、右半位点(由第二种蛋白质结合)，以及在其中进行重组的半位点之间的间隔区序列。在一些实施方案中，重组左半位点或右半位点(而非间隔区序列)。在其他实施方案中，重组间隔区序列。该结构([左半位点]-[间隔区序列]-[右半位点])在本文中称为lsr结构。在一些实施方案中，左半位点和/或右半位点对应于rna引导的靶位点(例如，cas9靶位点)。在一些实施方案中，半位点中的任一个或两个比例如cas9靶向的典型区域更短或更长，例如短于或长于20个核苷酸。在一些实施方案中，左半位点和右半位点包含不同的核酸序列。在一些实施方案中，间隔区序列长度为至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200或至少250bp。在一些实施方案中，间隔区序列为约15bp和约25bp之间长。在一些实施方案中，间隔区序列为约15bp长。在一些实施方案中，间隔区序列为约25bp长。实施例实施例1：可编程cas9-丝氨酸重组酶融合蛋白，其在哺乳动物细胞中的dna序列上起作用材料和方法寡核苷酸和pcr所有寡核苷酸购自integrateddnatechnologies(idt，coralville，ca)并列于表1-5中。除非另有说明，否则酶购自newenglandbiolabs(ipswich，ma)。plasmidsafeatp依赖性dna酶购自epicenter(madison，wi)。将所有组装的载体转化到oneshotmach1-t1噬菌体抗性化学感受态细胞(fisherscientific，waltham，ma)。除非另有说明，否则所有pcr反应均使用q5热启动高保真(hotstarthigh-fidelity)2xmastermix进行。phusion聚合酶用于环状聚合酶延伸克隆(cpec)组装。表1：用于grna构建的寡核苷酸表2：用于报告物构建的寡核苷酸和gblock表3：用于reccas9构建的寡核苷酸表4：定制测序寡核苷酸表5：基因组pcr引物报告物构建使用五件式goldengate组装构建下述的报告物。片段1-5侧翼为esp3i位点；esp3i消化产生互补的5'突出端，指定片段组装的顺序(图6)。通过退火表5中列出的正向和反向互补寡核苷酸产生片段1、2、4和5。通过将20μl的分子级水中的10μl的每种寡核苷酸(100μm)混合，在95℃温育3分钟，并以-0.1℃/秒的速率将温度降至16℃来使片段退火。用引物3-for和3-rev通过pcr扩增含有kanr和polya终止密码子的区域产生片段3。这些引物还在该序列的5'和3'末端附加了esp3i。将退火的片段1、2、4和5稀释12,000倍并将0.625μl的每个片段添加至含有以下的混合物：1)40-50ng片段32)100ngpcalnlegfp-esp3i3)1μltango缓冲液(10x)4)1μldtt(10mm)5)1μlatp(10mm)6)0.25ult7连接酶(3,000u/μl)7)0.75ulesp3i(10u/μl)8)h2o至10μl将反应在编程进行20个循环(37℃5分钟，20℃)的热循环仪中温育。在完成goldengate反应后，将7μl的每个反应物与1μl的atp(10mm)、1μl的10xplasmidsafeatp依赖性dna酶缓冲液(10x)和1μl的plasmidsafeatp依赖性dna酶(10u/μl)(epicentre,madison,wi)混合以去除线性dna并减少背景。将dna酶消化物在37℃温育30分钟，并在70℃加热杀死30分钟。将每个反应物的一半(5μl)转化到mach1-t1细胞中。通过菌落pcr分析菌落并测序。针对图4中使用的报告物修改了方案。使用编码polya终止子的5'或3'的靶位点的两个gblock代替片段1、2、4和5。将这些gblock(10ng)加入到mmx中，其循环10次(37℃5分钟，20℃)并如上所述继续进行。质粒除非另有说明，否则使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen,valencia,ca)从琼脂糖凝胶分离dna片段并使用dnaclean&concentrator-5(zymoresearch,irvine,ca)或qiaquickpcr纯化试剂盒(qiagen,valencia,ca)进一步纯化。使用上面列出的试剂盒之一分离不需要凝胶纯化的pcr片段。使用pcalnl-gfp亚克隆载体pcalnl-egfp-esp3i克隆所有reccas9报告物质粒，并基于先前描述的pcalnl-gfp载体(matsudaandcepko,controlledexpressionoftransgenesintroducedbyinvivoelectroporation.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica104,1027-1032(2007)，其通过引用并入本文)。为了产生pcalnl-egfp-esp3i，用xhoi和mlui消化pcalnl-gfp载体并凝胶纯化以除去loxp位点、卡那霉素抗性标志物和poly-a终止子。退火的寡核苷酸形成espi插入物，其含有反向的esp3i位点以及xhoi和mlui相容的突出端；将该插入物连接到xhoi和mlui消化的质粒中并转化。用退火的寡聚物和含有相容的esp3i突出端的pcr产物通过goldengate组装产生pcalnl-gfpreccas9报告物质粒。如前所述用esp3i(thermofisherscientific,waltham,ma)建立并进行goldengate反应(sanjanaetal.,atranscriptionactivator-likeeffectortoolboxforgenomeengineering.natureprotocols7,171-192(2012)，其全部内容在此通过引用并入)。图6概述了用于报告物组装的一般组装方案和相关引物以及所有reccas9靶位点的序列分别列于表2和6中。侧翼为两个reccas9靶位点的含有kanr(粗体和下划线)和polya终止子(斜体和下划线)的代表性dna序列如下所示。显示的靶位点均为pam_nt1-0bp-gix_核心-0bp-nt1_pam(见表6)。原相邻间隔区基序(protoadjacentspacermotif)(pam)以粗体显示。碱基对间隔区是小写的。gix位点或gix相关位点以斜体显示，并且dcas9结合位点以下划线标出。对于图4的测定中使用的基因组报告物质粒，在卡那霉素抗性标志物中观察到g至t颠换，在下面的序列中由g/t表示。这存在于该图中使用的所有报告物中，并且预计不会影响结果，因为它远离polya终止子和reccas9靶位点。表6：用于报告物测定法的靶位点序列的列表通过用寡核苷酸1ggs-rev-bamhi或2ggs-rev-bamhi(使用接头seqidno:182)和gin-for-noti对编码演化的、过度激活的gin变体(ginβ)(gajetal.,acomprehensiveapproachtozinc-fingerrecombinasecustomizationenablesgenomictargetinginhumancells.nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)的gblock进行pcr扩增来构建含有reccas9基因的质粒。用bamhi和noti消化pcr片段，纯化并连接到先前描述的表达载体(addgene质粒43861)(参见例如，fuetal.,high-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbycrispr-casnucleasesinhumancells.naturebiotechnology31,822-826(2013)，其全部内容在此通过引用并入)中以产生亚克隆载体pgin-1ggs和pgin-2ggs(使用接头seqidno:182)。与cas9-rev-flag-nls-agei一起使用寡核苷酸1ggs-连接-for-bamhi、5ggs-连接-for-bamhi(使用接头seqidno:701)或8ggs-连接-for-bamhi(使用接头seqidno:183)构建编码具有1、5或8个ggs接头的cas9-flag-nls的pcr片段(见表3)。对于编码ggs氨基酸接头的dna序列，见表7。用bamhi和agei消化pcr片段和亚克隆质粒并连接以产生质粒pginβ-2xggs-dcas9-flag-nls(使用接头seqidno:182)、pginβ-5xggs-dcas9-flag-nls(使用接头seqidno:701)和pginβ-8xggs-dcas9-flag-nls(使用接头seqidno:183)。对于pginβ-8xggs-dcas9-flag-nls(即reccas9)的dna和氨基酸序列，参见下文。编码ginβ的序列以粗体显示；编码ggs接头的序列以斜体显示；编码dcas9接头的序列为黑色；编码flag标记和nls的序列分别用下划线和小写字母表示。gin重组酶催化域(其是seqidno:185的氨基酸1-142)与seqidno:713的序列相同。dcas9域(其是seqidno:185的氨基酸167-1533)与seqidno:712的序列相同。mligyvrvstndqntdlqrnalvcagceqifedklsgtrtdrpglkralkrlqkgdtlvvwkldrlgrsmkhlislvgelrerginfrsltdsidtsspmgrfffyvmgalaemereliiertmaglaaarnkgrrfgrppk(seqidno:713)dkkysiglaigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetaeatrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifgnivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsdvdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgnlialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdaillsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngyagyidggasqeefykfikpilekmdgteellvklnredllrkqrtfdngsiphqihlgelhailrrqedfypflkdnrekiekiltfripyyvgplargnsrfawmtrkseetitpwnfeevvdkgasaqsfiermtnfdknlpnekvlpkhsllyeyftvyneltkvkyvtegmrkpaflsgeqkkaivdllfktnrkvtvkqlkedyfkkiecfdsveisgvedrfnaslgtyhdllkiikdkdfldneenediledivltltlfedremieerlktyahlfddkvmkqlkrrrytgwgrlsrklingirdkqsgktildflksdgfanrnfmqlihddsltfkediqkaqvsgqgdslhehianlagspaikkgilqtvkvvdelvkvmgrhkpeniviemarenqttqkgqknsrermkrieegikelgsqilkehpventqlqneklylyylqngrdmyvdqeldinrlsdydvdaivpqsflkddsidnkvltrsdknrgksdnvpseevvkkmknywrqllnaklitqrkfdnltkaergglseldkagfikrqlvetrqitkhvaqildsrmntkydendklirevkvitlksklvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrkmiakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdfatvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptvaysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpkyslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfveqhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlgapaafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd(seqidno:712)表7：编码ggs接头的dna序列对于质粒测序实验，通过用pcr片段的goldengate克隆，用specr替换pginβ-8xggs-dcas9-flag-nls(使用接头seqidno:183)中的ampr基因。通过用esp3i-for-质粒和esp3i-rev-质粒进行pcr，在位于ampr基因侧翼的位点处将esp3i位点引入pginβ-8xggs-dcas9-flag-nls(使用接头seqidno:183)质粒中。引物spec-esp3i-for和spec-esp3i-rev用于扩增specr标志物以及引入esp3i位点和esp3i产生的突出端，所述突出端与由esp3i切割的质粒pcr产物产生的突出端相容。按照用于产生如本文所述的报告物质粒的方案对两个片段进行goldengate组装。phu6-nt1引导rna表达载体基于先前描述的pfyf1328(fuetal.,high-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbycrispr-casnucleasesinhumancells.naturebiotechnology31,822-826(2013)，其全部内容在此通过引用并入)，其被改变以靶向细菌萤光素酶基因luxab内的区域。通过用通用引物r.phu6.tss(-1).univ和编码独特引导rna序列的引物(表1)进行整个载体的pcr扩增来产生引导rna表达载体。表8中给出了引导rna序列的列表。这些引物用t4多核苷酸激酶磷酸化。将pcr反应产物和线性引导rna表达载体平端连接并转化。用于初始优化的引导rna表达载体、脱靶对照引导rna序列和靶向染色体10基因座的那些包含ampr。本研究中所述的所有其他质粒含有specr以促进测序实验。最初经由cpec将壮观霉素抗性引入到引导rna表达载体中，基本上如所述(quanetal.,circularpolymeraseextensioncloningofcomplexgenelibrariesandpathways.plosone4,e6441(2009)；和hillson(2010),vol.2015,pp.cpecprotocol；其每篇通过引用并入本文)，并且然后如上所述通过载体的pcr扩增构建引导rna质粒。将反应物在37℃与40u的dpni温育过夜，纯化并转化。通过用寡核苷酸cpec-组装-for-spec2和cpec组装-rev进行引导rna表达载体的pcr扩增产生cpec的片段。通过经由寡核苷酸cpec-组装-for-spec和cpec-组装-rev-spec对specr基因进行pcr扩增产生specr片段。puc19(thermofisherscientific，waltham，ma)进行了类似的修饰。表8：grna序列的列表细胞培养和转染hek293t细胞购自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc，manassas，va)。将细胞在补充有10％胎牛血清(fbs，lifetechnologies，carlsbad，ca)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)+glutamax-1(4.5g/ld葡萄糖+110mg/ml丙酮酸钠)中培养。将细胞在37℃，5％co2在潮湿的培养箱中培养。用于转染的质粒从pureyieldplasmidminiprepsystem(promega，madison，wi)中分离。转染前一晚，在48孔胶原处理的平板(corning，corning，ny)中以每孔3×105个细胞的密度接种hek293t细胞。在25μl的opti-mem(thermofisherscientific，waltham，ma)中制备转染反应。对于每次转染，将45ng的每种引导rna表达载体、9ng的报告物质粒、9ng的pirfp670-n1(addgeneplasmid45457)和160ng的reccas9表达载体混合，与opti-mem(thermofisherscientific，waltham，ma)中的0.8μlliplofectamine2000组合并加入各孔中。流式细胞术转染后60-72小时后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，并用50μl的0.05％胰蛋白酶-edta(lifetechnologies，carlsbad，ca)在37℃收获5-10分钟。将细胞在250μl培养基中稀释，并在bdfortessa分析仪上运行。使用635nm激光激发irfp荧光，并使用670/30带通滤光器收集发射。使用488nm激光激发egfp并用505长通和530/30带通滤光器获得发射荧光。在flowjo软件上分析数据，门控活的且经转染的事件(表达irfp)。以从至少6,000个活事件门控的转染细胞的百分比测量阳性gfp表达细胞。对于优化实验，通过测量在用报告物质粒和puc(没有reccas9或引导rna表达载体)共转染时产生egfp的转染细胞的百分比来确定测定背景。然后，当与reccas9和中靶或非靶引导rna表达载体共转染报告物质粒时从观察到的egfp阳性细胞的百分比中减去该背景。基因组靶位点的鉴定使用bioconductor(使用r统计程序的开源生物信息学包)进行搜索适当的靶位点(fuetal.,high-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbycrispr-casnucleasesinhumancells.naturebiotechnology31,822-826(2013)，其全部内容在此通过引用并入)。由genomereferenceconsortium发布的人参考基因组的最新版本(grch38)用于搜索与cas9的pam需求和如文本中描述的演化的gix序列两者相匹配的位点。在将基因组加载到r中的情况下，每个搜索模式都表示为biostring(允许字符串匹配和操作的r中的容器)。当使用grch38参考组装进行搜索时，使用所述参数扫描整个基因组的两条dna链揭示了人基因组中大约450个潜在靶标(表9)。表9：计算机中鉴定的reccas9基因组靶标dna测序如上述一式六份进行293t细胞的转染并温育72小时。收获细胞并合并重复。使用涉及碱性裂解和旋转柱纯化的改良hirt提取来提取附加型dna，基本上如所述(quanetal.,circularpolymeraseextensioncloningofcomplexgenelibrariesandpathways.plosone4,e6441(2009)；和hillson(2010),vol.2015,pp.cpecprotocol；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。简而言之，收获后，将hek293t细胞在500μl的冰冷的pbs中洗涤，重悬于250μlgte缓冲液(50mm葡萄糖，25mmtris-hcl，10mmedta并且ph8.0)中，在室温温育5分钟，并用200μl裂解缓冲液(200mmnaoh，1％十二烷基硫酸钠)在冰上裂解5分钟。用150μl的乙酸钾溶液(5m乙酸盐，3m钾，ph6.7)中和裂解。通过在21,130g离心15分钟沉淀细胞碎片，并将裂解物应用于econospin旋转柱(epochlifescience，missouricity，tx)。用750μl洗涤缓冲液(omegabio-tek，norcross，ga)洗涤柱两次，并在45μlte缓冲液，ph8.0中洗脱。用recbcd(10u)按照制造商的说明将分离的附加型dna在37℃消化2小时，并用minelutereactioncleanup试剂盒(qiagen，valencia，ca)纯化到10μleb中。用5μl的附加型提取物转化mach1-t1化学感受态细胞，并在选择羧苄青霉素抗性的琼脂糖平板(含有50μg/ml羧苄青霉素)上铺板。用引物pcalnl-for-1对个别菌落进行测序以确定重组率。测序读段揭示了“左”完整的非重组reccas9位点、预期的重组产物、具有小插入/缺失的“左”非重组位点的罕见实例、或大缺失产物的一个情况。对reccas9催化基因组缺失的分析在24孔胶原处理的平板中以每孔6×105个细胞的密度接种hek293t细胞并生长过夜(corning，corning，ny)。在opti-mem(thermofisherscientific，waltham，ma)中使转染反应物达到100μl的终体积。对于每次转染，将90ng的每种引导rna表达载体、20ng的pmaxgfp(lonza，allendale，nj)和320ng的reccas9表达载体与opti-mem(thermofisherscientific，waltham，ma)中2μllipofectamine2000组合并加入各孔中。48小时后，收获细胞并在bdfacsariaiiiu细胞分选仪上分选gfp转染对照。使用100μm喷嘴在纯度模式下分选细胞，并通过与未转染的细胞比较确定背景荧光。在pbs中在冰上收集分选的细胞，沉淀并用冷pbs洗涤两次。使用e.z.n.a.组织dna试剂盒(omegabio-tek，norcross，ga)收获基因组dna并在100μleb中洗脱。使用在tecaninfinitem1000pro荧光酶标仪(platereader)上测量的quant-itpicogreendsdna试剂盒(thermofisherscientific，waltham，ma)定量基因组dna。使用补充有3％dmso的q5热启动聚合酶2xmastermix进行巢式pcr，并用hyclone水，分子生物学级(gelifesciences，logan，ut)稀释。使用引物对fam19a2-f1和fam19a2-r1(表5)用20ng的基因组dna作为模板以25ul规模进行初级pcr。初级pcr条件如下：98℃1分钟，35个循环(98℃10秒、59℃30秒、72℃30秒)，72℃1分钟。使用引物fam19a2-f2和fam19a2-r2，将1:50稀释的初级pcr用作次级pcr的模板。次级pcr条件如下：98℃1分钟，30个循环(98℃10秒、59℃20秒、72℃20秒)，72℃1分钟。通过在tae中的1％琼脂糖凝胶上与1kbplusdna梯(ladder)(thermofisherscientific，waltham，ma)一起电泳来分析dna。在qiagenminelute柱(valencia，ca)上使用制造商的方案纯化待sanger测序的材料。来自3个生物学重复的模板dna用于三个独立的基因组巢式pcr。考虑到一组完整的人染色体重约3.6pg(3.3·109bp×1·10-1，计算检出限。因此，用20ng的基因组dna模板接种的pcr反应物含有约5500组染色体。为了定量基因组缺失，对于3个生物学重复中的每一个，一式三份进使用上述条件行巢式pcr。使用两倍稀释系列的基因组dna作为模板，从未稀释的储液开始(对于样品1，47.17ng/ul；对于样品2，75.96ng/ul；并且对于样品3，22.83ng/ul)以减少潜在的移液误差来源。假定可以观察到缺失pcr产物的最低dna浓度含有每个总基因组dna的单一缺失产物。可以推断给定量的模板dna中存在的基因组的数量，并因此可以确定fam19a2基因座处reccas9的最小缺失效率的估计值。例如，以20ng基因组dna模板开始，以两倍稀释系列为例。巢式pcr后，只有接种20ng的孔产生正确的pcr产物。每个基因组3.6pg，该pcr含有大约5500个基因组，并且由于必须存在至少一个重组基因组，因此最小缺失效率为5500分之一或0.018％。使用基因组模板的有限稀释来定量基因组dna的水平，因为使用定量pcr(qpcr)来确定基因组编辑的绝对水平将需要一组pcr条件，其仅明确地且仅特异性地扩增自重组后基因组dna。如图5b中所示，使用基因组dna作为模板的初级pcr导致大约2.5kb脱靶带作为优势种类；需要使用巢式引物进行第二轮的pcr以揭示引导rna-和reccas9依赖性基因组编辑。结果将gin重组酶融合至dcas9最近已经证明dcas9的n端可以融合至foki核酸酶催化域，产生二聚体dcas9-foki融合物，其切割侧翼为两个引导rna指定序列的dna位点(参见例如，guilingeretal.,fusionofcatalyticallyinactivecas9tofokinucleaseimprovesthespecificityofgenomemodification.naturebiotechnology,(2014)；tsaietal.,dimericcrisprrna-guidedfokinucleasesforhighlyspecificgenomeediting.naturebiotechnology,(2014)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。使用相同的融合方向将dcas9与ginβ(barbas及其同事先前演化的二聚体gin转化酶的高活性催化域)连接(gajetal.,acomprehensiveapproachtozinc-fingerrecombinasecustomizationenablesgenomictargetinginhumancells.nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)。ginβ混杂地重组与天然核心序列ctgtaaaccgaggttttgga(seqidno:700)相关的几个20-bp核心“gix”序列(gajetal.,acomprehensiveapproachtozinc-fingerrecombinasecustomizationenablesgenomictargetinginhumancells.nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)；klippeletal.,thednainvertaseginofphagemu-formationofacovalentcomplexwithdnaviaaphosphoserineatamino-acidposition-9.embojournal7,1229-1237(1988)；mertensetal.,site-specificrecombinationinbacteriophagemu:characterizationofbindingsitesforthednainvertasegin.theembojournal7,1219-1227(1988)；plasterketal.,dnainversionsinthechromosomeofescherichiacoliandinbacteriophagemu:relationshiptoothersite-specificrecombinationsystems.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica80,5355-5358(1983)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。引导rna将reccas9二聚体定位于侧翼为两个引导rna指定的序列的gix位点，使得ginβ域能够以引导rna编程的方式催化dna重组(图1d)。为了测定所得的dcas9-ginβ(reccas9)融合物，构建了含有两个reccas9靶位点的报告物质粒，两个reccas9靶位点位于阻断egfp转录的poly-a终止子的侧翼(图1a-1c)。每个reccas9靶位点由侧翼为与引导rna前间隔区序列匹配的位点的gix核心假位点组成。重组酶介导的缺失去除了终止子，恢复了egfp的转录。用该报告物质粒、转录引导rna的质粒和产生候选dcas9-ginβ融合蛋白的质粒共转染hek293t细胞，并使用表现出egfp荧光的细胞级分评估每种融合构建体的相对活性。影响reccas9组分的结构的参数，包括核心gix位点和引导rna结合位点之间的间距(0至7bp)，以及dcas9和ginβ部分之间的接头长度((ggs)2(seqidno:182)、(ggs)5(seqidno:701)或(ggs)8(seqidno:183))是变化的(图2a-2f)。大多数融合结构导致无观察到的引导rna依赖性egfp表达(图1c-1d)。然而，当存在匹配但不错配的引导rna时，一个含有8个ggs重复的接头和3-6个碱基对间隔区的融合构建体导致约1％的重组(图2e-2f)。当5-6个碱基对将dcas9结合位点与核心分开时，重组活性始终较高(图2f)。这些结果共同揭示了dcas9和ginβ之间的特异性融合结构可以在人细胞中与间隔区侧翼的gix相关的核心位点处产生引导rna依赖性重组活性。8xggs接头融合构建体称为“reccas9”。用reccas9靶向人基因组中发现的dna序列观察到的活性的低水平可以由次优的引导rna序列或核心gix序列引起，与表明引导rna:cas9结合的效率呈序列依赖性的之前的报告(参见例如，xuetal.,sequencedeterminantsofimprovedcrisprsgrnadesign.genomeresearch25,1147-1157(2015)，其全部内容在此通过引用并入)一致。此外，尽管目前的优化是用天然gix核心序列进行的(参见例如，klippeletal.,thednainvertaseginofphagemu-formationofacovalentcomplexwithdnaviaaphosphoserineatamino-acidposition-9.embojournal7,1229-1237(1988)；mertensetal.,site-specificrecombinationinbacteriophagemu:characterizationofbindingsitesforthednainvertasegin.theembojournal7,1219-1227(1988)；plasterketal.,dnainversionsinthechromosomeofescherichiacoliandinbacteriophagemu:relationshiptoothersite-specificrecombinationsystems.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica80,5355-5358(1983)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)，但是一些研究已表明锌指-gin或tale-gin融合对略微改变的核心位点是有活性的，并且在某些情况下更具活性。参见例如，gordleyetal.,3rd,synthesisofprogrammableintegrases.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica106,5053-5058(2009)；gersbachetal.,targetedplasmidintegrationintothehumangenomebyanengineeredzinc-fingerrecombinase.nucleicacidsresearch39,7868-7878(2011)；merceretal.,chimerictalerecombinaseswithprogrammablednasequencespecificity.nucleicacidsresearch40,11163-11172(2012)；gajetal.,acomprehensiveapproachtozinc-fingerrecombinasecustomizationenablesgenomictargetinginhumancells.nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)；gordleyetal.,3rd,evolutionofprogrammablezincfinger-recombinaseswithactivityinhumancells.jmolbiol367,802-813(2007)；gersbachetal.,3rd,directedevolutionofrecombinasespecificitybysplitgenereassembly.nucleicacidsresearch38,4198-4206(2010)；和gajetal.,structure-guidedreprogrammingofserinerecombinasednasequencespecificity.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica108,498-503(2011)；其每篇的全部内容在此通过引用并入)。因此，靶向在人基因组内发现的序列以测试未修饰的人基因组序列是否能够被reccas9靶向并测试是否改变引导rna和核心序列将增加reccas9活性。为了鉴定潜在的靶位点，使用了表征演化的gin变体的先前发现(参见例如，gajetal.,acomprehensiveapproachtozinc-fingerrecombinasecustomizationenablesgenomictargetinginhumancells.nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)以及上述观察结果。使用该信息，在人基因组中搜索含有ccn(30-31)-aaasswwssttt-n(30-31)-gg(seqidno:699)的位点，其中w是a或t，s是g或c，n是任何核苷酸。n(30-31)包括以下各项的n：ngg前间隔区相邻基序(pam)、20碱基对cas9结合位点、cas9和gix位点之间5-6碱基对间隔以及gix核心位点的四个最外碱基对。预先确定gix核心位点的内部12个碱基对(aaasswwssttt，seqidno:699)对ginβ活性是重要的(参见例如，gajetal.,nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)。该搜索揭示了人基因组中约450个此类基因座(表9)。产生报告物构建体，其含有与pcdh15中发现的这些基因组基因座之一相同的序列，并且然后构建引导rna表达载体以将reccas9导向该序列(图3a)。这些载体编码两对引导rna，其每对含有与pcdh15假gix位点侧翼的5'和3'区域匹配的间隔区序列。报告物质粒、这些侧翼引导rna表达载体的组合和reccas9表达载体的共转染导致在11％-13％的转染细胞中的egfp表达(图3b)，表明与图2中所示结果相比，活性提高了10倍以上。这些发现表明，reccas9靶序列的更明智的选择可以导致与人基因组中发现的dna序列匹配的dna序列处的重组效率显著提高。接下来，确定是否需要这两个引导rna序列引起reccas9介导的缺失。用靶向pcdh15假gix核心位点的5'或3'侧翼序列的引导rna载体的仅一个、pcdh15报告物质粒和reccas9表达载体共转染hek293t细胞。这些共转染导致2.5-3％egfp表达(图3b)。靶向性引导rna的仅一个和reccas9的表达时观察到的低活性水平可以是由过度激活的gix单体形成二聚体的倾向引起的(参见例如，gajetal.,enhancingthespecificityofrecombinase-mediatedgenomeengineeringthroughdimerinterfaceredesign.jamchemsoc136,5047-5056(2014)，其全部内容在此通过引用并入)；瞬时二聚化可以偶尔允许单一前间隔区序列将二聚体定位于靶位点。当使用脱靶引导rna载体时或当用puc替换reccas9载体时，未检测到高于背景的活性(图3b)。这些发现表明，通过选择不同的靶位点和匹配引导rna序列，reccas9活性可以比初始实验中观察到的适度活性显著增加。与原始靶序列相比，观察到pcdh15位点上的活性增加大于10倍(比较图3b和图2f)。此外，最大重组活性取决于两个引导rna和reccas9的存在。reccas9的正交性接下来，测试reccas9是否可以以正交方式靶向在人基因组中发现的序列匹配的多个分开的基因座。基于其作为基因组整合的安全港基因座的潜在用途，或者在一种情况下基于其在遗传疾病中涉及的基因内的位置，选择人基因组中reccas9靶位点的子集。为了鉴定这些位点，搜索ensembl(版本81)以鉴定哪些预测的reccas9靶位点落入注释的基因内(参见例如，cunninghametal.,ensembl2015.nucleicacidsresearch43,d662-669(2015)，其全部内容在此通过引用并入)。一个此类位点落入fgf14的内含子区域。据信fgf14内的突变会引起脊髓小脑性共济失调(spinocerebellarataxia)27(sca27)(参见例如，vanswietenetal.,amutationinthefibroblastgrowthfactor14geneisassociatedwithautosomaldominantcerebellarataxia[corrected].amjhumgenet72,191-199(2003)；brusseetal.,spinocerebellarataxiaassociatedwithamutationinthefibroblastgrowthfactor14gene(sca27):anewphenotype.movdisord21,396-401(2006)；choquetetal.,anovelframeshiftmutationinfgf14causesanautosomaldominantepisodicataxia.neurogenetics16,233-236(2015)；coeberghetal.,anewvariablephenotypeinspinocerebellarataxia27(sca27)causedbyadeletioninthefgf14gene.eurjpaediatrneurol18,413-415(2014)；shimojimaetal.,spinocerebellarataxiastype27derivedfromadisruptionofthefibroblastgrowthfactor14genewithmimickingphenotypeofparoxysmalnon-kinesigenicdyskinesia.braindev34,230-233(2012)；其每篇的全部内容通过引用并入本文)。最后，手动询问未落入基因内的预测的reccas9靶位点的级分，以确定一些序列是否落入安全港基因座内。使用ensembl中的注释鉴定了基因组靶标，该靶标与bushman及其同事描述的安全港基因座的五个标准的大多数相匹配(cunninghametal.,ensembl2015.nucleicacidsresearch43,d662-669(2015)；和sadelainetal.,safeharboursfortheintegrationofnewdnainthehumangenome.natrevcancer12,51-58(2012)，其每篇的全部内容通过引用并入本文)。构建了五种报告物和含有与基因组中序列相同的序列的相应的引导rna载体对。为了评估reccas9在用不同的引导rna编程时的正交性，测试了五种引导rna对与五种报告物的所有组合。报告物、引导rna质粒和reccas9表达载体的共转染显示，所测试的五种报告物中的三种导致与reccas9介导的重组一致的显著水平的egfp阳性细胞。该egfp表达严格依赖于reccas9表达载体和与报告物构建体上的靶位点序列匹配的引导rna质粒的共转染(图4a)。当与非关联报告物质粒共转染时，与关联报告物质粒和reccas9载体共转染时引起重组的相同的引导rna对不能介导重组(图4a)。这些结果证明reccas9活性是正交的，并且当用与侧翼序列匹配的一对引导rna编程时，仅催化gix相关核心位点处的重组。当未用表达reccas9和引导rna的载体转染报告物质粒时，没有观察到高于测定的背景水平的重组酶活性。reccas9产物的特性表征reccas9介导的报告物质粒重组的产物以证实egfp表达是reccas9介导的poly-a终止子序列除去的结果。在与reccas9表达载体和与产生关联或非关联引导rna对的质粒共转染后，对报告物质粒进行染色体5位点1、染色体12和染色体13(fgf14基因座)的测序。温育72小时后，提取附加型dna(如上所述)并转化到大肠杆菌中以分离报告物质粒。对含有报告物质粒的单菌落进行测序(图4b)。预期个别菌落含有未修饰的或重组的报告物质粒(图4c)。对于每个生物学重复，对用从每个转染条件分离的报告物质粒转化的平均97个菌落进行测序。若报告物质粒先前与关联引导rna质粒和reccas9表达载体共转染，则仅观察到重组质粒(图4d)。在两个单独的实验中，重组质粒的百分比范围从染色体5中的位点1的12％到染色体13中的fgf14基因座的平均32％。因此，测序数据与图4a中更早的流式细胞术分析一致。重组质粒的绝对水平略高于egfp阳性细胞的百分比(图4)。这种差异可能是因为流式细胞术测定没有报告当在单一细胞中存在多个拷贝的报告物质粒时可发生的多个重组事件而出现；甚至单一重组事件可以导致egfp荧光。结果，egfp阳性细胞的百分比可以对应于重组报告物质粒的实际百分比的下限。或者，差异可以反映质粒大小和转化效率之间的负相关性(参见例如，hanahan,studiesontransformationofescherichiacoliwithplasmids.jmolbiol166,557-580(1983)，其全部内容在此通过引用并入)；重组质粒约为5,700个碱基对，并且可以转化得略好于完整质粒(其约为6,900个碱基对)。由于已经报告锌指重组酶在重组酶核心位点连接处引起突变(参见例如，e.g.,gajetal.,acomprehensiveapproachtozinc-fingerrecombinasecustomizationenablesgenomictargetinginhumancells.nucleicacidsresearch41,3937-3946(2013)，其全部内容在此通过引用并入)，因此测试了此类诱变是否自reccas9处理发生。在报告物构建体中，reccas9应通过首先切割这两个gix核心位点的中心二核苷酸并然后将两个核心彼此再连接来删除kanr和poly-a终止子(图4c)。因此，重组产物应当是由“左”靶位点的第一半和“右”靶位点的第二半组成的单一重组位点。错误或不完整的反应可以导致其他产物。引人注目的是，所检查的所有134个重组序列都含有预期的重组产物。此外，来自两组分开的转染实验的总共2,317个测序读段显示仅三个含有在其他情况下非重组质粒上潜在的缺失产物的测序读段。在用puc对照转染并且缺少两个reccas9靶位点以及polya终止子的染色体12报告物质粒中观察到这些含有缺失的读段之一。该产物归因于在转染、分离或随后操作期间发生的dna损伤。因为当与报告物和关联引导rna表达载体共转染时reccas9仅可以定位于序列，所以更相关的度量可以是测量当与关联引导rna载体和reccas9表达载体共转染报告物质粒时观察到的缺失产物的总数。从与染色体5-位点1报告物和关联引导rna的共转染测序的总共185个质粒中观察到单一插入/缺失。类似地，在用关联引导rna和reccas9表达载体转染后，从来自染色体12报告物的204个质粒中观察到一个插入/缺失。值得注意的是，在202个测序读段中，在关联引导rna和reccas9共转染后，从染色体13报告物中未观察到插入/缺失，尽管导致观察到的最高重组水平。这些观察结果共同表明reccas9主要介导无错重组。总之，这些结果建立了reccas9可以在最小的交叉反应性或副产物形成的情况下靶向人基因组内发现的多个位点。仅在存在关联引导rna序列和reccas9的情况下，底物经历有效重组，在人细胞中产生干净的重组产物，并且通常不导致核心位点连接处的突变或产物诸如由细胞dna修复产生的插入/缺失。reccas9介导的基因组缺失最后，研究了reccas9是否能够直接在培养的人细胞的基因组dna上操作。使用人基因组中潜在的reccas9识别位点的列表(表9)，搜索在由reccas9靶向的情况下将产生通过pcr可检测的染色体缺失事件的位点对。设计引导rna表达载体以将reccas9引导至最接近染色体5-位点1或染色体13(fgf14基因座)的那些reccas9位点，即均显示在瞬时转染测定中重组的位点(图4)。新的靶位点范围为染色体5-位点1的上游约3至23mbp和下游7至10mbp，以及染色体13-fgf14位点的上游的12至44mbp。与这些新的引导rna对之每种和用于染色体5-位点1或染色体13-fgf14的经验证的引导rna对共转染reccas9表达载体，但通过基因组pcr未观察到染色体缺失的证据。若reccas9靶位点在基因组上彼此更接近，则认为基因组缺失可能更有效。鉴定了在fam19a2的内含子区域内以14.2kb分开的两个reccas9位点；这些位点还含有相同的二核苷酸核心，这应当有助于缺失。fam19a2是五个密切相关的tafa家族基因之一，其编码认为在免疫和神经细胞中具有调节作用的小的分泌蛋白(参见例如parkeretal.,admixturemappingidentifiesaquantitativetraitlocusassociatedwithfev1/fvcinthecopdgenestudy.genetepidemiol38,652-659(2014)，其全部内容在此通过引用并入)。位于fam19a2的内含子序列中的小核苷酸多态性在全基因组关联研究中与系统性红斑狼疮(sle)和慢性阻塞性肺病(copd)的风险升高有关(参见例如，parkeretal.,admixturemappingidentifiesaquantitativetraitlocusassociatedwithfev1/fvcinthecopdgenestudy.genetepidemiol38,652-659(2014)，其全部内容在此通过引用并入)；因此，该基因的内含子区域的缺失可以了解这些疾病的原因。将四个引导rna序列克隆到表达载体中，所述表达载体设计以介导这两个fam19a2位点之间的reccas9缺失。与reccas9表达载体共转染表达这些引导rna的载体(图5a)。reccas9介导的两个位点之间的重组应当导致14.2kb居间区域的缺失。实际上，使用位于两个fam19a2reccas9靶标侧翼的基因特异性引物，通过巢式pcr检测到该缺失事件。仅在从用reccas9和所有四种引导rna表达载体共转染的细胞分离的基因组dna中观察到与reccas9介导的缺失一致的预期pcr产物(图5b)。在没有单独的引导rna表达载体的上游或下游对的情况下，在没有reccas9表达质粒的情况下转染的细胞的基因组dna中，或对于未转染的对照细胞的基因组dna，未检测到缺失pcr产物(图5b)。这些巢式pcr产物的估计检测限为每5,500个染色体拷贝约1个缺失事件。分离对应于预测的基因组缺失的415-bppcr产物并测序。测序证实pcr产物与自重组酶介导的基因组缺失预期的预测连接相匹配，并且不含任何提示nhej的插入或缺失(图5c)。在基因组模板的连续稀释液上使用巢式pcr估计最小基因组缺失效率的下限(参见上文或例如sykesetal.,quantitationoftargetsforpcrbyuseoflimitingdilution.biotechniques13,444-449(1992)，其全部内容在此通过引用并入，以获得更多细节)。产生reccas9特异性巢式pcr产物的给定量的基因组dna必须含有至少一个经编辑的染色体。为了建立该reccas9介导的基因组缺失事件的下限，在基因组dna(从用reccas9和四种fam19a2引导rna表达载体转染的细胞中分离)的连续稀释液上进行巢式pcr，以确定导致可检测的缺失产物的基因组模板dna的最低浓度。这些实验揭示了0.023±0.017％(三个生物学重复的平均值)的缺失效率的下限(图5d)，表明reccas9介导的基因组缺失以至少该效率进行。未转染细胞的基因组dna的巢式pcr不产生产物，估计检测限为<0.0072％重组。其他替代重组酶的使用称为“36c6”的演化为靶向人基因组的rosa基因座中位点的cre重组酶与dcas9融合。然后，将该融合物用于以引导rna依赖性方式重组含有rosa靶位点的基于质粒的报告物。图7a证明了使用野生型cre和36c6的接头优化的结果。显示的1x2x、5x和8x接头是接头中ggs重复的数量。回复分析证明了对与dcas9融合的36c6进行突变可以影响嵌合融合物的相对引导依赖性(图7b)。回复用其未突变的氨基酸标记。例如，已经突变为m的位置306在进行测定之前回复为i。靶向其关联报告物的ginb构建体用作图7a和7b中所示实验数据的对照。中靶引导是chr13-102010574引导(质粒bc165和166)。显示的缩写是ggs-36c6:dcas9-ggs-36c6；2ggs-36c6(使用接头seqidno:182):sdcas9-ggsggs-36c6(使用接头seqidno:182)。用于36c6和所有变体转染的靶序列如下所示:(引导物-斜体；rosa位点-粗体)：cctagggaagtgatcatagctgagtttctatctcatggtttatgctaaactatatgttgacatgttgaggagacttaagtccaaaacctgg(seqidno:760)在图7a、7b、8、9a和9b中，ginb的中靶引导是chr13-102010574引导(质粒bc165和166)。图7a、7b、8、9a和9b中的所有脱靶引导由chr12-62418577引导(bc163和bc164)构成。鉴定了人基因组中rosa26位点侧翼的pam，其可以支持dcas9结合(图8，上图)。然后设计引导rna和质粒报告物以测试内源性前间隔区是否可以支持dcas9-36c6活性。靶向其关联报告物的ginb构建体用作对照。见图8。混合：cas9和36c6之间所有5种接头变体的等份混合物。对于hrosa，靶序列(包括引导rna靶标)如下：(引导-斜体；rosa位点-粗体)cctgaaataatgcaagtgtagaataactttttaaaatctcatggtttatgctaaactatatgttgacataagagtggtgataaggcaacagtagg(seqidno:767)用于hrosa的中靶引导质粒与其他grna表达质粒相同，只是前间隔区被上文所示的那些替换(图8)。dcas9-cre重组酶融合物的几个测试的cre截短显示在图9a中。与dcas9融合的cre重组酶的截短的变体显示出可察觉的重组酶活性以及对lox质粒报告物系统中引导rna的存在的严格依赖(图9b)。截短的变体用截短的cre开始的残基标记。图9a和9b中所示的所有融合蛋白的接头是8xggs。与dcas9融合的野生型cre用作阳性对照。用于36c6和所有变体转染的靶序列如下所示:(引导-斜体；rosa位点-粗体)：cctagggaagtgatcatagctgagtttctatctcatggtttatgctaaactatatgttgacatgttgaggagacttaagtccaaaacctgg(seqidno:768)使用的中靶引导是chr13-102010574引导(质粒bc165和166)，并且脱靶引导是chr12-62418577引导(bc163和bc164)。参考文献1.j.a.doudna,e.charpentier,genomeediting.thenewfrontierofgenomeengineeringwithcrispr-cas9.science346,1258096(2014).2.m.r.capecchi,alteringthegenomebyhomologousrecombination.science244,1288-1292(1989).3.k.r.thomas,k.r.folger,m.r.capecchi,highfrequencytargetingofgenestospecificsitesinthemammaliangenome.cell44,419-428(1986).4.a.choulika,a.perrin,b.dujon,j.f.nicolas,inductionofhomologousrecombinationinmammalianchromosomesbyusingthei-sceisystemofsaccharomycescerevisiae.molcellbiol15,1968-1973(1995).5.d.carroll,progressandprospects:zinc-fingernucleasesasgenetherapyagents.genether15,1463-1468(2008).6.j.c.milleretal.,atalenucleasearchitectureforefficientgenomeediting.naturebiotechnology29,143-u149(2011).7.j.k.joung,j.d.sander,talens:awidelyapplicabletechnologyfortargetedgenomeediting.natrevmolcellbiol14,49-55(2013).8.p.malietal.,rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9.science339,823-826(2013).9.l.congetal.,multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science339,819-823(2013).10.j.p.guilinger,d.b.thompson,d.r.liu,fusionofcatalyticallyinactivecas9tofokinucleaseimprovesthespecificityofgenomemodification.naturebiotechnology,(2014).11.s.q.tsaietal.,dimericcrisprrna-guidedfokinucleasesforhighlyspecificgenomeediting.naturebiotechnology,(2014).12.h.fung,d.m.weinstock,repairatsingletargeteddnadouble-strandbreaksinpluripotentanddifferentiatedhumancells.plosone6,e20514(2011).13.w.d.heyer,k.t.ehmsen,j.liu,regulationofhomologousrecombinationineukaryotes.annurevgenet44,113-139(2010).14.d.branzei,m.foiani,regulationofdnarepairthroughoutthecellcycle.natrevmolcellbio9,297-308(2008).15.v.t.chuetal.,increasingtheefficiencyofhomology-directedrepairforcrispr-cas9-inducedprecisegeneeditinginmammaliancells.naturebiotechnology,(2015).16.t.maruyamaetal.,increasingtheefficiencyofprecisegenomeeditingwithcrispr-cas9byinhibitionofnonhomologousendjoining.naturebiotechnology,(2015).17.s.lin,b.t.staahl,r.k.alla,j.a.doudna,enhancedhomology-directedhumangenomeengineeringbycontrolledtimingofcrispr/cas9delivery.elife3,e04766(2014).18.s.turan,c.zehe,j.kuehle,j.h.qiao,j.bode,recombinase-mediatedcassetteexchange(rmce)-arapidly-expandingtoolboxfortargetedgenomicmodifications.gene515,1-27(2013).19.t.gaj,s.j.sirk,c.f.barbas,expandingthescopeofsite-specificrecombinasesforgeneticandmetabolicengineering.biotechnologyandbioengineering111,1-15(2014).20.n.d.f.grindley,k.l.whiteson,p.a.rice,mechanismsofsite-specificrecombination.annurevbiochem75,567-605(2006).21.c.r.sclimenti,b.thyagarajan,m.p.calos,directedevolutionofarecombinaseforimprovedgenomicintegrationatanativehumansequence.nucleicacidsresearch29,5044-5051(2001).22.r.s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