治疗表达PD-L1的癌症的方法与流程

本公开涉及通过施用包含载体蛋白、特异性结合pd-l1的结合剂和紫杉醇的纳米颗粒复合物来治疗癌症的新方法和试剂盒。所述方法还可以包括在施用纳米颗粒复合物之前、同时或之后仅使用抗pd-l1抗体预治疗患有癌症的患者，所述癌症包括表达pd-l1的癌细胞。

现有技术

癌细胞采用多种手段逃避免疫监视，从而继续增殖和/或转移。例如，许多癌细胞类型表达或过表达pd-l1(程序性细胞死亡配体1)(b7-h1)，它是程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)的主要配体。pd-1是t淋巴细胞上的细胞表面受体，并且在长期抗原暴露后在成熟的造血细胞(如t细胞和b细胞)、nkt细胞和单核细胞中活化时表达(ishida等人,1992.emboj.11:3887)。pd-1和pd-l1在肿瘤微环境中的表达似乎是逃避免疫监视的主要抗性机制。推测pd-l1与t细胞上的pd-1结合抑制效应抗肿瘤t细胞活性并促进免疫逃避。

有几项临床试验使用结合于pd-1或pd-l1的单克隆抗体治疗癌症，包括肺癌、膀胱癌、肾癌、血液癌症、乳腺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤和实体癌。本领域已知的抗pd-1抗体包括例如纳武单抗(bms-936558/mdx-1106/ono-4538；bristolmyerssquibb)、pdr001(novartis)和派姆单抗(mk-3475)(mercksharp&dohme)；本领域已知的抗pd-l1抗体包括例如bms-936559/mdx-1105(bristolmyerssquibb)、阿特珠单抗(mpdl3280a,genetech/roche)、medi4736(度伐单抗；medimmune/astrazeneca)、msb00100718c(阿维鲁单抗；emdserono)(参见例如，therapeuticusesofanti-pd-1andanti-pd-l1antibodies”internationalimmunologyvol.27(1)pp:39-46)。

尽管靶向pd-1:pd-l1途径的抗体具有抗肿瘤活性，但是已经越来越多地观察到对这些疗法的抗性(参见例如，lussier等人.j.immunotherapyofcancer,2015,3:21和koyama等人.,naturecommunications,20167:1-9(2016年2月17日在线发表))。因此，本领域仍需要改善癌症治疗剂的功效。

技术实现要素：

本文描述了用于治疗患有癌症的患者的方法，所述癌症具有表达程序性细胞死亡配体1(pd-l1)的癌细胞，特别是例如变得对使用抗pd-l1抗体的免疫治疗具有抗性的表达pd-l1的癌细胞。所述方法包括或由以下组成：向具有表达或过表达pd-l1的癌细胞的有需要的受试者，例如哺乳动物施用包含治疗量的纳米颗粒复合物的组合物，所述纳米颗粒复合物包含(a)载体蛋白，(b)有效量的结合剂，其具有结合于pd-l1的pd-l1结合部分，以便为纳米颗粒复合物到达癌细胞提供定向引导，和(c)有效量的紫杉醇。

在一个实施方案中，复合物的平均直径为0.1至0.9μm。结合剂可以是抗pd-l1抗体，例如阿特珠单抗。哺乳动物可以是人。表达pd-l1的癌细胞可以是例如黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、merkel细胞癌、卵巢癌、膀胱癌和晚期实体瘤。

载体蛋白/紫杉醇/结合剂纳米颗粒复合物可以是/抗pd-l1抗体复合物。可得自celgenecorp.，并且是组合紫杉醇与人白蛋白的纳米颗粒制剂。载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗体纳米颗粒复合物，或包含该复合物的组合物还可以包含烷化剂。烷化剂可以是铂化合物。铂化合物可以是卡铂。抗pd-l1抗体可以是人源化抗体。抗pd-l1抗体可以是嵌合抗体。组合物可以通过注射施用。

在一个实施方案中，表达pd-l1的癌细胞对用抗pd-l1抗体的免疫治疗具有抗性。

在本文所述方法的一个实施方案中，复合物以足以递送治疗有效量的紫杉醇的量施用。

适用于本文所述的发明的抗pd-l1抗体包括阿特珠单抗(tecentriq^tm,genentech,inc.，roche集团成员)或其生物仿制药。在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是bms-936559/mdx-1105(bristolmyerssquibb)、阿特珠单抗(mpdl3280a,genetech/roche)、medi4736(度伐单抗；medimmune/astrazeneca)或msb00100718c(阿维鲁单抗；emdserono)。

在本文所述方法的一个实施方案中，癌细胞的靶标是实体癌的细胞。

在本文所述方法的一个实施方案中，载体蛋白/紫杉醇/pd-l1结合剂纳米颗粒复合物，例如，白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物，是冻干的，并且可以重构以用于向有需要的受试者施用。

本发明的一个实施方案包括用于增加表达pd-l1的肿瘤摄取化学治疗剂的持续时间的方法。所述方法包括施用纳米颗粒复合物中的化学治疗剂，所述纳米颗粒复合物包含载体蛋白、化学治疗剂(例如，紫杉醇)和pd-l1结合剂，例如特异性结合于pd-l1的抗体，其中所述结合剂为纳米颗粒复合物到达肿瘤提供定向引导。

如本文所述，体外混合含白蛋白的纳米颗粒(例如，纳米颗粒)和抗体(例如，抗pd-l1抗体，如阿特珠单抗)可以导致大分子复合物的形成，所述大分子复合物的特征(例如，尺寸、抗体含量或化学治疗药含量)可根据需要定制。在一些情况下，这样的大分子复合物可以保留抗体介导的靶标结合特异性，可以保留或表现出增强的化学治疗肿瘤细胞的细胞毒性，并且没有表现出超过单独的纳米颗粒的额外的毒性。仍然如本文所述，在向人(例如，其中癌症表达或过表达pd-l1的人癌症患者)施用之前，使与抗pd-l1抗体(例如，阿特珠单抗)接触可产生复合物，当作为复合物施用时，与包括以不形成/抗pd-l1抗体复合物的方式单独施用和抗pd-l1抗体的治疗方案相比，具有增加的治疗癌症的能力。本文提供的方法和材料可用于提高癌症患者的无进展存活率。提高无进展存活可使癌症患者的寿命更长。因此，本文提供的方法和材料可用于提高癌症患者的总体存活率。

本文还描述了通过向患者施用抗pd-l1抗体和纳米颗粒复合物来治疗癌症，优选包含表达程序性细胞死亡配体1(pd-l1)的癌细胞的癌症的方法，所述复合物包含载体蛋白、紫杉醇和特异性结合于pd-l1的结合剂，例如抗pd-l1抗体。如本文所述，用pd-l1抗体与这样的纳米颗粒复合物组合治疗患有癌症(例如表达pd-l1或过表达pd-l1的癌症)的受试者增加了复合物的治疗功效。优选地，在用这样的纳米颗粒复合物治疗之前施用这样的抗pd-l1抗体。因此，本文提供的方面是用于治疗患有癌症(例如，表达或过表达pd-l1的癌症)的患者的方法，其中使用亚治疗量的抗pd-l1抗体和治疗量的包含载体、紫杉醇和抗pd-l1抗体的纳米颗粒复合物治疗所述患者。亚治疗量的抗pd-l1抗体的施用使得其增强纳米颗粒复合物的功效。不希望受任何理论束缚，考虑施用亚治疗量的抗pd-l1抗体通过结合体内非肿瘤结合的pd-l1增强纳米颗粒复合物的治疗功效。用亚治疗量的抗pd-l1抗体治疗可以允许纳米颗粒复合物更强地靶向肿瘤，减少实现期望的作用所需的向患者施用的载体蛋白/紫杉醇/抗体复合物的量，或两者。

在另一个方面中，本文提供了用于增强载体蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物的方法，所述方法通过用亚治疗量的抗pd-l1抗体预治疗患者后约0.5至48小时施用复合物进行。优选地，这样的纳米颗粒复合物在亚治疗量的抗pd-l1抗体后约24小时施用。

在另一个方面中，本文提供了用于增强患有癌症(例如，表达或过表达pd-l1的癌症)的患者的治疗结果的方法，所述方法通过使用亚治疗量的抗pd-l1抗体(例如，未复合的抗pd-l1抗体，例如未结合于载体蛋白/紫杉醇复合物)治疗患者，并且使用有效量的纳米颗粒复合物共同治疗患者进行，所述纳米颗粒复合物包含白蛋白、紫杉醇和抗pd-l1抗体，其中所述复合物可以结合于pd-l1。在一个实施方案中，所述抗体布置在所述复合物的表面上。

在另一个方面中，本文提供了用于增强患有癌症(例如，表达或过表达pd-l1的癌症)的患者的治疗结果的方法，所述方法通过在任何使用纳米颗粒复合物的后续治疗之前使用亚治疗量的抗pd-l1抗体治疗患者进行，所述纳米颗粒复合物包含载体蛋白、紫杉醇和抗pd-l1抗体，其中所述复合物结合于pd-l1。在一个实施方案中，抗体布置在所述复合物的表面上。

在本发明的实施方案中，向患有癌症的受试者施用本文描述的方法，所述癌症包含表达pd-l1的细胞，但所述癌症对使用未与包含载体蛋白结合的化学治疗剂的纳米颗粒复合的抗pd-l1抗体的免疫治疗具有抗性，所述包含载体蛋白结合的化学治疗剂的纳米颗粒例如白蛋白结合的紫杉醇纳米颗粒，例如

已知表达pd-l1并因此适合使用本文公开的方法治疗的癌细胞的实例包括但不限于黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、merkel细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、血液癌症和其他实体癌，所述癌症表达pd-l1。

在一个实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗或其生物仿制药。阿特珠单抗(商品名tecentriq^tm)是针对pd-l1的igg1同种型的完全人源化的fc-修饰的单克隆抗体。其他抗pd-l1抗体包括mdx-1105，其为结合于pd-l1的完全人单克隆抗体；阿维鲁单抗(msb0010718c,merckkgaa,darmstadt,germany&pfizer)，其为同种型igg1的完全人单克隆pd-l1抗体；和度伐单抗(medimmune/astrazeneca)，其为fc优化的抗pd-l1mab。

在一个实施方案中，抗pd-l1抗体的亚治疗量选自抗pd-l1抗体的治疗剂量的约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％的量。预期亚治疗量的抗pd-l1抗体的施用优先阻断循环pd-l1，同时最小程度地阻断与肿瘤相关的pd-l1。在一些实施方案中，通过分析血液中循环pd-l1的水平来确定待向患者施用的亚治疗量的抗pd-l1。

在一个实施方案中，亚治疗量的抗pd-l1抗体在施用白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物之前约30分钟至约48小时施用。

在其他方面中，本文提供了抗pd-l1抗体的单位剂量制剂，例如，阿特珠单抗或其生物仿制药，所述制剂包含约1％至约60％的治疗剂量的抗体，其中所述制剂被包装以便于作为单位剂量施用。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体的制剂包含约5％至约20％的治疗剂量的阿特珠单抗或其生物仿制药。阿特珠单抗的治疗剂量，例如对于局部晚期或转移性尿路上皮癌，在处方信息中有叙述。治疗剂量为1200mg，并且优选地，亚治疗剂量为治疗剂量的5％至20％。在这样的优选的实施方案中，这样的亚治疗剂量将为60mg至240mg，更优选为120mg至160mg。

在其他方面中，本文提供了包含以下的试剂盒：(a)一定量的白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物，(b)单位剂量的亚治疗量的抗pd-l1抗体，和任选的(c)使用说明。

在一个实施方案中，试剂盒的载体结合的紫杉醇(例如，白蛋白-紫杉醇，例如，)/抗pd-l1抗体复合物是冻干的。冻干的复合物可以在施用前在水溶液中重构。水溶液可以是无菌水溶液，或重构的水溶液可以通过例如0.2或0.22μm过滤器过滤灭菌。

本发明的一个实施方案包括通过施用纳米颗粒复合物中的化学治疗剂来增加化学治疗剂的肿瘤摄取的持续时间的方法，所述纳米颗粒复合物包含载体蛋白、紫杉醇、化学治疗剂和pd-l1结合剂，例如抗-pd-l1抗体，所述pd-l1结合剂为纳米颗粒复合物到达肿瘤提供定向引导。在一些实施方案中，所述受试者在这样的纳米颗粒复合物之前或同时接受亚治疗量的抗pd-l1抗体。

附图说明

以下附图仅是本发明的代表，并非旨在作为限制。为了一致，使用和阿特珠单抗的纳米颗粒使用首字母缩写词“aa”，并且在aa之后的数字，如aa130旨在赋予这些纳米颗粒的平均粒度(以纳米计，基于malvernnanosight分析)。

图1显示阿特珠单抗和abx之间的结合亲和力。kd确定为1.462x10^-9。使用链霉亲和素探针进行生物膜干涉法(blitz)(fortebioscience)。

图2a显示了由mastersizerns300测定的单独的abx(平均尺寸为90nm)和abx-阿特珠单抗纳米颗粒(aa；平均尺寸为129nm)的粒度分布。图2b是来自图8a的abx-阿特珠单抗纳米颗粒的照片。

图3a-3e显示abx-阿特珠单抗纳米颗粒(aa130)的流式细胞术，其与标记的抗pd-l1抗体竞争结合于pd-l1阳性人黑色素瘤细胞系c8161。用同种型对照抗体预处理c8161细胞(图3a)，不处理c8161细胞(图3b)，用预处理c8161细胞(图3c)，用阿特珠单抗预处理c8161细胞(图3d)或用aa130预处理c8161细胞(图3e)，然后用荧光标记的抗pd-l1抗体标记。

图4显示abx(实线)和aa130(虚线)对c8161细胞的剂量依赖性毒性。

图5a-5d显示了注射2x10⁶个pd-l1阳性c8161黑色素瘤肿瘤细胞，然后通过100uliv尾静脉注射盐水(图5a)、单独的阿特珠单抗(18mg/kg；图5b)、单独的abx(45mg/kg；图5c)和aa130(18mg/kg阿特珠单抗和45mg/kgabx；图5d)处理一次的小鼠的肿瘤体积随时间的变化。每周监测肿瘤生长3次。肿瘤尺寸用下式计算：(长度×宽度²)/2。

图6描绘了来自图11a-11d中所示实验的小鼠的存活。使用graphpad软件生成kaplanmeier曲线。每组的中位存活对于盐水、阿特珠单抗、abraxane和aa130分别为14、13、16和21.5天。aa130和所有其他组之间的生存差异是显著的，盐水的p-值为0.0008，阿特珠单抗的p-值为0.0015，abx的p-值为0.0113。

具体实施方式

在阅读本说明书之后，对于本领域技术人员来说，如何在各种供选择的实施方案和供选择的应用中实施本发明将变得显而易见。

然而，本文将不描述本发明的所有各种实施方案。应当理解，这里给出的实施方案仅通过实例而非限制的方式来给出。因此，各种供选择的实施方案的详述不应被解释为将本发明的范围或广度限制为如下所述的。

在公开和描述本发明之前，应理解下面描述的方面不限于具体的组合物、制备该组合物的方法或其用途，因此当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅出于描述具体方面的目的，而不旨在是限制性的。

本发明的详细描述仅为了方便读者而分成各个部分，并且在任何部分中找到的公开内容可以与另一部分中的内容组合。为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，这些标题或副标题不意图影响本发明的范围。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本说明书和随后的权利要求中，将提及许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：

本文使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并不意图限制本发明。如本文所使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”也意图包括复数形式，除非上下文另有明确规定。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或情况发生的情况和不发生的情况。

术语“约”在数字指称，例如温度、时间、量、浓度等，包括范围之前使用时，表示近似值，其可以变化(+)或(-)10％、5％、1％或其间的任何子范围或子值。优选地，当关于剂量使用时，术语“约”意指剂量可以变化+/-10％。

“包含(comprising)”或“包含(comprises)”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于限定组合物和方法时，“基本上由……组成”将意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的要素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的发明的(多个)基本特征和新特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他成分的微量元素和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方案都在本发明的范围内。

如本文所使用，术语“亚治疗剂”用于描述低于常规用于治疗癌症的抗体量的抗体量。例如，亚治疗量是低于由制造商定义为治疗所需的量的量。

如本文所使用的术语“纳米颗粒”或“纳米颗粒组合物”是指具有至少一个尺寸小于5微米的颗粒。在优选的实施方案中，例如对于静脉内施用，颗粒小于1微米。对于直接施用，例如施用到肿瘤中，颗粒可以更大。本发明明确考虑甚至更大的颗粒。

在一个颗粒群体中，单个颗粒的尺寸分布在平均值附近。因此，群体的粒度可以用平均值表示，也可以用百分位数表示。d50是50％的颗粒落入其以下的粒度。10％的颗粒小于d10值，90％的颗粒小于d90。如果不清楚，“平均”尺寸相当于d50。因此，例如，aa130是指平均尺寸为130纳米(nm)的纳米颗粒。

术语“纳米颗粒”还可以包括较小单元纳米颗粒的离散多聚体。例如，320nm颗粒包含单位160nm纳米颗粒的二聚体。因此，如pct/us15/54295中所述的，如mastersizer2000(可得自malverninstrumentsltd,wocestershire,uk)所测定的，对于160nm纳米颗粒，多聚体将为约320nm、480nm、640nm、800nm、960nm、1120nm等。

本文所用的术语“生物仿制药”是指生物药品，其被认为在质量、安全性和功效上与创新公司销售的参考产品相当(公共卫生服务法(publichealthserviceact)第351(i)节(42u.s.c.262(i))。

如本文所使用的术语“载体蛋白”是指用于转运抗体和/或治疗剂的蛋白。本公开的抗体可以可逆地结合于载体蛋白。载体蛋白的实例在下面更详细地讨论。

本文所使用的术语“核心”是指纳米颗粒复合物的中心或内部部分，其可以由载体蛋白，载体蛋白和治疗剂，或其他药剂或药剂的组合组成。在一些实施方案中，抗体可与核心非共价缔合(复合)。

如本文所使用的，相对于癌症患者，术语“增强治疗结果”等是指癌细胞或实体瘤的生长减缓或减少，或癌细胞总数或总肿瘤负荷减少。

本文所使用的术语“治疗剂”是指治疗上有用的药剂，例如用于治疗、缓解或减轻疾病状态、生理状况、症状或病因学因素，或用于其评价或诊断的药剂。治疗剂可以是化学治疗剂，例如，有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、类固醇、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、烷化剂、酶、蛋白酶体抑制剂或其任何组合。

如本文所使用的，术语“结合剂”、“对……具有特异性的结合剂”或“特异性结合……的结合剂”是指结合靶抗原并且不显著结合不相关化合物的药剂。优选地，结合剂以高特异性结合靶抗原，其解离常数(kd)为10^-7m、10^-8m或10^-9m或更低。优选地，解离常数为约10^-7m至约10^-14m。可以在所公开的方法中有效使用的结合剂的实例包括但不限于，凝集素，蛋白和抗体，如单克隆抗体，例如人源化单克隆抗体、嵌合抗体或多克隆抗体，或其抗原结合片段，以及适体，融合蛋白和具有白蛋白结合基序或与白蛋白结合基序融合的适体。在一个实施方案中，结合剂是外源性抗体。外源性抗体是哺乳动物免疫系统不能在哺乳动物(例如人)中天然产生的抗体。

如本文所使用的，术语“抗pd-l1结合剂”、“对……具有特异性的抗pd-l1结合剂”或“特异性结合……的抗pd-l1结合剂”是指与pd-l1结合并且不与不相关的化合物显著结合的药剂。优选地，pd-l1结合剂以高特异性结合于pd-l1，其解离常数为10^-7m、10^-8m或10^-9m或更低。优选地，解离常数为约10^-7m至约10^-14m。可以在所公开的方法中有效使用的抗pd-l1结合剂的实例包括但不限于，抗体，如单克隆抗体，例如人源化单克隆抗体，嵌合抗体，或多克隆抗体，或其抗原结合片段，以及适体，融合蛋白和适体。优选地，结合剂具有白蛋白结合基序或与白蛋白结合基序融合。在一个实施方案中，抗pd-l1结合剂是外源性抗体。

本文所使用的术语“抗体”或“多个抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)。该术语还指由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链构成的抗体，以及多种形式，包括全长抗体及其部分；包括例如免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、cdr嫁接抗体、人源化抗体、fab、fab′、f(ab′)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、单结构域抗体(dab)、双抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体、其功能活性表位结合片段、双功能杂合抗体(例如，lanzavecchia等人.,eur.j.immunol.17,105(1987))和单链(例如，huston等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,85,5879-5883(1988)和bird等人,science242,423-426(1988)，其通过引用并入本文)。(一般参见hood等人.,immunology,benjamin,n.y.,第2版(1984)；harlow和lane,antibodies.alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory(1988)；hunkapiller和hood,nature,323,15-16(1986)，其通过引用并入本文)。抗体可以是任何类型(例如，igg、iga、igm、ige或igd)。优选地，抗体是igg。抗体可以是非人的(例如，来自小鼠、山羊或任何其他动物)、完全人的、人源化的或嵌合的。在一个实施方案中，抗体是外源抗体。外源性抗体是哺乳动物免疫系统不能在哺乳动物(例如人)中天然产生的抗体。

术语“解离常数”，也称为“kd”，是指表示特定物质分离成单个组分(例如，蛋白载体、抗体和/或治疗剂)的程度的量。

如本文所使用的术语“冻干的”、“冻干”等是指首先冷冻待干燥的材料(例如，纳米颗粒)，然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻的溶剂的方法。赋形剂任选地包含在预冻干制剂中以增强冻干产品在储存时的稳定性。在一些实施方案中，纳米颗粒复合物可在用作治疗剂之前由冻干组分(载体蛋白、抗体和治疗剂)形成。在其他实施方案中，首先将载体蛋白、抗体和治疗剂组合成纳米颗粒复合物，然后冻干。冻干样品还可以包含另外的赋形剂。

术语“缓冲液”包括在冻干前将溶液ph保持在可接受范围内的那些试剂，并且可以包括琥珀酸盐(琥珀酸钠或琥珀酸钾)、组氨酸、磷酸盐(磷酸钠或磷酸钾)、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐(柠檬酸钠)等。在一些实施方案中，本发明的缓冲液具有约5.5至约6.5的ph；并且优选具有约6.0的ph。将ph控制在该范围内的缓冲液的实例包括琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。

术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式使得活性成分有效，并且不包含对制剂所施用的受试者有毒的另外的成分。

“药学上可接受的”赋形剂(溶媒、添加剂)是可以合理地向受试哺乳动物施用以提供有效剂量的所用活性成分的赋形剂。

术语“重构时间”是将冻干制剂再水化成溶液所需的时间。

“稳定的”制剂是其中蛋白在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。

如本文所使用的术语“表位”是指抗体识别的抗原部分。表位包括但不限于能够与蛋白(例如抗体)或配体发生特异性相互作用的短氨基酸序列或肽(任选地糖基化或以其他方式修饰)。例如，表位可以是抗体的抗原结合位点连接的分子的部分。

术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖受试者(例如人)中的疾病或障碍(例如，癌症)的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即，阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即导致疾病或障碍消退；(iii)减缓疾病或障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指杀死癌细胞。

关于癌症治疗的术语“杀死”旨在包括将导致癌细胞或癌细胞群体的至少一部分死亡的任何类型的操作。

术语“剂量”是指给予有需要的患者的抗体或纳米颗粒复合物的量。主治医生将从基于例如患者的体重、年龄、健康、癌症阶段、循环pd-l1水平和其他相关因素的范围中选择合适的剂量，所有这些都在本领域技术内。

术语“单位剂量”是指给予患者以提供期望结果的抗体或纳米颗粒复合物的剂量。在一些情况下，单位剂量以亚治疗制剂(例如，治疗剂量的10％)出售。单位剂量可以作为单剂量或一系列亚剂量施用。在处方信息中阐述了针对给定的fda批准的适应症的抗体的治疗剂量，例如，作为每3周静脉内输注60或30分钟直至疾病进展或不可接受的毒性施用时，批准用于治疗患有局部晚期或转移性尿路上皮癌的患者的阿特珠单抗的治疗剂量为1200mg，并且优选地，亚治疗剂量为治疗剂量的5％至20％。在这样的优选实施方案中，这种亚治疗剂量范围为60mg/kg至240mg/kg，更优选120mg/kg至180mg/kg。在其中抗体尚未获得fda批准或抗体尚未被批准用于给定适应症的情况下，该适应症的抗体的治疗剂量将是与已经批准用于其他适应症的治疗剂量相关的量，因此非fda批准的适应症的亚治疗剂量容易地计算为治疗剂量的百分比(例如，治疗剂量的10％)。例如，用于治疗转移性黑素瘤的抗体的治疗剂量和因此用于治疗转移性黑素瘤的抗体的亚治疗剂量与已经批准的一般转移性癌症的治疗剂量相关。

另外，本说明书中使用的一些术语在下面更具体地定义。

概述

如本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的，本公开涉及用于治疗具有表达pd-l1的癌细胞的患者的方法，所述癌细胞特别是对使用抗pd-l1抗体免疫治疗的治疗具有抗性的癌细胞或已经变得对使用抗pd-l1抗体免疫治疗的治疗具有抗性的癌细胞，所述方法通过使用包含治疗有效量的紫杉醇的载体蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物治疗患者进行。

本公开还涉及用于治疗具有表达pd-l1的癌细胞的患者的方法，所述癌细胞特别是对使用抗pd-l1抗体免疫治疗的治疗具有抗性的癌细胞或已经变得对使用抗pd-l1抗体免疫治疗的治疗具有抗性的癌细胞，所述方法通过使用亚治疗量的抗pd-l1抗体和包含治疗有效量的紫杉醇的载体蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物治疗患者进行。

抗pd-l1抗体

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗或其生物仿制药。

阿特珠单抗(tecentriq^tm,roche,usa)是针对pd-l1的igg1同种型的完全人源化的fc修饰的单克隆抗体。阿特珠单抗是一种pd-l1阻断抗体，已被批准用于治疗患有局部晚期或转移性尿路上皮癌(包括膀胱癌)和非小细胞肺癌的患者。

其它抗pd-l1抗体也是本领域中已知的，例如，bms-936559/mdx-1105(bristolmyerssquibb)、medi4736(度伐单抗，medimmune/astrazeneca)和msb00100718c(阿维鲁单抗，emdserono)。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体的亚治疗量选自抗pd-l1抗体的治疗剂量的约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％的量。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体的亚治疗量是优先阻断循环pd-l1而不阻断与肿瘤相关的pd-l1的量。

复合物

适用于制备载体蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物的方法描述于例如，2014年10月6日提交的第62/060,484号美国临时申请；和2015年8月18日提交的第62/206,770号、第62/206,771号和第62/206,772号美国临时申请；以及2015年10月6日提交的第wo2016/057554号pct公开；和2013年9月30日提交的wo2014/055415。这些申请中的每一个的内容通过引用整体并入。下面的实施例1提供了制备这样的复合物的详细方案的一个实例。

可以用于本文所述的方法的纳米颗粒复合物还可包含除抗pd-l1抗体以外的pd-l1结合剂。这样的pd-l1结合剂包含pd-l1结合部分和白蛋白结合基序，其中pd-l1结合剂与载体蛋白结合的化学治疗剂的纳米颗粒，例如白蛋白结合的紫杉醇纳米颗粒(例如)复合，形成例如在冻干和重构后保留结合于pd-l1的能力的纳米颗粒复合物。例如，pd-l1结合剂可以是具有白蛋白结合基序或与白蛋白结合基序融合的pd-l1结合适体等。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗或其生物仿制药。在一些实施方案中，抗体是纳米颗粒的全部或部分表面上的基本上单层的抗体。在一些实施方案中，纳米颗粒复合物包含约100至1000个抗体，或约400至约800个抗体。

在一些实施方案中，载体蛋白是白蛋白，例如人血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是重组人血清白蛋白。

在一些实施方案中，所述复合物还包含至少一种另外的化学治疗剂，例如选自以下的化学治疗剂：阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西他赛、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼洛替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂(picoplatin)、罗米地辛、沙铂(satraplatin)、索拉非尼、维罗非尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三铂(triplatin)、长春碱、长春瑞滨、长春新碱和环磷酰胺。

在一些实施方案中，载体结合的化学治疗剂是白蛋白结合的紫杉醇，例如，(celgene)。

在一个实施方案中，纳米颗粒复合物的抗体整合到纳米颗粒复合物上和/或纳米颗粒复合物中，例在白蛋白结合的紫杉醇核心的表面上。在一个实施方案中，纳米颗粒复合物的抗体布置在载体蛋白(例如白蛋白)结合的紫杉醇核心的表面上。在一个实施方案中，纳米颗粒复合物的抗体与白蛋白结合的紫杉醇核心缔合。在一个实施方案中，纳米颗粒复合物的抗体与纳米颗粒复合物中的载体蛋白(例如，白蛋白)非共价缔合(结合)。在一个实施方案中，载体蛋白(例如，白蛋白)和紫杉醇通过非共价键缔合(彼此结合)。

在本发明的一些实施方案中，包含纳米颗粒复合物的组合物还可以包含另外的化学治疗剂。另外的化学治疗剂可以是例如烷化剂，例如铂化合物，例如卡铂。

在一些实施方案中，纳米颗粒复合物尺寸为0.09μm至0.9μm，90nm至800nm，包括约90nm、100nm、130nm、160nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm。在一些实施方案中，纳米颗粒复合物尺寸为约100nm至约225nm。在其他实施方案中，纳米颗粒复合物更大，例如，大于800nm至约3.5μm。在一些实施方案中，颗粒是纳米颗粒复合物的多聚体。在一些实施方案中，新鲜制备的或在冷冻干燥和再悬浮于适用于注射的水溶液中之后的纳米颗粒复合物具有约100nm至约225nm的平均粒度。

不受理论束缚，认为结合剂通过疏水相互作用被载体蛋白结合，所述疏水相互作用本质上是弱的。然而，尽管组合物被冻干和重构，但各组分的活性以及它们在纳米颗粒中的相对关系得以保持。还进一步考虑通过结合剂上的白蛋白结合基序和/或载体蛋白上的抗体结合基序发生与载体蛋白的结合，例如结合剂与载体蛋白的复合。白蛋白结合基序和抗体结合基序描述于2017年8月4日提交的第pct/us17/45643号pct申请中，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，结合剂是非治疗性和非内源性人抗体，融合蛋白，例如抗体fc结构域与结合靶抗原的肽的融合，或适体。

治疗方法

在一个方面中，提供了用于治疗患有表达pd-l1的癌症的患者的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的抗pd-l1/白蛋白/紫杉醇纳米颗粒以治疗癌症。在一个实施方案中，该方法包括选择患有表达pd-l1的癌症的患者。在一个实施方案中，该方法包括选择患有表达pd-l1并且对使用检查点抑制剂免疫治疗的治疗具有抗性的癌症的患者。在一个实施方案中，检查点抑制剂免疫治疗包括不是如本文所述的纳米颗粒复合物的部分的抗pd-l1抗体。

在一个方面中，提供了用于治疗有需要的患者的方法，其中所述患者用亚治疗量的抗pd-l1抗体和包含治疗有效量的紫杉醇的白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物治疗，使得亚治疗量的抗pd-l1抗体的施用增强了纳米颗粒复合物的功效。有需要的受试者可以是患有癌症的受试者，其中癌细胞表达或过表达pd-l1。受试者还可能患有癌症，其中癌细胞表达或过表达pd-l1但对使用抗pd-l1抗体免疫治疗的治疗具有抗性。在一个实施方案中，亚治疗量的抗pd-l1抗体不在包含载体蛋白(例如，白蛋白)结合的化学治疗剂的纳米颗粒复合物中(“未复合的”抗pd-l1抗体)。

在一个实施方案中，所述方法包括选择患有癌症的患者，其中癌细胞表达或过表达pd-l1。在一个实施方案中，所述方法包括选择患有癌症的患者，其中癌细胞表达或过表达pd-l1但对使用抗pd-l1抗体免疫治疗的治疗具有抗性。本领域已知用于确定肿瘤是否包含表达pd-l1的癌细胞的方法，例如ventanapd-l1(sp263)分析(roche)，其被fda批准作为提供患有转移性尿路上皮癌的患者的pd-l1状态的补充诊断，以及pd-l1ihc28-8pharmdx分析(dako,agilentpathologysolutions)。

在本发明的一些实施方案中，纳米颗粒复合物包含除抗pd-l1抗体以外的pd-l1结合剂。在本发明的一些实施方案中，纳米颗粒复合物包含抗pd-l1抗体，其是与“未复合的”抗pd-l1抗体相同的抗体。在本发明的一些实施方案中，纳米颗粒复合物包含抗pd-l1抗体，其是与“未复合的”抗pd-l1抗体不同的抗体。

可以使用亚治疗量的抗pd-l1抗体和载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物共同治疗患者。

为了清楚起见，“共同治疗”是指在施用载体(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物之前、同时或之后用抗pd-l1抗体治疗表达pd-l1的癌症，使得抗pd-l1抗体能够结合循环pd-l1。

在一个实施方案中，在施用纳米颗粒复合物之前，以亚治疗剂量施用抗pd-l1抗体。在该实施方案中，抗pd-l1抗体的施用在施用纳米颗粒复合物之前约0.5小时至约48小时发生。

在另一个实施方案中，在施用纳米颗粒复合物之前0.5小时和在施用纳米颗粒复合物之后最多0.5小时之间施用抗pd-l1抗体组合物。然而，在该实施方案中，预期这样的施用将导致一些循环pd-l1被抗体结合。

在又一个实施方案中，抗体组合物可以在施用纳米颗粒复合物之后最多2小时施用。

在一个优选的方面中，提供了通过在使用亚治疗量的抗pd-l1抗体预治疗患者之后约0.5小时至48小时施用白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物来增强白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物的功效的方法。优选地，在亚治疗量的抗pd-l1抗体之后约24小时施用这样的纳米颗粒复合物。

在另一个方面中，提供了用于增强患有表达pd-l1的癌症的患者的治疗结果的方法，该患者被选择用包含白蛋白、紫杉醇和抗pd-l1抗体的纳米颗粒治疗，所述方法包括在使用、用纳米颗粒进行任何后续治疗之前，使用亚治疗量的抗pd-l1抗体治疗患者。

在另一个方面中，提供了用于增强患有过表达pd-l1的癌症的患者的治疗结果的方法，该方法包括使用亚治疗量的抗pd-l1抗体和使用有效量的包含白蛋白结合的紫杉醇和抗pd-l1抗体的纳米颗粒复合物共同治疗患者。

在另一个方面中，提供了用于增强患有表达pd-l1的癌症的患者的治疗结果的方法，所述患者待使用包含白蛋白、紫杉醇和抗pd-l1抗体的纳米颗粒复合物治疗，所述方法包括在施用纳米颗粒的+/-0.5小时内用亚治疗量的抗pd-l1抗体治疗患者。

在另一个方面中，提供了用于增强患有过表达pd-l1的癌症的患者的治疗结果的方法，所述患者已经使用亚治疗量的抗pd-l1抗体治疗，所述方法包括治疗在施用抗体的+/-0.5小时内用有效量的包含白蛋白结合的紫杉醇和抗pd-l1抗体的纳米颗粒治疗患者。

在一些实施方案中，在载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物之前施用抗pd-l1抗体，例如，可以在施用载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物之前数分钟、数小时或数天施用抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，在施用载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物之前约5至约59分钟、约10至约50分钟、约15至约45分钟、约20至约40分钟、约25至约35分钟施用抗pd-l1抗体。在其他实施方案中，可以在施用载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或更长施用抗pd-l1抗体。在其他实施方案中，可以在施用载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物之前约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约10天、约12天、约15天或更长施用抗pd-l1抗体。预期的值包括任何所述范围或值内的任何值、子范围或范围，包括端点。

在一些实施方案中，可以在施用载体蛋白(例如，白蛋白)/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物的同时施用抗pd-l1抗体，例如，彼此间隔在10分钟内或更短。

在其他实施方案中，抗pd-l1抗体可以在施用白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物之后施用，例如，在施用白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物后2小时内施用。

可以通过本文所述的组合物和方法治疗的癌症或肿瘤包括但不限于：胆管癌；脑癌，包括胶质母细胞瘤和成神经管细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；血液肿瘤，包括急性淋巴细胞性和髓性白血病；多发性骨髓瘤；aids相关白血病和成人t细胞白血病淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括博文氏病和佩吉特氏病；肝癌(肝癌(hepatocarcinoma))；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏病和淋巴细胞淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑色素瘤、卡波西氏肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括胚组织瘤(精原细胞瘤、非精原细胞瘤[畸胎瘤、绒毛膜癌])、间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；和肾癌，包括腺癌和维尔姆斯瘤。适合使用本文所述的方法治疗的癌症包括但不限于表达或过表达pd-l1的癌症。可以使用本文公开的方法治疗的癌症还包括对使用抗pd-l1抗体免疫治疗的治疗具有抗性的癌症，包括已经响应免疫治疗但对抗pd-l1抗体免疫治疗产生抗性的癌症，所述抗pd-l1抗体不与包含载体蛋白(例如，白蛋白)结合的化学治疗剂的纳米颗粒(例如，)复合。

抗体制剂

在一个方面中，抗pd-l1抗体是抗pd-l1抗体的单位剂量制剂，所述制剂包含约1％至约60％的治疗剂量的抗体，其中所述制剂被包装以便于作为单位剂量施用。在本发明的一个方面中，抗pd-l1抗体的单位剂量制剂包含约10％的治疗剂量的抗体。例如10％的治疗剂量的抗pd-l1抗体，例如阿特珠单抗可以是60mg至240mg。

抗pd-l1抗体的单位剂量制剂可以是约1％至约60％、约5％至约50％、约10％至约40％、约15％至约30％、约20％至约25％的治疗剂量的抗pd-l1抗体。预期的值包括任何所述范围或值内的任何值、子范围或范围，包括端点。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗或其生物仿制药，所述制剂包含约5％至约20％的治疗剂量的阿特珠单抗或其生物仿制药。

在另一个方面中，本文提供了包含本文提供的抗pd-l1抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂的制剂。

通常，本文提供的单位剂量制剂可以配制用于通过任何可接受的施用方式向患者施用。本领域可获得各种制剂和药物递送系统。参见例如，remington'spharmaceuticalsciences,e.w.martin编(mackpublishingcompany,第18版,1990)。

通常，本文提供的单位剂量制剂将通过以下途径中的任一种作为药物组合物施用：口服、全身(例如，经皮、鼻内或通过栓剂)或肠胃外(例如，肌肉内、静脉内或皮下)施用。

单位剂量制剂通常可以包含抗pd-l1抗体，任选与至少一种药学上可接受的赋形剂组合。可接受的赋形剂是无毒的，有助于施用，并且不会不利地影响所要求保护的化合物的治疗益处。这样的赋形剂可以是任何固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下，可以是本领域技术人员通常可获得的气态赋形剂。

纳米颗粒复合物制剂

在一个方面中，本文所述的包含纳米颗粒复合物的组合物配制用于全身递送，例如静脉内施用。

在一个方面中，纳米颗粒组合物配制用于直接注射到肿瘤中。直接注射包括注射到肿瘤部位中或靠近肿瘤部位，灌注到肿瘤中等。因为纳米颗粒组合物不是全身施用的，所以配制用于直接注射到肿瘤中的纳米颗粒组合物可以包含任何平均粒度。不受理论束缚，认为较大的颗粒(例如，大于500nm，大于1μm等)更可能被固定在肿瘤内，从而提供被认为是更好的有益效果。

在另一个方面中，本文提供了包含本文提供的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。

通常，本文提供的化合物可以配制用于通过任何可接受的施用方式向患者施用。本领域可获得各种制剂和药物递送系统。参见例如，gennaro,a.r.编(1995)remington'spharmaceuticalsciences,第18版,mackpublishingco.。

通常，本文提供的化合物将通过以下途径中的任一种作为药物组合物施用：口服、全身(例如，经皮、鼻内或通过栓剂)或肠胃外(例如，肌肉内、静脉内或皮下)施用。

本文描述的制剂可以包括赋形剂。固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可以选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的液体载体，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和二醇。其他适合的药物赋形剂及其制剂描述于remington'spharmaceuticalsciences,e.w.martin编(mackpublishingcompany,第18版,1990)。

如果需要，本发明的制剂可以在包含单位剂量的活性成分的包装或分配器装置中提供。这种包装或装置可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装，或玻璃，以及橡胶塞，如小瓶中的橡胶塞。包装或分配器装置可附有施用说明。还可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明的单位剂量制剂的组合物，其置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的病症。

试剂盒

在一些方面中，本发明涉及试剂盒，其包含：(a)一定量的白蛋白-/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物，(b)单位剂量的亚治疗量的抗pd-l1抗体，和任选的(c)使用说明。

在一些实施方案中，试剂盒可以包含冻干的白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体的复合物。

在一些优选的实施方案中，试剂盒组分可以以这样的方式配置，使得以其使用顺序获取组分。例如，在一些方面中，试剂盒可以配置成使得在打开或被使用者获取时，可用的第一组分是单位剂量的亚治疗量的抗pd-l1抗体，例如，在第一小瓶中。然后可以获取包括或包含一定量的白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体纳米颗粒复合物的第二容器(例如，小瓶)。因此，可以以这样的方式直观地配置试剂盒，使得在打开第二个小瓶之前必须打开第一个小瓶。应当理解，在一些实施方案中，顺序可以是不同的，例如，在施用抗体之前需要首先施用复合物。此外，它可以配置成使得两者同时施用。最后，应该理解的是，可以包括另外的任一种或两种组分的小瓶或容器，并且配置成以任何期望的顺序打开。例如，第一个小瓶可以是抗体，第二个小瓶可以包含复合物，第三个小瓶可以包含抗体或复合物中的任一种，等等。预期的是，以这种方式配置的试剂盒将防止或至少有助于防止不按使用说明书意图的顺序施用组分。

在一些方面中，本发明涉及用于施用白蛋白/紫杉醇/抗pd-l1抗体复合物和单位剂量的亚治疗量的抗pd-l1抗体的多组分试剂盒(kitofparts)；并且任选地还包括在可读介质中的给药治疗方案。在一些实施方案中，给药方案包括提供达到期望的平均血清水平所需的亚治疗量的抗pd-l1抗体。在一些实施方案中，多组分试剂盒包括给药方案，所述给药方案为主治医生提供基于患者的性别、患者的质量和临床医生希望达到的血清水平选择亚治疗量的抗pd-l1抗体的给药方案的能力。在一些实施方案中，给药治疗基于患者血液中循环pd-l1的水平。在一些实施方案中，给药方案还基于患者的体重(或质量)和性别提供对应于患者血液体积的信息。在一个实施方案中，存储介质可以包括伴随试剂盒中的单位剂量形式的随附手册或类似的书面信息。在一个实施方案中，存储介质可以包括电子、光学或其他数据存储器，如非易失性存储器，例如以存储这样的信息的数字编码的机器可读表示。

本文使用的术语“可读介质”是指可以例如由人或机器可以读取的数据表示。人可读格式的非限制性实例包括手册、插页或其他书面形式。机器可读格式的非限制性实例包括以机器(例如，计算机、平板电脑和/或智能手机)可读的形式提供(即，存储和/或传输)信息的任何机制。例如，机器可读介质包括只读存储器(rom)；随机存取存储器(ram)；磁盘存储介质；光存储介质；和闪存设备。在一个实施方案中，机器可读介质是cd-rom。在一个实施方案中，机器可读介质是usb驱动器。在一个实施方案中，机器可读介质是快速响应码(qr码)或其他矩阵条形码。

实施例

使用阿特珠单抗(即，tecentriq^tm)预治疗，接着用由白蛋白结合的紫杉醇(即，)和阿特珠单抗(即，tecentriq^tm)组成的纳米颗粒治疗来说明本发明。

本领域技术人员将理解，实施例的制备和使用纳米颗粒以及施用阿特珠单抗的共同治疗仅出于说明的目的，并且本公开内容不受该说明的限制。

本文使用的任何缩写具有正常的科学含义。除非另有说明，否则所有温度均为℃。在本文中，除非另有定义，否则以下术语具有以下含义：

实施例1：制备阿特珠单抗-纳米颗粒

将阿特珠单抗和(abx)在室温下分别以4mg/ml和10mg/ml的浓度共温育30分钟，以形成纳米颗粒aa130。

为了确定阿特珠单抗和abx是否能够相互作用以形成纳米颗粒复合物，使用链霉亲和素探针进行生物膜干涉法(blitz)(fortebioscience)。将1xpbs中的100ug/ml生物素化的阿特珠单抗与链霉亲和素探针结合。在从探针洗下未结合的阿特珠单抗后，将抗体结合的探针暴露于在1xpbs中的100、500、1000μg/ml浓度的abx。将暴露于pbs的抗体探针用作背景并扣除背景。blitz软件用于计算解离常数(图1)。kd测定为1.462x10^-9。

实施例2：阿特珠单抗-纳米颗粒的尺寸测定

使用mastersizerns300测定阿特珠单抗结合的abx相对于单独的abx的粒度。nanosight使用动态光散射和布朗运动来计算粒度。

如上所述，将阿特珠单抗和abx共温育以形成纳米颗粒aa130。将abx以1:200稀释，并将阿特珠单抗结合的abx以1:800稀释；捕获并分析三个30秒的视频剪辑以确定粒度(图2a)。图2b是来自aa130的视频剪辑之一的静止图像。测定阿特珠单抗-abx纳米颗粒的平均粒度为约129nm；单独的abx的平均尺寸为约90nm。

实施例3：aa130结合pd-l1

进行流式细胞术以获得阿特珠单抗和阿特珠单抗结合的abraxane与配体pd-l1的结合。pd-l1阳性黑色素瘤细胞系c8161用于该实验。如上所述制备aa130，并将等分的纳米颗粒以6000rpm旋转10分钟以除去任何未结合的阿特珠单抗。c8161细胞分别用fitc标记的同种型对照和抗人pd-l1作为阴性和阳性对照染色。将c8161细胞与abx和单独的阿特珠单抗以及aa130纳米颗粒温育30分钟。温育后，用fitc标记的抗人pd-l1标记细胞30分钟，并用facs缓冲液(11xpbs+0.5％bsa和0.05％叠氮化钠)洗涤。洗涤后，通过流式细胞仪在guava8ht上分析细胞，并用gauvasoft软件(millipore)进行数据分析。

用同种型对照抗体预处理c8161细胞(图3a)，不处理c8161细胞(图3b)，用预处理c8161细胞(图3c)，用阿特珠单抗预处理c8161细胞(图3d)或用aa130预处理c8161细胞(图3e)，然后用荧光标记的抗pd-l1抗体标记。在130nm颗粒的条件下的阿特珠单抗保留其结合其配体pd-l1的能力。

实施例4：aa130细胞毒性

将c8161黑色素瘤细胞以0至200μg/ml的紫杉醇浓度暴露于abx和aa130过夜以确定细胞毒性。还将细胞与胸苷类似物edu一起温育。第二天收获细胞，用2％多聚甲醛固定并用1％皂苷透化。透化后，将细胞与fitc标记的抗-edu抗体一起温育30分钟，以确定细胞增殖的百分比。洗涤后，通过流式细胞仪在guava8ht上分析细胞，并用gauvasoft软件(millipore)进行数据分析。通过归一化至未处理的阳性对照来计算增殖指数。

图4显示abx(实线)和aa130(虚线)对c8161细胞的剂量依赖性毒性。aa130纳米颗粒复合物具有与单独的abx类似的细胞毒性。

实施例5：aa130纳米颗粒复合物的静脉内制剂的制备

为了在人中使用，通过获得25mg/mlatz的剂量适当数量的4ml小瓶并按照以下指示将每个小瓶稀释至4mg/ml来制备aa130复合物。通过重构至含有10mg/mlabx纳米颗粒的最终浓度来制备abx的剂量适当数量的100mg小瓶。使用无菌3ml注射器抽出1.6ml(40mg)的阿特珠单抗(25mg/ml)并在最少1分钟内缓慢注射到含有100mgabx的每个小瓶的内壁上。不应将阿特珠单抗溶液直接注射到冻干饼上，因为这会导致起泡。然后，使用无菌的12ml无菌注射器，抽出8.4ml0.9％氯化钠注射液(usp)，并在最少1分钟内将8.4ml缓慢注入含有abx100mg和atz40mg的每个小瓶的内壁上。一旦完成添加atz1.6ml和0.9％氯化钠注射液(usp)8.4ml，将每个小瓶轻轻旋转和/或缓慢倒置至少2分钟，直至任何饼/粉末完全溶解。应避免产生泡沫。此时，每个小瓶的浓度应为100mg/10mlabx和40mg/10mlatz。含有abx和atz的小瓶应静置60分钟。每10分钟轻轻地旋转和/或倒置(多个)小瓶以继续混合复合物。经过60分钟后，从每个小瓶中抽出计算的abx和atz的给药体积，并缓慢加入空的viaflex袋中。然后加入等体积的0.9％氯化钠注射液(usp)，使abx的最终浓度为5mg/ml，atz为2mg/ml。然后将袋轻轻旋转和/或缓慢倒置1分钟以混合。abx:atz纳米颗粒在最终稀释后在室温下储存长达4小时。

实施例6：与atz的共同治疗改善abx/atz复合物的靶向

向无胸腺裸鼠的右侧腹部注射1x10⁶个a375人黑色素瘤细胞，然后用pbs、12mg/kgatz、30mg/kgabx、aa130治疗，或用1.2mg/kgatz预治疗，并在24小时后用aa130治疗。aa130如在第pct/us15/54295号pct申请和上述实施例1中所述制备。预期仅有使用aa130治疗的小鼠(在用或不用atz预治疗的情况下)将显示平均肿瘤体积减少。

还预期相对于对照或单独的atz或单独的abx，使用atz预治疗将与肿瘤体积的统计学显著降低相关。

在用盐水(pbs)、tecentriq^tm(atz)、(abx)、aa130治疗后第15天，或在用atz预治疗一天后用aa130治疗(atz+aa130)后第15天测量肿瘤。与给予单独的atz或aa130同期群组的剂量相比，10％亚治疗剂量的atz在施用aa130前24小时给予atz+aa130同期群组。预期的是，即使与aa130相比，atz+aa130同期群组也将呈现延迟的肿瘤生长。预期这些实验将显示用atz+aa130预治疗提高存活。

在第40天再次评估存活率。预期用atz预治疗和aa130治疗的小鼠的中位存活将超过仅用pbs或atz治疗的小鼠的中值存活。

实施例7：alexafluor750标记的纳米颗粒随时间的荧光

用等量的标记的或按照上述实施例1的与阿特珠单抗(atz)表面复合的的纳米颗粒(aa130)iv注射小鼠；一个aa130组的小鼠接受1.2mg/kg阿特珠单抗的预治疗。荧光成像在710/760的激发/发射光谱下进行。通过软件分配小鼠中的感兴趣区域(roi)以基于荧光阈值追踪肿瘤积累。在注射后24、29和48小时测定所有三个治疗组的每单位面积背景roi和肿瘤roi的荧光。

测定24、29和48小时的肿瘤和背景roi中的荧光的量(从而测定紫杉醇的量)，并且预期的是，数据将显示与单独的aa130或单独的abraxane相比，用atz预治疗导致更高水平的肿瘤荧光。预期用atz预治疗和使用与atz表面复合的纳米颗粒提供了在24小时和48小时两者都增加包含化学治疗剂的白蛋白的肿瘤摄取的持续时间的方法。还考虑的是，在用或不用atz在48小时预治疗的情况下，使用与atz表面复合的纳米颗粒也增加这些包含白蛋白的纳米颗粒的肿瘤摄取的持续时间。

不受任何理论的限制，白蛋白纳米颗粒的抗体涂层可能通过降低肝脏或肾脏清除率和/或通过降低白蛋白载体的蛋白酶降解来赋予稳定性。

实施例8：aa130纳米颗粒的体内功效

向无胸腺裸鼠(harlanspraguedawley)注射2x10⁶个pd-l1阳性c8161黑色素瘤肿瘤细胞。允许肿瘤生长直至约600mm³，并通过100μliv尾静脉注射盐水、单独的阿特珠单抗(18mg/kg)、单独的abx(45mg/kg)和aa130(18mg/kg阿特珠单抗和45mg/kgabx)一次进行治疗(图5a-5d)。每周监测肿瘤生长3次。肿瘤尺寸用下式计算：(长度×宽度²)/2。

肿瘤生长曲线(图6)显示相对于盐水和单独的药物，用aa130治疗的小鼠中肿瘤生长减慢。使用graphpad软件生成kaplanmeier曲线。对于盐水、阿特珠单抗、abx和aa130，每组的中位存活分别为14、13、16和21.5天。aa130与所有其他组之间的存活率差异显著，盐水的p值为0.0008，阿特珠单抗的p值为0.0015，abraxane的p值为0.0113。