骨相关病症影响数百万个体，经常造成痛苦和令人虚弱的症状。骨质疏松症(一种常见的代谢骨相关病症)特征为渐进性骨量丢失，其至少部分地因破骨细胞骨吸收相对于成骨细胞骨形成而言过多产生。与骨质疏松相关的骨量丢失置骨于更大的骨折风险。骨质疏松相关性骨量丢失的长期结局可以导致严重的身体后果，包括骨折、慢性疼痛、失能和/或活动受限(immobility)，以及导致骨骼不能为身体提供足够的结构性支撑。
rankl是蛋白质tnf-超家族的成员并且在骨重塑中发挥重要作用。rankl由成骨细胞表达并且在破骨细胞和破骨细胞前体细胞的表面上结合其同族受体rank。rankl与rank的结合诱导成熟破骨细胞的形成、活化和存活及对胞内信号传导级联的刺激，导致骨吸收增加。本领域已知针对rankl的中和抗体。例如，美国专利号6,740,522公开了抗rankl抗体，包括按照名称
骨质疏松相关性骨折构成卫生保健系统的主要健康顾虑和经济负担。根据美国国家骨质疏松基金会，990万美国人患有骨质疏松症并且另外4310万遭遇低骨密度。每年，超过二百万例骨折和超过四十万例入院归因于骨质疏松症。美国外科医生总会评估骨质疏松相关性骨折每年导致120和180亿美元之间的直接护理支出。
当前疗法不可用于与其他药剂如抗再吸收或同化化合物的联用或联合配制。另外，缺少可用于体内临床前模型如鼠模型中研究的抗rankl抗体。因此，仍需要针对骨相关病症或癌所致骨骼异常的备选疗法，它们可能为患者带来更好的结局。这类备选疗法将优选地能够在治疗骨相关病症如骨质疏松症、骨质减少和关节炎(如类风湿性关节炎)以及治疗癌(如非小细胞肺癌和多发性骨髓瘤)所致骨骼异常方面显示疗效。本发明的抗体提供预期满足以上至少一种需求的备选疗法。
本发明提供结合人rankl的抗体，其中这些抗体包含轻链可变区(lcvr)和重链可变区(hcvr)，其中lcvr包含互补决定区(cdr)lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且hcvr包含cdrhcdr1、hcdr2和hcdr3，其中lcdr1的氨基酸序列是seqidno:12，lcdr2的氨基酸序列是seqidno:13，lcdr3的氨基酸序列是seqidno:14，hcdr1的氨基酸序列是seqidno:9，hcdr2的氨基酸序列是seqidno:10，并且hcdr3的氨基酸序列是seqidno:11。在一些具体实施方案中，由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置6处的xaa是ala；由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置14处的xaa是pro；并且由seqidno:14给出的氨基酸序列中位置4处的xaa是trp。在其他的具体实施方案中，由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置6处的xaa是arg；由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置14处的xaa是tyr；并且由seqidno:14给出的氨基酸序列中位置4处的xaa是asn。
在一些具体实施方案中，本发明提供抗体，其中lcvr具有由seqidno:4或seqidno:8给出的氨基酸序列，并且hcvr具有由seqidno:3或seqidno:7给出的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，lcvr具有由seqidno:4给出的氨基酸序列，并且hcvr具有由seqidno:3给出的氨基酸序列。在其他的具体实施方案中，lcvr具有由seqidno:8给出的氨基酸序列，并且hcvr具有由seqidno:7给出的氨基酸序列。
在一些具体实施方案中，本发明提供抗体，其中lc具有由seqidno:2或seqidno:6给出的氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明提供抗体，其中hc具有由seqidno:1或seqidno:5给出的氨基酸序列。在一些此类实施方案中，lc具有由seqidno:2给出的氨基酸序列，并且hc具有由seqidno:1给出的氨基酸序列。在其他的此类实施方案中，lc具有由seqidno:6给出的氨基酸序列，并且hc具有由seqidno:5给出的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体结合人rankl。在其他的这类实施方案中，本发明的抗体结合鼠rankl。在其他的这类实施方案中，本发明的抗体结合人rankl和鼠rankl。
本发明还涉及编码本发明抗体的核酸分子和表达载体。在一个实施方案中，本发明提供一种dna分子，其包含编码hc的多核苷酸序列，其中hc的氨基酸序列是seqidno:1。根据某些的这类实施方案，该dna分子具有由seqidno:15给出的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，本发明还提供一种dna分子，其包含编码lc的多核苷酸序列，其中lc的氨基酸序列是seqidno:2。根据某些的这类实施方案，该dna分子具有由seqidno:16给出的多核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供一种dna分子，其包含编码具有seqidno:1的氨基酸序列的hc的多核苷酸序列，并包含编码具有seqidno:2的氨基酸序列的lc的多核苷酸序列。在一个具体实施方案中，编码具有seqidno:1的氨基酸序列的hc的多核苷酸序列由seqidno:15给出，并且编码具有seqidno:2的氨基酸序列的lc的多核苷酸序列由seqidno:16给出。
本发明还提供用dna分子转化的哺乳动物细胞，所述细胞能够表达包含本发明hc和lc的抗体，其中hc具有由seqidno:1给出的氨基酸序列并且lc具有由seqidno:2给出的氨基酸序列。另外，本发明提供用于产生包含hc和lc的抗体的方法，所述方法包括在如此条件下培育哺乳动物细胞，从而表达本发明的抗体。本发明还提供通过所述方法产生的抗体。本发明还提供用dna分子转化的哺乳动物细胞，所述细胞能够表达包含本发明的两个hc和两个lc的抗体，其中每个hc具有由seqidno:1给出的氨基酸序列并且每个lc具有由seqidno:2给出的氨基酸序列。另外，本发明提供用于产生包含两个hc和两个lc的抗体的方法，所述方法包括在如此条件下培育哺乳动物细胞，从而表达本发明的抗体。本发明还提供通过所述方法产生的抗体。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明的抗体和一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。本发明的药物组合物可以用于治疗骨相关病症，其中这类治疗包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。在一些此类实施方案中，骨相关病症是骨质疏松症、骨质减少和关节炎(如类风湿性关节炎)中的一者或多者。在其他的这类实施方案中，本发明的药物组合物可以用于治疗癌所致骨骼异常，其中这类治疗包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明药物组合物。在具体的实施方案中，癌症是非小细胞肺癌和多发性骨髓瘤中一者或多者。
本发明还提供一种治疗骨相关病症或癌所致骨骼异常的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明抗体。在一些此类实施方案中，骨相关病症是骨质疏松症。在一些此类实施方案中，骨相关病症是骨质减少。在一些此类实施方案中，骨相关病症是关节炎。在一个更具体的实施方案中，骨相关病症是类风湿性关节炎。在其他的这类实施方案中，骨相关病症是骨质疏松症、骨质减少和关节炎(如类风湿性关节炎)中的一者或多者。本发明还提供一种治疗非小细胞肺癌所致骨骼异常和多发性骨髓瘤所致骨骼异常中一者或多者的方法。
本发明还提供用于疗法中的本发明抗体或其药物组合物。更具体地，本发明提供用于治疗骨质疏松症、骨质减少和关节炎(如类风湿性关节炎)中一者或多者的本发明抗体或其药物组合物。本发明还提供治疗非小细胞肺癌所致骨骼异常和多发性骨髓瘤所致骨骼异常中一者或多者的本发明抗体或其药物组合物。
本发明还提供本发明的抗体或其药物组合物在制造用于治疗骨相关病症或癌所致骨骼异常的药物中的用途。根据一些具体实施方案，本发明提供在制造用于治疗骨质疏松症、骨质减少和关节炎(如类风湿性关节炎)中至少一者或多者的药物中的本发明抗体或其药物组合物。本发明还提供在制造用于治疗非小细胞肺癌所致骨骼异常和多发性骨髓瘤所致骨骼异常中一者或多者的药物中的本发明抗体或其药物组合物。
在一个实施方案中，本发明的抗体在seqidno:17的残基89-97中一者或多者处和其残基125-132中一者或多者处结合人rankl。在另一个实施方案中，本发明的抗体结合人rankl上的表位，其中该表位包含seqidno:17的残基89-97中的至少一个氨基酸及其残基125-132中的至少一个氨基酸。在又一个实施方案中，该表位包含seqidno:17的残基89-97中的至少两个氨基酸及其残基125-132中的至少两个氨基酸。在另外的又一实施方案中，该表位包含seqidno:17的残基89-97中的至少三个氨基酸及其残基125-132中的至少三个氨基酸。在另外的又一实施方案中，该表位包含seqidno:17的残基89-97中的至少四个氨基酸及其残基125-132范围内的至少四个氨基酸。在另外的又一实施方案中，该表位包含seqidno:17的残基89-97中的至少五个氨基酸及其残基125-132中的至少五个氨基酸。
在一个实施方案中，本发明提供能够与包含lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3的抗体竞争性结合人rankl的抗体，其中lcdr1的氨基酸序列是seqidno:12，lcdr2的氨基酸序列是seqidno:13，lcdr3的氨基酸序列是seqidno:14，hcdr1的氨基酸序列是seqidno:9，hcdr2的氨基酸序列是seqidno:10，并且hcdr3的氨基酸序列是seqidno:11。在一个更具体的实施方案中，由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置6处的xaa是ala；由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置14处的xaa是pro；并且由seqidno:14给出的氨基酸序列中位置4处的xaa是trp。在另一个更具体的实施方案中，由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置6处的xaa是arg；由seqidno:11给出的氨基酸序列中位置14处的xaa是tyr；并且由seqidno:14给出的氨基酸序列中位置4处的xaa是asn。
如本文所用，“抗体”可以是人、人源化、鼠、或小鼠-大鼠嵌合体。抗体是包含通过二硫键互联的2个hc和2个lc的免疫球蛋白分子。每个lc和hc的氨基端部分包括主要负责借助其中所含的cdr识别抗原的约100-120个氨基酸的可变区。cdr散布有命名为框架区(“fr”)的更保守区域。每个lcvr和hcvr由从氨基端至羧基端按以下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4排列的3个cdr和4个fr组成。lc的3个cdr称作“lcdr1、lcdr2和lcdr3”并且hc的3个cdr称作“hcdr1、hcdr2和hcdr3”。cdr含有大部分与抗原形成特异性相互作用的残基。抗体结合特定抗原的功能能力主要受六个cdr影响。基于熟知的kabat编号惯例(kabat等人,ann.nyacad.sci.190:382-93(1971)；kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版,美国卫生和公众服务部,nih出版编号91-3242(1991))和north编号惯例(north等人,anewclusteringofantibodycdrloopconformations,journalofmolecularbiology,406:228-256(2011))，将氨基酸指定至本发明抗体的lcvr内和hcvr区内部的cdr结构域上。根据表1定义本发明抗体的cdr。
表1.用来定义本发明抗体的cdr的cdr编号惯例。
本发明的抗体是单克隆抗体(“mab”)。本发明的mab是含有2个hc和2个lc的完整mab。如本文提到，mab是这样的抗体，其源自单拷贝或克隆(例如，包括任何真核、原核或噬菌体克隆)并且不源自借以产生它的方法。例如,可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(例如cdr移植)或这类技术或本领域已知的其他技术组合产生单克隆抗体。用于产生和纯化抗体的方法是本领域熟知的并且可以在例如harlow和lane(1988)antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y,第5-8章和第15章,isbn0-87969-314-2中找到。
本发明的单克隆抗体可以使用已知的方法制备并纯化的。例如，可以将编码hc(例如，由seqidno:1给出的氨基酸序列)和lc(例如，由seqidno:2给出的氨基酸序列)的cdna序列克隆并工程化入gs(谷氨酰胺合成酶)表达载体。工程化的免疫球蛋白表达载体随后可以稳定转染入cho细胞。如本领域技术人员将领会，抗体的哺乳动物表达将导致糖基化，一般在fc区内高度保守的n-糖基化位点处糖基化。可以验证稳定的克隆表达与rankl特异性结合的抗体。可以将阳性克隆扩增入无血清培养基，以便在生物反应器中产生抗体。可以通过常规技术纯化抗体已经分泌其中的培养基。例如，可以将培养基便利地施加至蛋白a或蛋白gsepharoseff柱，所述柱已经用相容性缓冲液(如磷酸缓冲盐水)平衡。所述柱经洗涤以除去非特异性结合组分。洗脱结合的抗体，例如，通过ph梯度洗脱，并且检测抗体级分，如通过sds-page，并且随后汇集。可以使用常规技术，浓缩和/或无菌过滤抗体。可以通过常规技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析有效地移除可溶性聚集物和多聚体。产物可以立即冷冻，例如在-70℃立即冷冻，或可以冻干。
本发明的单克隆抗体可以用于治疗患者。更具体地，本发明的抗体预期治疗骨相关病症如骨质疏松症、骨质减少和关节炎(如类风湿性关节炎)以及癌(如非小细胞肺癌和多发性骨髓瘤)所致骨骼异常。如本文中可互换使用，“治疗”和/或“治疗”和/或“治疗”意指全部过程,其中可以延缓、中断、中止、控制、阻止或逆转本文所述病症之进展，但不必然地标明总体消除全部病症症状。治疗包括施用本发明的抗体以治疗将会从rankl活性降低获益的人类中的疾病或病状，并且包括：(a)抑制疾病进一步进展；和(b)减轻疾病，即，造成疾病或病症消退或缓解其症状或并发症。
如本文中可互换使用，术语“患者”指人。在某些实施方案中，患者进一步用将会从rankl活性降低获益的疾病、病症或病状(例如，骨相关病症)表征。
如本文所用，术语“结合”(或“结合”)rankl指抗体与人rankl的表位相互作用。优选地，“结合”指本发明抗体与表位相互作用，如通过氢氘交换所测定(例如，参见实施例4)。优选地，该表位是人rankl的构象表位。在一个实施方案中，术语“结合”(或“结合”)rankl指与人rankl的构象表位相互作用，其中该表位是seqidno:17的残基89-97中的一者或多者处及其残基125-132中的一者或多者。在另一个实施方案中，该表位是seqidno:17的残基89-97中的至少两个氨基酸及其残基125-132中的至少两个氨基酸。在另一个实施方案中，该表位是seqidno:17的残基89-97中的至少三个氨基酸及其残基125-132中的至少三个氨基酸。在另一个实施方案中，该表位是seqidno:17的残基89-97中的至少四个氨基酸及其残基125-132范围内的至少四个氨基酸。在另一个实施方案中，该构象表位是seqidno:17的残基89-97中的至少五个氨基酸及其残基125-132中的至少五个氨基酸。
如本文所用的术语“表位”指抗原的由本发明单克隆抗体识别的离散的三维位点。该表位可以通过本领域目前已知的方法如氢氘交换、丙氨酸扫描法或x射线结晶学确定。如本文所用，“竞争性”或“竞争”指能够抑制或阻断本发明任一种抗体与人rankl结合的抗体。例如，如果在另一种抗体存在下本发明任一种抗体与人rankl的结合作用减少或完全丧失，则抗体能够抑制或阻断结合作用。
本发明的单克隆抗体可以掺入药物组合物中，所述药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备并且包含本发明的单克隆抗体和一种或多种可药用的载体和/或稀释剂。
包含本发明单克隆抗体的药物组合物可以通过肠胃外途径(例如，皮下、静脉内、腹膜内、肌内或经皮)施用至面临如本文所述疾病或病症的风险或表现出如本文所述疾病或病症的患者。本发明的药物组合物含有“有效量”或“治疗有效量”(如本文中可互换使用)的本发明单克隆抗体。有效量指为实现预期治疗结果而必需(在多个剂量并持续多个时间和对于施用手段而言必需)的量。单克隆抗体的有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和单克隆抗体在个体中引发所需反应的能力而变动。有效量也是这样一个量，其中本发明单克隆抗体的任何有毒或有害作用为治疗有益作用所超过。
实施例
实施例1：抗体表达和纯化
示例的本发明抗体基本上如下表达并纯化。含有由seqidno:15(编码seqidno:1的所示例重链)和seqidno:16(编码seqidno:2的所示例轻链)给出的多核苷酸序列的谷氨酰胺合成酶(gs)表达载体用来通过电穿孔法转染中国仓鼠细胞系(cho，gs敲除)。该表达载体编码sv早期(猿猴病毒40e)启动子和gs基因。gs的表达允许生物化学合成为cho细胞必需的氨基酸—谷氨酰胺。转染后，细胞接受50uml-甲硫氨酸硫酰亚胺(msx)的集团选择。利用msx对gs的抑制增加选择的严格性。可以针对cho野生型细胞，选择具有表达载体cdna整合入宿主细胞基因组的转录活跃区内的细胞。转染的汇集物按低密度平板接种以允许稳定表达细胞的接近集落的生长晕(close-to-clonaloutgrowth)。对主孔筛选抗体表达并且随后按无血清、悬浮培养放大以用于生产。
可以将其中已经分泌有所示例抗体的澄清的培养基施加至蛋白a亲和柱，所述柱已经用相容性缓冲液(如磷酸缓冲盐水(ph7.4))平衡。所述柱经洗涤以除去非特异性结合组分。洗脱结合的抗体，例如，通过ph梯度洗脱，并且用tris，ph8缓冲液中和。检测抗体级分，如通过sds-page或分析性大小排阻法，并且随后汇集。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、capto多模式色谱、离子交换或羟基磷灰石色谱有效地移除可溶性聚集物和多聚体。使用常见技术，浓缩和/或无菌过滤抗体。这些色谱步骤后，所示例抗体的纯度大于98％(单体)。抗体可以立即冷冻在-70℃或储存在4℃数月。
实施例2：结合亲和力
使用多个分析循环评价结合作用。每个循环按20ul/分钟的流速下进行。将浓度2ug/ml的约10ul实施例1所示例抗体上样，旨在捕获约100-200rus；注射250ul人rankl(对于每个循环，始于5nm并且使用两倍连续稀释物)，给予解离过程十分钟，并且10ul10mm甘氨酸盐酸盐，ph1.5用于再生。使用biaevaluation软件中的“1:1附传质”结合模型，评价每个循环的结合和解离速率。
在实施例1的所示例抗体的工程化期间，确定在hcdr3的倒数第三位置(例如，由seqidno:11给出的hcdr3的残基12)处存在亮氨酸对于赋予本发明抗体对人rankl的工程化的改进亲和力为必需的。例如，在定向突变分析中，如果亮氨酸在hcdr3的倒数第三位置处不存在(例如，将异亮氨酸置换亮氨酸)，则对本发明抗体的附加氨基酸变化不能够增加针对rankl的亲和力。
根据基本上如上文所述的程序，该抗体以2.82pm的kd结合人rankl，以34.43pm的kd结合大鼠rankl并且以6.64pm的kd结合小鼠rankl。这些数据显示实施例1的所示例抗体对人和鼠rankl具有高亲和结合作用，kd小于10pm。
实施例3：体外中和rankl诱导的nf-kb驱动的萤光素酶活性
稳定共表达人rank和nf-kb驱动的萤光素酶报道分子的hek293细胞用来评估实施例1所示例抗体中和rankl活性的能力。在这个hek293细胞模型中，被人rankl结合时，rank诱导了导致萤光素酶发光的nf-kb信号转导。通过萤光素酶发光减少，测量实施例1所示例抗体对rankl与rank结合作用的中和。
hek293细胞在选择性压力700ug/ml遗传霉素(geneticin)下常规培养。将25,000个细胞/孔在分析培养基(含有0.5％fbs，20nmhepes，1xglutamax和1x青霉素/链霉素的50uldmem/f12(1:3)培养基)中添加至96孔组织培养板的各孔。将细胞在37℃温育(连同5％co2和95％湿度)过夜。
包含1nm浓度和10nm浓度人rankl的分析培养基用来制备实施例1所示例抗体的10nm至0.005nm的剂量范围(1:3连续稀释)，并将各剂量在室温温育15分钟。分析培养基用于“仅培养基”对照。此后，添加50ul抗体至含有已培养细胞的50ul培养基并且在37℃温育过夜。
在温育过夜后，移除现有生长培养基并将细胞悬浮于1l1％tritionx-100裂解缓冲液(30mltritonx-100，3mlmgcl，108.15ml1mtrizmahcl，41.85ml1mtrizma碱和817mlh2o)中的50ulbuglite(2.296gdtt(sigma)，1.152g辅酶a和0.248gatp)内。随后将细胞在平板摇床上温和振荡下裂解5至10分钟。在细胞裂解后，在平板读数仪(envision平板读数仪)上测量发光。使用三参数逻辑回归模型用graphpadprism6计算全部处理组的ic50值。
按照基本上如上文所述的程序，与人rankl结合的抗体的ic50是0.069nm。结果显示，实施例1的所示例抗体中和人rankl诱导的nf-kb驱动的萤光素酶发光。在hek293细胞模型中在测试的任何浓度，培养基对照均不中和人rankl诱导的nf-kb驱动的萤光素酶发光。
实施例4：依据氢氘交换的表位定位
进行氢氘交换联合质谱法(hdxms)以测定实施例1所示例抗体在何处结合rankl蛋白。这种方法已经成功地用来定位几种抗体的表位(obungu等人2009biochemistry,48:7251-60；lu等人2005biochemistry44:11106-14)。
通过将10μg人rankl溶液与10μg实施例1所示例抗体混合并且随后用1xpbs稀释，产生rankl/抗体复合物。用于蛋白质表面标记研究的复合物经乙酸羟琥珀酰亚胺酯标记，并且通过将4μlrankl/抗体复合物与16μl100％d2o(在交换期间80％d)混合并将混合物在环境温度保持60秒，进行hdxms分析。将交换物用50μl0.1nhcl在
遵循基本上如上文所述的程序，二种人rankl肽(239-272和281-290)显示明显的负δ。这个分析显示，实施例1所示例抗体的rankl表位是构象表位并且是seqidno:17的氨基酸89-97和125-132。第一区域(89-97)与人和啮齿类rankl相同。另一个区域(125-132)在人和啮齿类rankl中均相同，例外是位置129中的单个氨基酸差异，其中在啮齿类rankl中，丝氨酸由丙氨酸替换。
实施例5：使用完好雌鼠模型体评估对骨量密度的影响。
20-22周龄c57/b6完好雌小鼠(charlesriver)在22℃按12小时光/暗循环维持饲养，随意取食(含0.72％ca和0.61％p的td2014，维生素d0.99iu/g，teklad,madison，wi)和饮水。
将小鼠分成用每周皮下注射10mg/kg实施例1所示例抗体(n＝6只动物)或pbs溶媒对照处理的动物。在四周时处死小鼠。使用alokalathetaltc-100型ct扫描仪，通过定量性计算机断层成像(qct)监测股骨远端和股骨中段的骨量密度(bmd)。
遵循基本上如上文所述的程序，与对照动物相比，经抗体处理的动物具有23％的远端股骨bmd增加和4％的股骨中段bmc增加。这些结果表明，每周一次给予实施例1所示例抗体的动物在股骨远端和股骨中段均具有增加的bmd。
实施例6：切除卵巢的鼠模型中的体内效力分析
使用切除卵巢的鼠模型评估对骨量密度的体内影响。20周龄雌性c57/b6小鼠(harlan，印第安纳波利斯，in)进行卵巢切除(或假性手术对照组)并按12小时光/暗循环在22℃维持饲养，随意取食(含0.72％ca和0.61％p的td2014，维生素d0.99iu/g，madison，wi)和饮水。在小鼠中通过允许切除卵巢的小鼠丢失骨量六周时间确立骨质减少。
在六周骨质减少确立期后，将小鼠分成治疗组(n＝6只动物/组)或溶媒pbs对照组。每个治疗组的小鼠接受每周一次皮下注射3mg/kg或10mg/kg实施例1的示例抗体或pbs。在四周时处死小鼠。处死后，使用alokalathetaltc-100型ct扫描仪，通过定量性计算机断层成像(qct)评估第5椎骨的骨骼骨量密度(bmd)。
按照基本上如上文所述的程序，与对照相比，经3mg/kg抗体处理的动物具有2％的bmd增加，并且经10mg/kg抗体处理的动物具有11％的bmd增加。这些结果显示，每周给药一次时，实施例1的示例抗体在切除卵巢的小鼠中导致椎骨bmd的剂量依赖性增加。
实施例7：切除睾丸的鼠模型中的体内效力分析
使用切除睾丸的鼠模型评估对骨量密度和骨矿物质含量的体内影响。对16周龄雄性c57/b6小鼠(harlan，印第安纳波利斯，in)进行睾丸切除(或溶媒对照组，n＝6)并按12小时光/暗循环在22℃维持饲养，随意取食(含0.72％ca和0.61％p的td2014，维生素d0.99iu/g，madison，wi)和饮水。在切除睾丸的小鼠中通过允许小鼠丢失骨量六周时间确立骨质减少。
在六周骨质减少确立期后，9只小鼠接受皮下注射2mg/kg剂量实施例1的示例抗体，每周两次。注射pbs的动物充当对照。在两周时处死小鼠。使用alokalathetaltc-100型ct扫描仪，通过定量性计算机断层成像(qct)评估股骨远端的骨量密度(bmd)和腰椎的骨矿物质含量(bmc)。
遵循基本上如上文所述的程序，与对照动物相比，经抗体治疗的小鼠具有19％的股骨远端bmd增加和13％的腰椎增加。这些结果显示经实施例1的示例抗体治疗在切除睾丸的小鼠中导致股骨远端和腰椎的bmd增加。
序列
示例性hc(seqidno:1)
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyaftnyyiewvrqapgqglewmgvinpgwgdtnynekfkgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarrdtahgyyaldpwgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg
示例性lc(seqidno:2)
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqnvgtnvawyqqkpgkapklliysasyrysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqywdypltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
示例性hcvr(seqidno:3)
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyaftnyyiewvrqapgqglewmgvinpgwgdtnynekfkgrvtitadkststaymelsslrsedtavyycarrdtahgyyaldpwgqgttvtvss
示例性lcvr(seqidno:4)
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqnvgtnvawyqqkpgkapklliysasyrysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqywdypltfgggtkveik
示例性hc(seqidno:5)
qvqlqqsgaelvrpgtsvkvsckasgyaftnyyiewlkqrpgqglewigvinpgwgdtnynekfkgkatltadkssstaymqlssltsddsavffcarrdtrhgyyaldywgqgtsvtvssakttppsvyplapgtalksnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgalssgvhtfpavlqsglytltssvtvpsstwpsqtvtcnvahpasstkvdkkivprncggdckpcictgsevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdisqddpevhfswfvddvevhtaqtrppeeqfnstfrsvselpilhqdwlngrtfrckvtsaafpspiektiskpegrtqvphvytmsptkeemtqnevsitcmvkgfyppdiyvewqmngqpqenykntpptmdtdgsyflysklnvkkekwqqgntftcsvlheglhnhhtekslshspg
示例性lc(seqidno:6)
divmtqsqkfmstsvgdrvsvtckasqnvgtnvawyqqkpgqspkaliysasyrysgvpdrftgsgsgtdftltisnvqsedlaeyfcqqyndypltfgagtrleikradaaptvsifppsteqlatggasvvclmnnfyprdisvkwkidgterrdgvldsvtdqdskdstysmsstlslskadyeshnlytcevvhktssspvvksfnrnec
示例性hcvr(seqidno:7)
qvqlqqsgaelvrpgtsvkvsckasgyaftnyyiewlkqrpgqglewigvinpgwgdtnynekfkgkatltadkssstaymqlssltsddsavffcarrdtrhgyyaldywgqgtsvtvss
示例性lcvr(seqidno:8)
divmtqsqkfmstsvgdrvsvtckasqnvgtnvawyqqkpgqspkaliysasyrysgvpdrftgsgsgtdftltisnvqsedlaeyfcqqyndypltfgagtrleik
示例性hcdr1(seqidno:9)
kasgyaftnyyie
示例性hcdr2(seqidno:10)
vinpgwgdtnynekfkg
示例性hcdr3(seqidno:11)
arrdtxhgyyaldx
其中位置6处的x是ala或arg，并且位置14处的x是pro或tyr。
示例性lcdr1(seqidno:12)
kasqnvgtnva
示例性lcdr2(seqidno:13)
ysasyrys
示例性lcdr3(seqidno:14)
qqyxdyplt
其中位置4处的x是trp或asn。
编码seqidno:1的hc蛋白的示例性dna(seqidno:15)
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggctacgccttcaccaactactatatcgagtgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcaaccccggctggggcgacacgaactacaacgagaagttcaagggcagagtcaccattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacgcgatacggctcacggctactacgcccttgatccgtggggccaaggaaccacggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccatcggtcttcccgctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggt
编码seqidno:2的lc的示例性dna(seqidno:16)
gacatccagatgacccagtctccatcctctctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcaaggccagccagaatgtgggcaccaacgtggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatagcgccagctacagatacagcggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcagtactgggactaccccctgaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacggactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgc
rankl胞外结构域(seqidno:17)
mskleaqpfahltinatdipsgshkvslsswyhdrgwakisnmtfsngklivnqdgfyylyanicfrhhetsgdlateylqlmvyvtktsikipsshtlmkggstkywsgnsefhfysinvggffklrsgeeisievsnpslldpdqdatyfgafkvrdid