嵌合抗原受体及使用方法与流程

本申请要求临时申请ussn62/362,746(2016年7月15日提交)、ussn62/405,180(2016年10月6日提交)和ussn62/503,127(2017年5月8日提交)的权益，其各自的内容通过引用以其整体并入本文。

并入序列表

命名为“poth-008_001wo_seqlist”的文本文件的内容，其于2017年7月13日创建，文件大小为55kb，通过引用以其整体并入本文。

本公开内容的领域

本公开内容涉及分子生物学，且更特别地涉及嵌合抗原受体、含有一个或多个car的转座子，以及制备和使用它们的方法。

背景

本领域对于不使用传统的抗体序列或其片段来指导免疫细胞特异性的方法，一直有长期存在但尚未得到满足的需求。本公开内容提供一种优越的嵌合抗原受体。

概述

本公开内容提供一种嵌合抗原受体(car)，其包含：(a)包含抗原识别区的胞外结构域，其中抗原识别区包含至少一个centyrin；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。如贯穿本公开内容所用的，包含centyrin的car被称为cartyrin。在某些实施方案中，抗原识别区可包含两个centyrin以产生一种双特异性或串联car。在某些实施方案中，抗原识别区可包含3个centyrin以产生一种三特异性car。在某些实施方案中，胞外结构域可进一步包含信号肽。可供选择地，或者另外，在某些实施方案中，胞外结构域可进一步包含抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链。

本公开内容提供一种嵌合抗原受体(car)，其包含：(a)包含抗原识别区的胞外结构域，其中抗原识别区包含至少一个蛋白支架或抗体模拟物；(b)跨膜结构域，和(c)包含至少一个共刺激结构域的胞内结构域。在某些实施方案中，抗原识别区可包含两个支架蛋白或抗体模拟物，以产生一种双特异性或串联car。在某些实施方案中，抗原识别区可包含3个蛋白支架或抗体模拟物以产生一种三特异性car。在某些实施方案中，胞外结构域可进一步包含信号肽。可供选择地，或者另外，在某些实施方案中，胞外结构域可进一步包含抗原识别区和跨膜结构域之间的铰链。

在本公开内容的car的某些实施方案中，信号肽可包含编码人cd2、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd8α、cd19、cd28、4-1bb或gm-csfr信号肽的序列。在本公开内容的car的某些实施方案中，信号肽可包含编码人cd8α信号肽的序列。人cd8α信号肽可包含含有malpvtalllplalllhaarp(seqidno:3)的氨基酸序列。人cd8α信号肽可包含含有malpvtalllplalllhaarp(seqidno:3)的氨基酸序列或与含有malpvtalllplalllhaarp(seqidno:3)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。人cd8α信号肽可由包含atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca(seqidno:45)的核酸序列编码。

在本公开内容的car的某些实施方案中，跨膜结构域可包含编码人cd2、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd8α、cd19、cd28、4-1bb或gm-csfr跨膜结构域的序列。在本公开内容的car的某些实施方案中，跨膜结构域可包含编码人cd8α跨膜结构域的序列。cd8α跨膜结构域可包含含有iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:4)的氨基酸序列或与包含iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seqidno:4)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。cd8α跨膜结构域可由包含atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc(seqidno:5)的核酸序列编码。

在本公开内容的car的某些实施方案中，胞内结构域可包含人cd3ζ胞内结构域。

在本公开内容的car的某些实施方案中，至少一个共刺激结构域可包含人4-1bb、cd28、cd40、icos、myd88、ox-40胞内段，或其任何组合。在本公开内容的car的某些实施方案中，至少一个共刺激结构域可包含cd28和/或4-1bb共刺激结构域。cd28共刺激结构域可包含含有rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:6)的氨基酸序列或与包含rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno:6)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。cd28共刺激结构域可由包含cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg(seqidno:7)的核酸序列编码。4-1bb共刺激结构域可包含含有krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:8)的氨基酸序列或与包含krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel(seqidno:8)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。4-1bb共刺激结构域可由包含aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg(seqidno:9)的核酸序列编码。4-1bb共刺激结构域可位于跨膜结构域和cd28共刺激结构域之间。

在本公开内容的car的某些实施方案中，铰链可包含源自人cd8α、igg4和/或cd4序列的序列。在本公开内容的car的某些实施方案中，铰链可包含源自人cd8α序列的序列。铰链可包含含有tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seqidno:10)的人cd8α氨基酸序列或与包含tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seqidno:10)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。人cd8α铰链氨基酸序列可由包含actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac(seqidno:11)的核酸序列编码。

本公开内容的centyrin可包含蛋白支架，其中支架能够特异性地结合抗原。本公开内容的centyrin可包含含有至少一个纤连蛋白iii型(fn3)结构域的共有序列的蛋白支架，其中支架能够特异性地结合抗原。至少一个纤连蛋白iii型(fn3)结构域可源自人蛋白。人蛋白可以是生腱蛋白-c(tenascin-c)。共有序列可包含lpapknlvvsevtedslrlswtapdaafdsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaeftt(seqidno:1)或mlpapknlvvsevtedslrlswtapdaafdsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaeftt(seqidno:13)。共有序列可由包含atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca(seqidno:14)的核酸序列编码。共有序列可在以下环内的一个或多个位置被修饰：(a)包含在共有序列的位置13-16的氨基酸残基teds(seqidno:15)或由它们组成的a-b环；(b)包含在共有序列的位置22-28的氨基酸残基tapdaaf(seqidno:16)或由它们组成的b-c环；(c)包含在共有序列的位置38-43的氨基酸残基sekvge(seqidno:17)或由它们组成的c-d环；(d)包含在共有序列的位置51-54的氨基酸残基gser(seqidno:18)或由它们组成的d-e环；(e)包含在共有序列的位置60-64氨基酸残基glkpg(seqidno:19)或由它们组成的e-f环；(f)包含在共有序列的位置75-81的氨基酸残基kgghrsn(seqidno:20)或由它们组成的f-g环；或(g)(a)-(f)的任何组合。本公开内容的centyrin可包含至少5个纤连蛋白iii型(fn3)结构域、至少10个纤连蛋白iii型(fn3)结构域或至少15个纤连蛋白iii型(fn3)结构域的共有序列。所述支架可结合具有选自小于或等于10-9m，小于或等于10-10m，小于或等于10-11m，小于或等于10-12m，小于或等于10-13m，小于或等于10-14m，和小于或等于10-15m的kd的至少一个亲和力的抗原。kd可由表面等离子体共振测定。

本公开内容提供抗-bcmacartyrin(在此称为a08)，其具有包含：mgvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkleggggsgfgdvgaleslrgnadlayilsmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcfnflrkklffktsgsgegrgslltcgdveenpgpmalpvtalllplalllhaarpmlpapknlvvsritedsarlswtapdaafdsfpiryietliwgeaiwldvpgsersydltglkpgteyavvitgvkggrfssplvasftttttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprgsgegrgslltcgdveenpgpmvgslncivavsqnmgigkngdfpwpplrnesryfqrmtttssvegkqnlvimgkktwfsipeknrplkgrinlvlsrelkeppqgahflsrslddalklteqpelankvdmvwivggssvykeamnhpghlklfvtrimqdfesdtffpeidlekykllpeypgvlsdvqeekgikykfevyeknd(seqidno:21，粗体序列包含a08centyrin的氨基酸序列)的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开内容的a08cartyrin可由包含：atgggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttccggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggaccaatggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagaccaatgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgagccggatcacagaggactccgccagactgtcttggaccgcccctgacgccgccttcgattcctttccaatccggtacatcgagacactgatctggggcgaggccatctggctggacgtgcccggctctgagaggagctacgatctgacaggcctgaagcctggcaccgagtatgcagtggtcatcacaggagtgaagggcggcaggttcagctcccctctggtggcctcttttaccacaaccacaacccctgcccccagacctcccacacccgcccctaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgacatctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgcaagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctgcgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaaggggaagtggagaaggacgaggatcactgctgacatgcggcgacgtggaggaaaaccctggcccaatggtcgggtctctgaattgtatcgtcgccgtgagtcagaacatgggcattgggaagaatggcgatttcccatggccacctctgcgcaacgagtcccgatactttcagcggatgacaactacctcctctgtggaagggaaacagaatctggtcatcatgggaaagaaaacttggttcagcattccagagaagaaccggcccctgaaaggcagaatcaatctggtgctgtcccgagaactgaaggagccaccacagggagctcactttctgagccggtccctggacgatgcactgaagctgacagaacagcctgagctggccaacaaagtcgatatggtgtggatcgtcgggggaagttcagtgtataaggaggccatgaatcaccccggccatctgaaactgttcgtcacacggatcatgcaggactttgagagcgatactttctttcctgaaattgacctggagaagtacaaactgctgcccgaatatcctggcgtgctgtccgatgtccaggaagagaaaggcatcaaatacaagttcgaggtctatgagaagaatgac(seqidno:22，该序列在此也称为p-bmca-101的开放阅读框(orf))的核酸序列编码。

本公开内容提供一种包含本公开内容的car和至少一种药学上可接受的载体的组合物。

本公开内容提供一种包含本公开内容的car的转座子。

本公开内容的转座子可包含用于表达转座子的细胞的鉴定、富集和/或分离的选择基因。示例性选择基因编码为细胞生存和存活所必需的任何基因产物(如转录子(transcript)、蛋白、酶)。示例性选择基因编码对于赋予对药物挑战的抗药性至关重要的任何基因产物(如转录子、蛋白、酶)，在选择基因编码的基因产物的不存在下，细胞对于药物挑战是敏感的(或者可能对细胞是致命的)。示例性选择基因在缺乏为细胞生存和/或存活所必需的一种或多种营养素的细胞培养基中(在选择基因的不存在下)，编码为生存和/或存活所必需的任何基因产物(如转录子、蛋白、酶)。示例性选择基因包括，但不限于neo(赋予对新霉素的抗药性)、dhfr(编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、tyms(编码胸苷酸合成酶)、mgmt(编码o(6)-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶)、多药耐药基因(mdr1)、aldh1(编码醛脱氢酶1家族，成员a1)、francf、rad51c(编码rad51paralogc)、gcs(编码葡糖基神经酰胺合酶)，和nkx2.2(编码nk2同源异型框2)。

本公开内容的转座子可包含诱导型前凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“ic9安全开关”。在某些实施方案中，本公开内容的转座子可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的转座子可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的转座子可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)截短的半胱天冬酶9多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，配体结合区可包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽。在某些实施方案中，包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v)。在某些实施方案中，fkbp12多肽由包含gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle(seqidno:23)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，fkbp12多肽由包含ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggag(seqidno:24)的核酸序列编码。在某些实施方案中，对配体结合区特异性的诱导剂可包含具有缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v)的fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽，包括ap20187和/或ap1903两种合成药物。

在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含ggggs(seqidno:25)的氨基酸或包含ggaggaggaggatcc(seqidno:26)的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限切酶位点。

在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(r)的氨基酸序列编码。可供选择地，或者另外，在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(a)的氨基酸序列编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由包含gfgdvgaleslrgnadlayislmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcnflrkklffkts(seqidno:27)的氨基酸或包含tttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc(seqidno:28)的核酸序列编码。

在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽，诱导型前凋亡多肽由包含gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklegggggsgfgdvgaleslrgnadlayislmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcnflrkklffkts(seqidno:29)的氨基酸序列或包含ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccgaatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc(seqidno:30)的核酸序列编码。

本公开内容的转座子可包含至少一个自切肽，其位于，例如，本公开内容的蛋白支架、centyrin或cartyrin的一个或多个和本公开内容的选择基因之间。本公开内容的转座子可包含至少一个自切肽，其位于，例如，本公开内容的蛋白支架、centyrin或cartyrin的一个或多个和本公开内容的诱导型前凋亡多肽之间。本公开内容的转座子可包含至少两个自切肽，第一个自切肽位于，例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上游，而第二个自切肽位于，例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。

至少一个自切肽可包含，例如，t2a肽、gsg-t2a肽、e2a肽、gsg-e2a肽、f2a肽、gsg-f2a肽、p2a肽，或gsg-p2a肽。t2a肽可包含含有egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列或与包含egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(seqidno:33)的核酸序列。e2a肽可包含含有qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列或与包含qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-e2a肽可包含含有gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列或与包含gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。f2a肽可包含含有vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列或与包含vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-f2a肽可包含含有gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列或与包含gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。p2a肽可包含含有atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列或与包含atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-p2a肽可包含含有gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸或序列与包含gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。

本公开内容的转座子可包含第一个和第二个自切肽，第一个自切肽位于，例如，本公开内容的蛋白支架、centyrin或cartyrin的一个或多个的上游，第二个自切肽位于，例如，本公开内容的蛋白支架、centyrin或cartyrin的一个或多个的下游。第一个和/或第二个自切肽可包含，例如，t2a肽、gsg-t2a肽、e2a肽、gsg-e2a肽、f2a肽、gsg-f2a肽、p2a肽，或gsg-p2a肽。t2a肽可包含含有egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列或与包含egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(seqidno:33)的核酸序列包。e2a肽可包含含有qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列或与包含qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-e2a肽可包含含有gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列或与包含gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。f2a肽可包含含有vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列或与包含vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-f2a肽可包含含有gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列或与包含gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。p2a肽可包含含有atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列或与包含atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-p2a肽可包含含有gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸序列或与包含gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。

本公开内容提供一种包含本公开内容的转座子的组合物。在某些实施方案中，组合物可进一步包含含有编码转座酶的序列的质粒。编码转座酶的序列可以是mrna序列。

本公开内容的转座子可包含piggybac转座子。在这种方法的某些实施方案中，转座子是具有编码嵌合抗原受体的序列的质粒dna转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggybac转座子。本公开内容的转座酶可包含piggybac转座酶或相容酶(compatibleenzymes)。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggybac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggybac™或超级piggybac™(spb)转座酶。在某些实施方案中，且特别是在其中转座酶是超级piggybac™(spb)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mrna序列。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggybac™(pb)转座酶。piggybac(pb)转座酶可包含与以下序列之间有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成：

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在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggybac™(pb)转座酶，所述氨基酸序列具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个处的氨基酸取代：

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541pgtsddsteepvmkkrtyctycpskirrkanasckkckkvicrehnidmcqscf(seqidno:12)。

在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggybac™(pb)转座酶，所述氨基酸序列具有在seqidno:12序列的位置30、165、282或538的两个或更多个的氨基酸取代。在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggybac™(pb)转座酶，所述氨基酸序列具有在seqidno:12序列的3个或多于3个位置30、165、282或538的氨基酸取代。在某些实施方案中，转座酶是包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的piggybac™(pb)转座酶，所述氨基酸序列具有在seqidno:12序列的以下位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代异亮氨酸(i)。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代甘氨酸(g)。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代天冬酰胺(n)。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggybac™(spbo)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的超级piggybac™(spbo)转座酶可包含seqidno:12序列的氨基酸序列或由seqidno:12序列的氨基酸序列组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代异亮氨酸(i)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代甘氨酸(g)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)，和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代天冬酰胺(n)。在某些实施方案中，超级piggybac™(spbo)转座酶可包含与以下氨基酸序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成：

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541pgtsddsteepvmkkrtyctycpskirrkanasckkckkvicrehnidmcqscf(seqidno:2)。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的一个或多个以下位置的氨基酸取代：位置3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™或超级piggybac™转座酶可进一步包含在46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(n)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(t)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置82的氨基酸取代是色氨酸(w)取代异亮氨酸(i)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代精氨酸(r)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置177的氨基酸取代是组氨酸(h)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(g)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置200的氨基酸取代是色氨酸(w)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置235的氨基酸取代是精氨酸(r)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:12的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代脯氨酸(p)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代天冬酰胺(n)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置296的氨基酸取代是色氨酸(w)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(y)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代脯氨酸(p)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(p)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代精氨酸(r)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(g)取代苏氨酸(t)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置327的氨基酸取代是精氨酸(r)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(g)取半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置421的氨基酸取代是组氨酸(h)取代天冬氨酸(d)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(y)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置470的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(t)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代谷氨酰胺(q)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置591的氨基酸取代是精氨酸(r)取代谷氨酰胺(q)。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™转座酶可包含或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置103、194、372、375、450、509和570的一个或多个位置的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™转座酶可包含或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个位置的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™转座酶可包含或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2序列的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2序列的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2序列的位置372的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代精氨酸(r)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2序列的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代赖氨酸(k)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2序列的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(n)取代天冬氨酸(d)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2序列的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(g)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代天冬酰胺(n)。在某些实施方案中，piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代的那些实施方案，piggybac™转座酶还可包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代，在seqidno:12的位置372的丙氨酸(a)对精氨酸(r)的取代，和在seqidno:12的位置375的丙氨酸(a)对赖氨酸(k)的取代。在某些实施方案中，piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代，在seqidno:12的位置372的丙氨酸(a)对精氨酸(r)的取代，在seqidno:12的位置375的丙氨酸(a)对赖氨酸(k)的取代和在seqidno:12的位置450的天冬酰胺(n)对天冬氨酸(d)的取代。

本公开内容提供包含本公开内容的car的载体。在某些实施方案中，载体是病毒性载体。载体可以是重组载体。

本公开内容的病毒性载体可包含从逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒或其任何组合分离或衍生的序列。病毒性载体可包含从腺病毒相关病毒分离或衍生的序列(aav)。病毒性载体可包含重组aav(raav)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包含两个或更多个反向末端重复(itr)序列，其位于编码本公开内容的蛋白支架、centyrin或cartyrin的序列的顺式(cis)紧邻处。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包括，但不限于所有血清型(如aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8，和aav9)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包括，但不限于自补aav(scaav)和含有一个血清型的基因组和另一个血清型的衣壳的aav杂种(如aav2/5、aav-dj和aav-dj8)。本公开内容的示例性腺病毒相关病毒和重组腺病毒相关病毒包括，但不限于raav-lk03。

本公开内容的病毒性载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时，选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞存活或生存有害的化合物，且其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本公开内容的示例性选择基因可包括，但不限于neo(赋予对新霉素的抗药性)、dhfr(编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、tyms(编码胸苷酸合成酶)、mgmt(编码o(6)-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶)、多药耐药基因(mdr1)、aldh1(编码醛脱氢酶1家族，成员a1)、francf、rad51c(编码rad51paralogc)、gcs(编码葡糖基神经酰胺合酶)、nkx2.2(编码nk2同源异型框2)或其任何组合。

本公开内容的病毒性载体可包含诱导型前凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“ic9安全开关”。在某些实施方案中，本公开内容的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的病毒性载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)截短的半胱天冬酶9多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽，配体结合区可包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽。在某些实施方案中，包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v)。在某些实施方案中，fkbp12多肽由包含gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle(seqidno:23)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，fkbp12多肽由包含ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggag(seqidno:24)的核酸序列编码。在某些实施方案中，对配体结合区特异性的诱导剂可包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽，其具有位置36的苯丙氨酸(f)被缬氨酸(v)取代(f36v)，包含ap20187和/或ap1903两种合成药物。

在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含ggggs(seqidno:25)的氨基酸或包含ggaggaggaggatcc(seqidno:26)的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限切酶位点。

在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(r)的氨基酸序列编码。可供选择地，或者另外，在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列位置282的丙氨酸(a)的氨基酸序列编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由包含gfgdvgaleslrgnadlayislmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcnflrkklffkts(seqidno:27)的氨基酸或包含tttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc(seqidno:28)的核酸序列编码。

在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽，诱导型前凋亡多肽由包含gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklegggggsgfgdvgaleslrgnadlayislmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcnflrkklffkts(seqidno:29)的氨基酸序列或包含ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccgaatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc(seqidno:30)的核酸序列编码。

本公开内容的病毒性载体可包含至少一个自切肽。在一些实施方案中，载体可包含至少一个自切肽，其中自切肽位于car和选择基因之间。在一些实施方案中，载体可包含至少一个自切肽，其中第一个自切肽位于car的上游和第二个自切肽位于car的下游。本公开内容的病毒性载体可包含至少一个自切肽，其位于例如本公开内容的蛋白支架、centyrin或cartyrin的一个或多个和本公开内容的诱导型前凋亡多肽之间。本公开内容的病毒性载体可包含至少两个自切肽，第一个自切肽位于，例如本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上游，而第二个自切肽位于，例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。自切肽可包含，例如，t2a肽、gsg-t2a肽、e2a肽、gsg-e2a肽、f2a肽、gsg-f2a肽、p2a肽，或gsg-p2a肽。t2a肽可包含含有egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列或与包含egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(seqidno:33)的核酸序列。e2a肽可包含含有qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列或与包含qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-e2a肽可包含含有gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列或与包含gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。f2a肽可包含含有vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列或与包含vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-f2a肽可包含含有gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列或与包含gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。p2a肽可包含含有atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列或与包含atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-p2a肽可包含含有gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸序列或与包含gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。

本公开内容提供包含本公开内容的car的载体。在某些实施方案中，载体是纳米粒子。本公开内容的示例性纳米粒子载体包括，但不限于核酸(如rna、dna、合成核苷酸、修饰合成核苷酸或其任何组合)、氨基酸(l-氨基酸、d-氨基酸、合成氨基酸、修饰氨基酸，或其任何组合)、聚合物(如多聚体)、胶束、脂质(如脂质体)、有机分子(如碳原子、片材、纤维、管)、无机分子(如磷酸钙或金)或其任何组合。纳米粒子载体可以被动地或主动地穿过细胞膜。

本公开内容的纳米粒子载体可包含选择基因。选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时，选择基因可编码为细胞生存和存活所必需的基因产物。选择性细胞培养条件可包含对细胞存活或生存有害的化合物和其中基因产物赋予对所述化合物的抗性。本公开内容的示例性选择基因可包括，但不限于neo(赋予对新霉素的抗药性)、dhfr(编码二氢叶酸还原酶并赋予对甲氨蝶呤的抗药性)、tyms(编码胸苷酸合成酶)、mgmt(编码o(6)-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶)、多药耐药基因(mdr1)、aldh1(编码醛脱氢酶1家族，成员a1)、francf、rad51c(编码rad51paralogc)、gcs(编码葡糖基神经酰胺合酶)、nkx2.2(编码nk2同源异型框2)或其任何组合。

本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型前凋亡多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，配体结合区可以是多聚体配体结合区。本公开内容的诱导型前凋亡多肽也可被称为“ic9安全开关”。在某些实施方案中，本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，本公开内容的纳米粒子载体可包含诱导型半胱天冬酶多肽，其包含(a)配体结合区，(b)接头，和(c)截短的半胱天冬酶9多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽，配体结合区可包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽。在某些实施方案中，包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可包含在序列的位置36的修饰。修饰可以是缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v)。在某些实施方案中，fkbp12多肽由包含gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle(seqidno:23)的氨基酸序列编码。在某些实施方案中，fkbp12多肽由包含ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggag(seqidno:24)的核酸序列编码。在某些实施方案中，对可包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽(具有取代位置36的苯丙氨酸(f)的缬氨酸(v)(f36v))的配体结合区有特异性的诱导剂包含ap20187和/或ap1903两种合成药物。

在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，接头区由包含ggggs(seqidno:25)的氨基酸或包含ggaggaggaggatcc(seqidno:26)的核酸序列编码。在某些实施方案中，编码接头的核酸序列不包含限切酶位点。

在本公开内容的截短半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置87的精氨酸(r)的氨基酸序列编码。可供选择地，或者另外，在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由不包含该序列的位置282的丙氨酸(a)的氨基酸序列编码。在本公开内容的诱导型前凋亡多肽、诱导型半胱天冬酶多肽或截短的半胱天冬酶9多肽的某些实施方案中，截短的半胱天冬酶9多肽由包含gfgdvgaleslrgnadlayislmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcnflrkklffkts(seqidno:27)的氨基酸或包含tttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc(seqidno:28)的核酸序列编码。

在诱导型前凋亡多肽的某些实施方案中，其中多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽，诱导型前凋亡多肽由包含gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellklegggggsgfgdvgaleslrgnadlayislmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcnflrkklffkts(seqidno:29)的氨基酸序列或包含ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccgaatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc(seqidno:30)的核酸序列编码。

本公开内容的纳米粒子载体可包含至少一个自切肽。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中自切肽位于car和纳米粒子之间。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中第一个自切肽位于car的上游和第二个自切肽位于car的下游。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中第一个自切肽位于car和纳米粒子之间，而第二个自切肽位于car的下游。在一些实施方案中，纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其中第一个自切肽位于car和纳米粒子之间和第二个自切肽位于car的下游，例如，car和选择基因之间。本公开内容的纳米粒子载体可包含至少一个自切肽，其位于，例如，本公开内容的蛋白支架、centyrin或cartyrin的一个或多个和本公开内容的诱导型前凋亡多肽之间。本公开内容的纳米粒子载体可包含至少两个自切肽，第一个自切肽位于例如本公开内容的诱导型前凋亡多肽的上游或紧邻接的上游，而第二个自切肽位于，例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽的下游或紧邻接的上游。自切肽可包含，例如，t2a肽、gsg-t2a肽、e2a肽、gsg-e2a肽、f2a肽、gsg-f2a肽、p2a肽，或gsg-p2a肽。t2a肽可包含含有egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列或与包含egrgslltcgdveenpgp(seqidno:31)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列或与包含gsgegrgslltcgdveenpgp(seqidno:32)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-t2a肽可包含含有ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(seqidno:33)的核酸序列。e2a肽可包含含有qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列或与包含qctnyallklagdvesnpgp(seqidno:34)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-e2a肽可包含含有gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列或与包含gsgqctnyallklagdvesnpgp(seqidno:35)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。f2a肽可包含含有vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列或与包含vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:36)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-f2a肽可包含含有gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列或与包含gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno:37)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。p2a肽可包含含有atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列或与包含atnfsllkqagdveenpgp(seqidno:38)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。gsg-p2a肽可包含含有gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸序列或与包含gsgatnfsllkqagdveenpgp(seqidno:39)的氨基酸序列具有至少70%、80%、90%、95%，或99%同一性的序列。

本公开内容提供一种包含本公开内容的载体的组合物。

本公开内容提供包含本公开内容的car的细胞。本公开内容提供包含本公开内容的转座子的细胞。在某些实施方案中，包含本公开内容的car、转座子，或载体的细胞可在细胞表面上表达car。细胞可以是任何类型的细胞。优选地，细胞是免疫细胞。免疫细胞可以是t-细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤(nk)-样细胞(如细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞)、造血祖细胞、外周血(pb)衍生的t细胞或脐带血(ucb)衍生的t细胞。优选地，免疫细胞是t-细胞。细胞可以是人工抗原呈递细胞，其可以任选地用来刺激和扩增本公开内容的修饰免疫细胞或t细胞。细胞可以是肿瘤细胞，其可以任选地用作人工或修饰的抗原呈递细胞。

可用于过继治疗的本公开内容的修饰细胞可以是自体的或同种异体的。

本公开内容提供一种在细胞表面上表达嵌合抗原受体(car)的方法，其包括：(a)获得细胞群，(b)使细胞群与包含本公开内容的car或编码car的序列的组合物，在足以使car转移穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件下接触，从而产生修饰的细胞群；(c)在适合转座子的整合条件下培养修饰的细胞群；和(d)从修饰的细胞群扩增和/或选择至少一个在细胞表面上表达car的细胞。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，细胞群可包含白细胞和/或cd4+和cd8+白细胞。细胞群可包含优化比例的cd4+和cd8+白细胞。优化比例的cd4+与cd8+白细胞并不在体内自然发生。细胞群可包含肿瘤细胞。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，转座子或载体包含car或编码car的序列。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，足以转移编码car的序列穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件包括核转染。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，其中足以转移编码car的序列穿过细胞群中至少一个细胞的细胞膜的条件包括以下至少一种：在指定电压下一个或多个电流脉冲的施加、缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中，缓冲剂可包含pbs、hbss、optimem、btxpress、amaxanucleofector、人t细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实施方案中，一种或多种补充因子可包含(a)重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合；(b)盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c)细胞培养基；(d)细胞dna感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂；和(e)修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合可包含il2、il7、il12、il15、il21、il1、il3、il4、il5、il6、il8、cxcl8、il9、il10、il11、il13、il14、il16、il17、il18、il19、il20、il22、il23、il25、il26、il27、il28、il29、il30、il31、il32、il33、il35、il36、gm-csf、ifn-γ、il-1α/il-1f1、il-1β/il-1f2、il-12p70、il-12/il-35p35、il-13、il-17/il-17a、il-17a/f异二聚体、il-17f、il-18/il-1f4、il-23、il-24、il-32、il-32β、il-32γ、il-33、lap(tgf-β1)、淋巴毒素-α/tnf-β、tgf-β、tnf-α、trance/tnfsf11/rankl或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含hepes、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、mem非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、fbs/fcs、人血清、血清替代品、抗生素、ph调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、nucleofectorplus补充剂、kcl、mgcl2、na2hpo4、nah2po4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、cina、葡萄糖、ca(no3)2、tris/hcl、k2hpo4、kh2po4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、pop313、crown-5，或其任何组合。细胞培养基可包含pbs、hbss、optimem、dmem、rpmi1640、aim-v、x-vivo15、cellgrodc培养基、ctsoptimizert细胞扩增sfm、texmacs培养基、prime-xvt细胞扩增培养基、immunocult-xft细胞扩增培养基或其任何组合。细胞dna感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包含tlr9、myd88、irak、traf6、traf3、irf-7、nf-kb、1型干扰素、促炎细胞因子、cgas、sting、sec5、tbk1、irf-3、rnapoliii、rig-1、ips-1、fadd、rip1、traf3、aim2、asc、半胱天冬酶1、pro-il1b、pi3k、akt、wnt3a的抑制剂，糖原合酶激酶-3β(gsk-3β)的抑制剂(如tws119)、bafilomycin、氯喹、奎纳克林、ac-yvad-cmk、z-vad-fmk、z-ietd-fmk或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包含ph调节剂、dna-结合蛋白、脂质、磷脂、capo4、有或没有nls序列的净中性电荷dna结合肽、trex1酶或其任何组合。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，适合于整合本公开内容的car或编码car的序列的条件包括以下至少一种：缓冲剂和一种或多种补充因子。在某些实施方案中，本公开内容的转座子或载体包含本公开内容的car或编码car的序列。在某些实施方案中，缓冲剂可包含pbs、hbss、optimem、btxpress、amaxanucleofector、人t细胞核转染缓冲剂或其任何组合。在某些实施方案中，一种或多种补充因子可包含(a)重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合；(b)盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c)细胞培养基；(d)细胞dna感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂；和(e)修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素或其任何组合可包含il2、il7、il12、il15、il21、il1、il3、il4、il5、il6、il8、cxcl8、il9、il10、il11、il13、il14、il16、il17、il18、il19、il20、il22、il23、il25、il26、il27、il28、il29、il30、il31、il32、il33、il35、il36、gm-csf、ifn-γ、il-1α/il-1f1、il-1β/il-1f2、il-12p70、il-12/il-35p35、il-13、il-17/il-17a、il-17a/f异二聚体、il-17f、il-18/il-1f4、il-23、il-24、il-32、il-32β、il-32γ、il-33、lap(tgf-β1)、淋巴毒素-α/tnf-β、tgf-β、tnf-α、trance/tnfsf11/rankl或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可包含hepes、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、mem非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、fbs/fcs、人血清、血清替代品、抗生素、ph调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、nucleofectorplus补充剂、kcl、mgcl2、na2hpo4、nah2po4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、cina、葡萄糖、ca(no3)2、tris/hcl、k2hpo4、kh2po4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、pop313、crown-5，或其任何组合。细胞培养基可包含pbs、hbss、optimem、dmem、rpmi1640、aim-v、x-vivo15、cellgrodc培养基、ctsoptimizert细胞扩增sfm、texmacs培养基、prime-xvt细胞扩增培养基、immunocult-xft细胞扩增培养基或其任何组合。细胞dna感应、代谢、分化、信号转导、一个或多个凋亡途径或其组合的抑制剂包括tlr9、myd88、irak、traf6、traf3、irf-7、nf-kb、1型干扰素、促炎细胞因子、cgas、sting、sec5、tbk1、irf-3、rnapoliii、rig-1、ips-1、fadd、rip1、traf3、aim2、asc、半胱天冬酶1、pro-il1b、pi3k、akt、wnt3a的抑制剂、糖原合酶激酶-3β(gsk-3β)的抑制剂(如tws119)、bafilomycin、氯喹、奎纳克林、ac-yvad-cmk、z-vad-fmk、z-ietd-fmk或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包括ph调节剂、dna-结合蛋白、脂质、磷脂、capo4、有或没有nls序列的净中性电荷dna结合肽、trex1酶或其任何组合。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，扩增和选择步骤序贯发生。扩增可在选择之前发生。扩增可在选择之后发生，且任选地，进一步的(即第二)选择可在扩增之后发生。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，扩增和选择步骤可同时发生。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，扩增可包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与抗原接触，以通过car刺激至少一个细胞，从而产生扩增细胞群。抗原可在基质表面上呈递。基质可具有任何形式，包括，但不限于表面、孔、珠或其中的多个，和基质。基质可进一步包含顺磁性或磁性成分。在表达car的这种方法的某些实施方案中，抗原可在基质表面上呈递，其中基质是磁珠，和其中磁体可以用来从修饰和扩增的细胞群去除或分离磁珠。抗原可在细胞或人工抗原呈递细胞表面上呈递。本公开内容的人工抗原呈递细胞可包括，但不限于肿瘤细胞和干细胞。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，其中转座子或载体包含选择基因，且其中选择步骤包括使修饰的细胞群的至少一个细胞与选择基因赋予抗性的化合物接触，从而将表达选择基因的细胞识别为在选择中存活和将未能表达选择基因的细胞识别为未能在选择步骤中存活。

在表达car的这种方法的某些实施方案中，扩增和/或选择步骤可持续10-14天的时期，包括端点。

本公开内容提供一种包含用本公开内容的方法修饰、扩增和选择的细胞群的组合物。

本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物，其中car特异性地结合肿瘤细胞上的抗原。在某些实施方案中，肿瘤细胞可以是恶性肿瘤细胞。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是同种异体的。

本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法，其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物，其中car特异性地结合受试者的自身免疫细胞上的抗原。在某些实施方案中，自身免疫细胞可以是特异性地结合受试者的靶细胞上自体抗原的淋巴细胞。在某些实施方案中，自身免疫细胞可以是b淋巴细胞(即b细胞)。在某些实施方案中，自身免疫细胞可以是t淋巴细胞(即t细胞)。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是同种异体的。

本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗感染的方法，其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物，其中car特异性地结合在包含感染因子的细胞、与感染因子联系的细胞或暴露于感染因子的细胞上的抗原。在一些实施方案中，与感染因子联系的细胞可以与感染因子在空气中联通(如感染因子是空气传播或吸入的)或液体联通(如感染因子在水性液体或生物液体中携带)。引起宿主细胞感染的感染因子可以是细菌、病毒、酵母，或微生物。感染因子可诱导细胞或细胞的宿主生物体(受试者)，示例性条件包括，但不限于病毒性感染、免疫缺陷疾病、炎性疾病和增殖性疾病。在某些实施方案中，感染导致结核、脑小畸形、神经变性或疟疾。在某些实施方案中，感染导致受试者胎儿的脑小畸形。在某些实施方案中，包括其中感染导致受试者胎儿的脑小畸形的那些，感染因子是病毒和其中病毒是寨卡病毒。在某些实施方案中，免疫缺陷疾病是获得性免疫缺陷综合征(aids)。在某些实施方案中，增殖性疾病是癌症。在某些实施方案中，癌症是宫颈癌和其中感染因子是人乳头状瘤病毒(hpv)。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是同种异体的。

本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗肥大细胞疾病的方法，其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物，其中car特异性地结合于肥大细胞上的抗原。在某些实施方案中，car特异性地结合受试者的肥大细胞上的抗原。在某些实施方案中，肥大细胞疾病可包括，但不限于，与肥大细胞过度增殖有关的疾病、与具有异常活性的肥大细胞有关的疾病，和与异常的肥大细胞数量和异常的肥大细胞活性有关的疾病。示例性与肥大细胞过度增殖有关的疾病包括，但不限于肥大细胞增多症、皮肤肥大细胞增多症(如，色样性荨麻疹或斑丘疹皮肤肥大细胞增多症)、系统性肥大细胞增多症(包括肥大细胞白血病)，和局部化肥大细胞增殖。示例性与具有异常活性的肥大细胞有关的疾病，包括，但不限于肥大细胞激活综合征(mcas)或肥大细胞激活病症(mcad)、过敏性疾病(包括过敏反应)、哮喘、炎性疾病(包括例如，关节组织的自身免疫相关炎症、关节炎等)，或其任何组合。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是同种异体的。

本公开内容提供一种在有需要的受试者中治疗变性疾病的方法，其包括给予所述受试者一种本公开内容的组合物，其中car特异性地结合于有害细胞或衰老细胞上的抗原。在某些实施方案中，car特异性地结合受试者的有害细胞或衰老细胞上的抗原。在某些实施方案中，变性疾病可包括，但不限于，神经变性病症、代谢病症、血管病症和衰老。示例性神经变性病症包括，但不限于与一个或多个神经元、胶质细胞或小胶质细胞的功能或功效丧失有关的失调。示例性神经变性病症包括，但不限于与一个或多个信号传导分子、蛋白质或朊蛋白的积聚(其干扰一个或多个神经元、胶质细胞或小胶质细胞的功能或降低其功效)有关的失调。示例性代谢病症包括，但不限于与线粒体紊乱有关的障碍、电子传送链的中断、细胞atp生产的中断、一个或多个神经元、胶质细胞或小胶质细胞的一个或多个线粒体功能的丧失或效能的降低。示例性代谢病症包括，但不限于与流向神经元、胶质细胞或小胶质细胞的循环血流损失或血流减少有关的障碍(如中风)；神经元、胶质细胞或小胶质细胞中短暂或永久的缺氧状态(例如，足以释放细胞中的自由基)；在受试者的睡眠状态下，流向神经元、胶质细胞或小胶质细胞的循环cns损失或cns血流减少足以降低在睡眠状态下除去神经元、胶质细胞或小胶质细胞的废物的功效。示例性衰老障碍包括，但不限于与神经元、胶质细胞或小胶质细胞的一个或多个染色体上端粒的增加或缩短；神经元中端粒酶的功能的丧失或效能的降低、胶质细胞或小胶质细胞；或神经元、胶质细胞或小胶质细胞中dna修复机制的功能的丧失或效能的降低有关的障碍。在某些实施方案中，有害细胞或衰老细胞在包含有害细胞或衰老细胞的网络中干扰一种功能或降低另一种细胞的效能，而有针对性地移除有害细胞或老化细胞可以改善或恢复功能或增加网络的功效。在某些实施方案中，有害细胞或衰老细胞可能改变第二个细胞的功能或功效，而有针对性地移除有害细胞或衰老细胞防止第二个细胞的转化。在某些实施方案中，变性疾病是神经变性病症和有害细胞或衰老细胞是干细胞、免疫细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在某些实施方案中，变性疾病是代谢病症和有害细胞或衰老细胞是干细胞、体细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在某些实施方案中，变性疾病是血管病症和有害细胞或衰老细胞是干细胞、体细胞、免疫细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在某些实施方案中，变性疾病是衰老和有害细胞或衰老细胞是卵母细胞、精子、干细胞、体细胞、免疫细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞或小胶质细胞。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是自体的。在某些实施方案中，其包括给予所述受试者包含本公开内容的修饰细胞或细胞群的组合物，细胞或细胞群可以是同种异体的。

本公开内容提供一种在有需要的受试者中改变细胞疗法的方法，其包括给予所述受试者一种包含含有转座子或载体的细胞的组合物，所述组合物包含诱导型前凋亡多肽，其中可通过使细胞接触诱导剂在细胞中选择性地诱导凋亡。在某些实施方案中，细胞是自体的。在某些实施方案中，细胞是同种异体的。在这种方法的某些实施方案中，细胞疗法是过继性细胞疗法。在这种方法的某些实施方案中，改变细胞疗法包括终止细胞疗法。在这种方法的某些实施方案中，改变细胞疗法包括细胞疗法中提供的一部分细胞的损耗。在某些实施方案中，该方法进一步包括给予诱导剂的抑制剂的步骤，以抑制细胞疗法的改变，从而恢复细胞疗法的功能和/或疗效。

本公开内容的改变细胞疗法的方法可被用来终止或抑制对例如，康复迹象或减轻疾病严重程度/进展的迹象、疾病缓解/停止的迹象，和/或不利事件的发生有反应的疗法。如果病情的体征或症状应再次出现或加重和/或不利事件得到解决，本公开内容的细胞疗法可通过抑制诱导剂恢复。

附图简述

图1是描述本公开内容的7676个碱基对的piggybaccartyrin构建体的示意图，其包括包含cartyrin的转座子(包含cd8a信号肽、centyrin、cd8a铰链序列，和跨膜序列，和cd3z共刺激结构域)。

图2是本公开内容的p-bcma-101构建体的氨基酸序列的示意图。

图3a-b是本公开内容的p-bcma-101构建体的核酸序列的示意图。

图4是描述本公开内容的cartyrin的构建的示意图和对比centyrin和抗体的特征的表。

图5a是描述用5μg的cartyrinmrna电穿孔后，cartyrin表达的一系列的细胞分选图。

图5b，左小图，是描述用对照k562细胞系和表达bcma的h929细胞系挑战后，cartyrin功能的一系列的细胞分选图，以及右小图，显示左小图的曲线的量化的图(添加了来自用表达bcma的细胞系u266挑战的数据)。

图5c是描述cartyrin活性作为在t-细胞电穿孔期间所用的mrna的量的函数的曲线图。

图6是描述在小鼠中使用a08cartyrin的体内肿瘤挑战研究时间线的示意图。

图7是显示a08cartyrin-处理的小鼠的完整(100%)生存的一对图。肿瘤负荷以m-蛋白的存在来评估。在保护的动物中没有可检测的m-蛋白。

图8是描述本公开内容的示例性诱导型截短的半胱天冬酶9多肽的示意图。

图9是一系列流式细胞术绘图，描绘了从活细胞区域(门控右下象限)移动到填充凋亡细胞的区域(左上象限)的细胞的丰度，其作为在细胞中诱导剂(ap1903)的递增剂量的函数，所述细胞经修饰以在核转染后第12天单独或与本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽(由通过piggybac(pb)转座酶引入到细胞中的ic9构建体(也称为“安全开关”)编码)组合表达治疗剂(cartyrin)。

图10是一系列流式细胞术绘图，其描绘了从活细胞区域(门控右下象限)移动到填充凋亡细胞的区域(左上象限)的细胞丰度，其作为在细胞中诱导剂(ap1903)的递增剂量的函数，所述细胞经修饰以在核转染后第19天单独或与本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽(由通过piggybac(pb)转座酶引入到细胞中的ic9构建体(也称为“安全开关”)编码)组合表达治疗剂(cartyrin)。

图11是描述图9(左图)或图10(右图)所示的聚集结果的量化的一对图。特别地，这些图显示对于每个修饰的细胞类型在第12天(图9和左图)或第19天(图10和右图)，ic9安全开关对作为ic9开关的诱导剂(ap1903)的浓度的函数的细胞生存百分率的影响。

详细描述

本公开内容提供包含至少一个centyrin的嵌合抗原受体。本公开内容的嵌合抗原受体可包含一个以上的centyrin。例如，双特异性car可包含特异性地结合两个不同的抗原的两个centyrin。

本公开内容的centyrin特异性地结合于抗原。本公开内容的包含一个或多个特异性地结合抗原的centyrin的嵌合抗原受体可被用来引导细胞(如细胞毒性免疫细胞)的特异性以趋向特定抗原。

本公开内容的centyrin可包含含有lpapknlvvsevtedslrlswtapdaafdsfliqyqesekvgeainltvpgsersydltglkpgteytvsiygvkgghrsnplsaeftt(seqidno:1)的共有序列。

本公开内容的嵌合抗原受体可包含人cd2、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd8α、cd19、cd28、4-1bb或gm-csfr的信号肽。本公开内容的铰链/间隔域可包含人cd8α、igg4和/或cd4的铰链/间隔物/茎。本公开内容的细胞内结构域或胞内域可包含人cd3ζ的细胞内信号域并可进一步包含人4-1bb、cd28、cd40、icos、myd88、ox-40胞内段，或其任何组合。示例性跨膜结构域包括，但不限于人cd2、cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd8α、cd19、cd28、4-1bb或gm-csfr跨膜结构域。

本公开内容通过将本公开内容的car和/或cartyrin引入这些细胞，提供赋予对一个或多个抗原的特异性的基因修饰细胞，如t细胞、nk细胞、造血祖细胞、外周血(pb)衍生的t细胞(包括来自g-csf-动员的外周血的t细胞)、脐带血(ucb)衍生的t细胞。本公开内容的细胞可通过编码本公开内容的car或cartyrin的转座子和包含本公开内容的编码转座酶的序列(优选地，本公开内容的编码转座酶的序列是mrna序列)的质粒的电转移进行修饰。

本公开内容的转座子以游离基因形式(episomally)维持或整合进重组体/修饰细胞的基因组中。转座子可以是利用转座子和转座酶以推动非-病毒性基因转移的两个组分piggybac系统的部分。在这种方法的某些实施方案中，转座子是具有编码嵌合抗原受体的序列的质粒dna转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggybac转座子。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggybac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggybac™或超级piggybac™(spb)转座酶。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座子是具有编码抗原受体的序列的质粒dna转座子，所述受体侧面连接两个顺式调节绝缘子元件。在某些实施方案中，转座子是piggybac转座子。在某些实施方案中，且特别是在其中转座子是piggybac转座子的那些实施方案中，转座酶是piggybac™或超级piggybac™(spb)转座酶。在某些实施方案中，且特别是在其中转座酶是超级piggybac™(spb)转座酶的那些实施方案中，编码转座酶的序列是mrna序列。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggybac™(pb)转座酶。piggybac(pb)转座酶可包含与以下氨基酸序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成：

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541pgtsddsteepvmkkrtyctycpskirrkanasckkckkvicrehnidmcqscf(seqidno:12)。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是piggybac™(pb)转座酶，其包含具有在以下序列的位置30、165、282或538的一个或多个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成：

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541pgtsddsteepvmkkrtyctycpskirrkanasckkckkvicrehnidmcqscf(seqidno:12)。

在某些实施方案中，转座酶是piggybac™(pb)转座酶，其包含具有在seqidno:12序列的位置30、165、282或538的两个或更多个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成。在某些实施方案中，转座酶是piggybac™(pb)转座酶，其包含具有在seqidno:12序列的位置30、165、282或538的3个或多于3个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成。在某些实施方案中，转座酶是piggybac™(pb)转座酶，其包含具有在以下seqidno:12序列的位置30、165、282和538的每一个的氨基酸取代的氨基酸序列或由它们组成。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置30的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代异亮氨酸(i)。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置165的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代甘氨酸(g)。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置282的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12序列的位置538的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代天冬酰胺(n)。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，转座酶是超级piggybac™(spbo)转座酶。在某些实施方案中，本公开内容的超级piggybac™(spbo)转座酶可包含seqidno:12序列的氨基酸序列或由其组成，其中位置30的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代异亮氨酸(i)，位置165的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代甘氨酸(g)，位置282的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)，和位置538的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代天冬酰胺(n)。在某些实施方案中，超级piggybac™(spbo)转座酶可包含与以下序列之间具有至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或任何百分比的同一性的氨基酸序列或由它们组成：

1mgsslddehilsallqsddelvgedsdsevsdhvseddvqsdteeafidevhevqptssg

61seildeqnvieqpgsslasnriltlpqrtirgknkhcwstskstrrsrvsalnivrsqrg

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301sgtkymingmpylgrgtqtngvplgeyyvkelskpvhgscrnitcdnwftsiplaknllq

361epykltivgtvrsnkreipevlknsrsrpvgtsmfcfdgpltlvsykpkpakmvyllssc

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541pgtsddsteepvmkkrtyctycpskirrkanasckkckkvicrehnidmcqscf(seqidno:2)。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的一个或多个以下位置的氨基酸取代：3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™或超级piggybac™转座酶可进一步包含一个或多个以下位置的氨基酸取代：46、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、485、503、552和570。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置3的氨基酸取代是天冬酰胺(n)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置46的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置46的氨基酸取代是苏氨酸(t)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置82的氨基酸取代是色氨酸(w)取代异亮氨酸(i)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置119的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代精氨酸(r)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置125的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置125的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置177的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置177的氨基酸取代是组氨酸(h)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置180的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置180的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置180的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置185的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置187的氨基酸取代是甘氨酸(g)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置200的氨基酸取代是色氨酸(w)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置207的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置209的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置226的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置235的氨基酸取代是精氨酸(r)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:12的位置240的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置241的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代苯丙氨酸(f)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置243的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代脯氨酸(p)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置258的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代天冬酰胺(n)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置296的氨基酸取代是色氨酸(w)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置296的氨基酸取代是酪氨酸(y)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置296的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置298的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置298的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置298的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置311的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代脯氨酸(p)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置311的氨基酸取代是缬氨酸取代脯氨酸(p)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置315的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代精氨酸(r)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置319的氨基酸取代是甘氨酸(g)取代苏氨酸(t)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置327的氨基酸取代是精氨酸(r)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置328的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代酪氨酸(y)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置340的氨基酸取代是甘氨酸(g)取代半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置340的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代半胱氨酸(c)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置421的氨基酸取代是组氨酸(h)取代天冬氨酸(d)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置436的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置456的氨基酸取代是酪氨酸(y)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置706的氨基酸取代是苯丙氨酸(f)取代亮氨酸(l)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置485的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置503的氨基酸取代是亮氨酸(l)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置503的氨基酸取代是异亮氨酸(i)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置552的氨基酸取代是赖氨酸(k)取代缬氨酸(v)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置570的氨基酸取代是苏氨酸(t)取代丙氨酸(a)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置591的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代谷氨酰胺(q)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置591的氨基酸取代是精氨酸(r)取代谷氨酰胺(q)。

在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™转座酶可包含或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置103、194、372、375、450、509和570的一个或多个的氨基酸取代。在本公开内容的方法的某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™转座酶可包含或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置103、194、372、375、450、509和570的2、3、4、5、6或更多个的氨基酸取代。在某些实施方案中，包括其中转座酶包含在位置30、165、282和/或538的上述突变的那些实施方案，piggybac™转座酶可包含或超级piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置103、194、372、375、450、509和570的氨基酸取代。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置103的氨基酸取代是脯氨酸(p)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2序列的位置194的氨基酸取代是缬氨酸(v)取代甲硫氨酸(m)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置372的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代精氨酸(r)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置375的氨基酸取代是丙氨酸(a)取代赖氨酸(k)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置450的氨基酸取代是天冬酰胺(n)取代天冬氨酸(d)。在某些实施方案中，在seqidno:12或seqidno:2的位置509的氨基酸取代是甘氨酸(g)取代丝氨酸(s)。在某些实施方案中，seqidno:12或seqidno:2的位置570的氨基酸取代是丝氨酸(s)取代天冬酰胺(n)。在某些实施方案中，piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代。在某些实施方案中，包括其中piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代的那些实施方案，piggybac™转座酶可进一步包含在seqidno:12或seqidno:2序列的位置372、375和450的氨基酸取代。在某些实施方案中，piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代、在seqidno:12的位置372的丙氨酸(a)对精氨酸(r)的取代，和在seqidno:12的位置375的丙氨酸(a)对赖氨酸(k)的取代。在某些实施方案中，piggybac™转座酶可包含在seqidno:12的位置194的缬氨酸(v)对甲硫氨酸(m)的取代、在seqidno:12的位置372的丙氨酸(a)对精氨酸(r)的取代、在seqidno:12的位置375的丙氨酸(a)对赖氨酸(k)的取代和在seqidno:12的位置450的天冬酰胺(n)对天冬氨酸(d)的取代。

支架蛋白

本公开内容的蛋白支架可源自纤连蛋白iii型(fn3)重复蛋白、编码或互补核酸、载体、宿主细胞、构成、组合、制剂、装置，以及制备和使用它们的方法。在一个优选的实施方案中，蛋白支架包含来自人生腱蛋白-c的多个fn3结构域的共有序列(此后为“生腱蛋白”)。在一个更优选的实施方案中，本发明的蛋白支架是15fn3结构域的共有序列。本公开内容的蛋白支架可以被设计以结合各种分子，例如，细胞靶蛋白。在一个优选的实施方案中，本公开内容的蛋白支架可以被设计以结合野生型和/或变异形式的抗原的表位。

本公开内容的蛋白支架可包括另外的分子或部分，例如，抗体的fc区，白蛋白结合结构域，或其它影响半衰期的部分。在进一步的实施方案中，本公开内容的蛋白支架可结合于可编码蛋白支架的核酸分子。

本公开内容提供至少一种在宿主细胞中表达基于多个fn3结构域的共有序列的至少一个蛋白支架的方法，该方法包括在其中至少一个蛋白支架以可检测和/或可回收的量表达的条件下，如在此所述的培养宿主细胞。

本公开内容提供至少一个组合物，其包含(a)基于多个fn3结构域的共有序列和/或如在此描述的编码核酸的蛋白支架；和(b)合适的和/或药学上可接受的载体或稀释剂。

本公开内容提供生成基于纤连蛋白iii型(fn3)重复蛋白，优选地，多个fn3结构域的共有序列，且更优选地，来自人生腱蛋白的多个fn3结构域的共有序列的蛋白支架文库的方法。通过在支架的部分，如环区中改变(通过突变)分子中特定位置的氨基酸或氨基酸的数量，制备连续几代的支架来形成支架文库。通过改变单环或同时改变多个环或支架分子的另外位置的氨基酸组成可生成支架文库。改变后的环可以相应地加长或缩短。这样的库可以生成以在每个位置包含所有可能的氨基酸，或设计出的氨基酸的子集。库成员可被用来通过展示进行筛选，如体外或cis展示(dna、rna、核糖体展示等)、酵母、细菌和噬菌体展示。

本公开内容的蛋白支架提供增强的生物物理特性，如还原条件下的稳定性和高浓度时的溶解性；它们可以在原核系统中表达和折叠，如大肠杆菌，在真核系统中，如酵母，和在体外转录/翻译系统中，如兔网织红细胞溶解系统。

本公开内容提供通过用靶标淘选本发明的支架文库并检测粘合剂，生成结合特定靶标的支架分子的方法。在其他相关方面，本公开内容包括可被用来生成或结合成熟的具有所需活性的蛋白支架的筛选方法，如，能够与具有某种亲和力的靶蛋白结合。亲和性成熟可以通过迭代诱变和选择使用系统完成，如噬菌体展示或体外展示。在此过程中的诱变可能是对特定支架残基的位点定向诱变，由于容易出错的pcr导致随机突变，dna改组(shuffling)，和/或这些技术的组合的结果。

本公开内容提供基于纤连蛋白iii型(fn3)重复蛋白的共有序列的分离、重组和/或合成的蛋白支架，包括但不限于，源自哺乳动物的支架，以及组成和编码包含至少一个基于共有fn3序列的多核苷酸编码蛋白支架的核酸分子。本公开内容还包括，但不限于制备和使用这样的核酸和蛋白支架的方法，包括诊断和治疗组合物、方法和装置。

本公开内容的蛋白支架提供优于传统疗法的优势，如局部给予、口服，或越过血脑屏障的能力，在大肠杆菌中表达，使得蛋白的表达作为对比哺乳动物细胞表达能力(会被基因改造成结合多个目标或相同目标的多个表位的双特异性或串联分子)的函数的资源增加的能力，与药物、聚合物和探针结合的能力，可配制成高浓度的能力，和这样的分子有效穿透病变组织和肿瘤的能力。

而且，蛋白支架具有的许多抗体特性与它们模拟抗体的可变区的折叠有关。这种取向使fn3环能够与抗体相似地暴露于抗体互补决定区(cdr)。它们应该能够与细胞目标结合，且环可以改变，例如，亲和性成熟，以改善某些结合或相关的特性。

本公开内容的蛋白支架的6个环中的3个在拓扑上与抗体的互补决定区(cdr1-3)，即抗原-结合区相对应，而其余的三个环以类似于抗体cdr的方式暴露在表面。这些环跨越seqidno:13的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81或在这些残基附近。优选地，为了结合特异性和亲和力而改变在残基22-28、51-54和75-81或它们附近的环区。这些环区的一个或多个与其它环区和/或其它保持其作为主干部分的顺序的链任意排列以填充库，而强效粘合剂可从对特定蛋白目标具有高度亲和力的库中选择。一个或多个环区可与目标蛋白相互作用，类似于抗体cdr与蛋白质的相互作用。

本公开内容的支架可包含抗体模拟物。

术语“抗体模拟物”旨在描述一种特异性地结合目标序列并具有与天然存在的抗体不同结构的有机化合物。抗体模拟物可包含蛋白、核酸，或小分子。本公开内容的抗体模拟物特异性地结合的目标序列可以是抗原。抗体模拟物可提供超过抗体的优越的特性，包括但不限于优越的溶解性、组织渗透性、对热和酶的稳定性(如对酶降解的抗性)，和较低的生产成本。示例性抗体模拟物包括，但不限于，affibody、afflilin、affimer、affitin、alphabody、anticalin，和avimer(也称为亲合多聚物)、darpin(设计的锚定蛋白(ankyrin)重复蛋白)、fynomer、kunitz结构域肽，和单体。

本公开内容的affibody分子包含含有或由一个或多个无任何二硫键的α螺旋组成的蛋白支架。优选地，本公开内容的affibody分子包含或由3个α螺旋组成。例如，本公开内容的affibody分子可包含免疫球蛋白结合结构域。本公开内容的affibody分子可包含蛋白a的z结构域。

本公开内容的affilin分子包含通过修饰例如或者γ-b晶体蛋白或者泛素蛋白(ubiquitin)的暴露氨基酸产生的蛋白支架。affilin分子在功能上模拟抗体与抗原的亲和性，但不要在结构上模仿抗体。在用来制备affilin的任何蛋白支架中，在正确-折叠的蛋白分子中的易接近溶剂或可能的结合配体(bindingpartners)的那些氨基酸被认为是暴露的氨基酸。这些暴露的氨基酸的任何一个或多个可被修饰以特异性地结合目标序列或抗原。

本公开内容的affimer分子包含含有高度稳定的蛋白的蛋白支架，所述蛋白经改造以展示对特定目标序列提供高亲和力结合位点的肽环。本公开内容的示例性affimer分子包含基于胱抑素蛋白或其三级结构的蛋白支架。本公开内容的示例性affimer分子可能共享一个包含平放在一个反并行的β-片上面的α-螺旋的共有三级结构。

本公开内容的affitin分子包含人工蛋白支架，例如，其结构可源自dna结合蛋白(如dna结合蛋白sac7d)。本公开内容的affitins选择性地结合目标序列，其可能是抗原的全部或部分。本公开内容的示例性affitins通过使一个或多个氨基酸序列在dna结合蛋白的结合表面上任意排列并将生成的蛋白置于核糖体的展示和选择中来制备。本公开内容的affitins的目标序列可例如在基因组中或在肽、蛋白、病毒或细菌的表面上发现。在本公开内容的某些实施方案中，affitin分子可用作酶的特异性抑制剂。本公开内容的affitin分子可包括耐热蛋白或其衍生物。

本公开内容的alphabody分子也可被称为细胞穿透alphabody(cpab)。本公开内容的alphabody分子包含结合各种目标序列(包括抗原)的小蛋白(一般少于10kda)。alphabody分子能够到达和结合细胞内目标序列。在结构上，本公开内容的alphabody分子包含形成单链α螺旋的人工序列(类似于天然存在的盘绕的线圈结构(coiled-coilstructures))。本公开内容的alphabody分子可包含含有被修饰以特异性地结合目标蛋白的一个或多个氨基酸的蛋白支架。不管分子的结合特异性，本公开内容的alphabody分子保持正确的折叠和热稳定性。

本公开内容的anticalin分子包含在或者蛋白或者小分子中结合目标序列或位点的人工蛋白。本公开内容的anticalin分子可包含源自人脂钙蛋白(lipocalin)的人工蛋白。本公开内容的anticalin分子可用于代替，例如，单克隆抗体或其片段。anticalin分子可显示出优于单克隆抗体或其片段的组织穿透性和热稳定性。本公开内容的示例性anticalin分子可包含约180个氨基酸，具有大约20kda的质量。结构上，本公开内容的anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的反平行β-链的桶状结构。在优选的实施方案中，本公开内容的anticalin分子包含含有通过环和附接α螺旋成对地连接的8条反平行β-链的桶状结构。

本公开内容的avimer分子包含特异性地结合于目标序列(其也可以是抗原)的人工蛋白。本公开内容的avimer可识别相同目标内或不同目标内的多个结合位点。当本公开内容的avimer识别不止一个目标时，avimer模拟双特异性抗体的功能。人工蛋白avimer可包含两个或更多个各自大约30-35个氨基酸的肽序列。这些肽可经由一个或多个接头肽连接。avimer的一个或多个肽的氨基酸序列可源自膜受体的a结构域。avimer具有可任选地包含二硫键和/或钙的刚性结构。本公开内容的avimer可显示出与抗体比较的更大的热稳定性。

本公开内容的darpin(设计的锚定蛋白(ankyrin)重复蛋白)包含基因工程改造的重组体，或对目标序列具有高特异性和高亲和力的嵌合蛋白。在某些实施方案中，本公开内容的darpin源自锚定蛋白(ankyrin)，且任选地包含锚定蛋白(ankyrin)的至少3个重复基序(也称为重复结构单元)。锚定蛋白(ankyrin)介导高亲和力蛋白-蛋白相互作用。本公开内容的darpin包含一个大的目标相互作用面。

本公开内容的fynomer包含源自人fynsh3结构域，并经改造以结合具有同等亲和力和同等特异性的目标序列和分子作为抗体的小结合蛋白(约7kda)。

本公开内容的kunitz结构域肽包含含有kunitz结构域的蛋白支架。kunitz结构域包含抑制蛋白酶活性的活性位点。结构上，本公开内容的kunitz结构域包含一个富含二硫化物的α+β折叠。这种结构以牛胰腺胰蛋白酶抑制剂为例。kunitz结构域肽识别特定蛋白结构并用作竞争性蛋白酶抑制剂。本公开内容的kunitz结构域可包含艾卡拉肽(ecallantide)(源自人脂蛋白相关凝血抑制剂(laci))。

本公开内容的单体是大小与单链抗体相当的小蛋白(包含约94个氨基酸且具有约10kda的质量)。这些基因工程蛋白特别结合了包括抗原的目标序列。本公开内容的单体可特异性地靶向一个或多个不同的蛋白或目标序列。在优选的实施方案中，本公开内容的单体包含模拟人纤连蛋白的结构，和更优选地，模拟纤连蛋白的第十胞外iii型结构域的结构的蛋白支架。纤连蛋白的第十胞外iii型结构域，及其单体模拟物，含有7个形成桶的β片和3个对应于抗体3个互补决定区(cdr)每一侧上的暴露的环。与抗体可变结构域的结构形成对比，单体缺乏金属离子的结合位点以及中心的二硫键。多特异性单体可通过修改环bc和fg来优化。本公开内容的单体可包含adnectin。

这样一种方法可包括在需要症状、效果或机制的这样的调节、治疗、缓解、预防，或减少的细胞、组织、器官、动物或患者中给予有效量的包含至少一个支架蛋白的组合物或药物组合物。有效量可包含每次单独(如，大剂量)、多次或连续给予的约0.001-500mg/kg，或每次单独、多次或连续给予达到0.01-5000μg/ml血清浓度的血清浓度，或其中任何有效范围或值的量，如使用已知的方法(如在此描述的或相关领域已知的)进行和测定的。

支架蛋白的产生与生成

本公开内容的至少一个支架蛋白可任选地通过本领域熟知的细胞系、混合的细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群体生产。见例如，ausubel,etal.,ed.,分子生物学中的通用方案(currentprotocolsinmolecularbiology),johnwiley&sons,inc.,ny,n.y.(1987-2001);sambrook,etal.,分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual),第二版,coldspringharbor,n.y.(1989);harlow和lane,抗体，实验室手册(antibodies,alaboratorymanual),coldspringharbor,n.y.(1989);colligan,etal.,eds.,免疫学的通用方案(currentprotocolsinimmunology),johnwiley&sons,inc.,ny(1994-2001);colliganetal.,蛋白质科学的通用方案(currentprotocolsinproteinscience),johnwiley&sons,ny,n.y.,(1997-2001)。

支架蛋白中的氨基酸可以被改变、添加和/或缺失以降低免疫原性或减少、增强或修改结合、亲和力、结合率(on-rate)、解离率(off-rate)、亲合力(avidity)、特异性、半衰期、稳定性、溶解性或本领域已知的任何其它合适的特性。

任选地，可对支架蛋白进行工程改造以保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学特性。为达到这个目标，支架蛋白可任选地通过利用亲本和工程序列的三维模型对亲代序列和各种概念工程产物的分析过程来制备。三维模型通常是可获得的且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序是可供利用的，其说明和显示选定候选序列的可能三维构象结构并可测量可能的免疫原性(如，xencor,inc.ofmonrovia,calif.的immunofilter程序)。对这些展示的检查允许分析残基在候选序列功能中的可能作用，即分析影响候选支架蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，残基可以从亲代序列和参考序列中选择和组合，从而达到预期的特性，例如对目标抗原的亲和力。做为选择，或除上述程序外，其它合适的工程方法也可以使用。

支架蛋白的筛选

筛选与类似蛋白或片段特异结合的蛋白支架可以方便地使用核苷酸(dna或rna展示)或肽展示库，例如体外展示来实现。这种方法包括对具有所需功能或结构的单个成员收集的大量肽进行筛选。展示的核苷酸或肽序列的长度可以是3-5000或更多个合成核苷酸或氨基酸，常见为5-100个氨基酸长，且常常为约8-25氨基酸长。除了生成肽库的直接化学合成方法外，几种重组dna方法已被描述。一种类型涉及肽序列在噬菌体或细胞表面上的展示。每个噬菌体或细胞含有编码特定展示的肽序列的核苷酸序列。这样的方法被描述于pct专利公布号91/17271、91/18980,91/19818和93/08278中。

生成肽库的其它系统具有体外化学合成和重组两种方法的特点。见，pct专利公布号92/05258,92/14843，和96/19256。也见，美国专利号5,658,754；和5,643,768。肽展示库、载体，和筛选试剂盒可从这样的供应商经市售获得，如invitrogen(carlsbad,calif.)，和cambridgeantibodytechnologies(cambridgeshire,uk)。见例如，授权于enzon的美国专利号4,704,692、4,939,666、4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889、5,534,621、5,656,730、5,763,733、5,767,260、5856456；授权于dyax的5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,837,500，授权于affymax的5,427,908、5,580,717；授权于cambridgeantibodytechnologies的5,885,793；授权于genentech的5,750,373，授权于xoma的5,618,920、5,595,898、5,576,195、5,698,435、5,693,493、5,698,417;colligan,同上；ausubel，同上；或sambrook,同上。

本公开内容的蛋白支架可结合具有广泛范围的亲和力(kd)的人或其他哺乳动物蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的至少一个蛋白支架可任选地以高亲和力，例如，以等于或少于约10-7m，例如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或值)x10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或值的kd结合于目标蛋白，如由本领域技术人员通过实施表面等离子体共振或kinexa方法所测定的。

蛋白支架对抗原的亲和性(affinity)或亲合力(avidity)可以用任何合适的方法经实验确定(见，例如，berzofsky,etal.,“抗体-抗原相互作用(antibody-antigeninteractions)”,infundamentalimmunology,paul,w.e.,ed.,ravenpress:newyork,n.y.(1984);kuby,janisimmunology,w.h.freemanandcompany:newyork,n.y.(1992)；和在此描述的方法)。如果在不同的条件(如，盐浓度、ph)下测量，特定的蛋白支架-抗原相互作用的测量的亲和力可能会有所不同。因此，亲和力和其它抗原-结合参数(如，kd、kon、koff)的测量优选地用蛋白支架和抗原的标准化溶液和标准化缓冲剂(如在此描述的缓冲剂)进行。

竞争性试验可以用本公开内容的蛋白支架执行，以确定哪些蛋白、抗体，和其他拮抗剂与本发明的蛋白支架竞争对目标蛋白的结合和/或共享表位区。这些对本领域普通技术人员来说是很容易知道的试验可评价拮抗剂或配体之间对有限数量的蛋白上的结合位点的竞争。蛋白和/或抗体在竞争前后是固定或不溶解的，且例如，通过倾斜(其中蛋白/抗体已预先溶解)或通过离心(其中蛋白/抗体在竞争反应后沉淀)，使与目标蛋白结合的样品与未结合的样品分离。同样，竞争性结合可能由蛋白支架与目标蛋白的结合或缺乏结合的功能是否改变而决定，例如，蛋白支架分子是否抑制或增强例如标记的酶促活性。elisa和其他功能分析可被使用，这是本领域熟知的。

核酸分子

本公开内容编码蛋白支架的核酸分子可呈现为rna的形式，如mrna、hnrna、trna或任何其他形式，或为dna的形式，包括，但不限于cdna和通过克隆获得的或合成产生的基因组dna，或其任何组合。dna可以是三链、双链或单链的，或其任何组合。dna或rna的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或者它可以是非-编码链，也称为反义链。

本公开内容的分离的核酸分子可包含含有开放阅读框(orf)的核酸分子，任选地具有一个或多个内含子，例如，但不限于至少一个蛋白支架的至少一个特定的部分；包含结合目标蛋白的蛋白支架或环区的编码序列的核酸分子；和包含基本上不同于上述那些的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码如在此描述的和/或如本领域已知的蛋白支架的核酸分子。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，对于本领域技术人员来说，生产这样的简并核酸变体将是例行的事，所述核酸变体编码本发明的特定蛋白支架。见例如，ausubel,etal.,同上，这样的核酸变体被包括在本发明内。

如在此指明的，本公开内容的包含核酸编码蛋白支架的核酸分子可包括，但不限于那些编码蛋白支架片段自身的氨基酸序列；完整蛋白支架或其部分的编码序列；蛋白支架、片段或部分的编码序列，以及附加序列，如至少一个信号先导或融合肽的编码序列，有或没有前面提到的附加编码序列，例如至少一个与附加的非-编码序列一起的内含子，包括但不限于非-编码5′和3′序列，如在转录、mrna加工，包括剪接和多腺苷化信号(例如，mrna的核糖体结合和稳定性)中起作用的转录的，非翻译的序列；编码额外的氨基酸的附加编码序列，例如提供额外功能的那些。因此，编码蛋白支架的序列可融合于标记序列，如编码促进包含蛋白支架片段或部分的融合蛋白支架纯化的肽的序列。

选择性地与如在此描述的多核苷酸杂交的多核苷酸

本公开内容提供在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，这个实施方案的多核苷酸可被用于分离、检测，和/或定量包含这样的多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可被用来在保藏的库中鉴定、分离，或扩增部分或全长克隆。在一些实施方案中，多核苷酸是基因组的或分离的cdna序列，或者相反，与来自人类或哺乳动物核酸库的cdna互补。

优选地，cdna库包含至少80%的全长序列，优选至少85%或90%的全长序列，且更优选至少95%的全长序列。cdna库可以标准化以增加稀有序列的表示。低或中度严格性的杂交条件通常但不排除地用于相对于互补序列具有减少序列同一性的序列。中和高严格性条件可任选地用于具有更大同一性的序列。低严格性条件允许具有约70%序列同一性的序列的选择性杂交并可被用来鉴定正向同源或共生同源序列。

任选地，本发明的多核苷酸将编码至少一部分由在此描述的多核苷酸编码的蛋白支架。本发明的多核苷酸包含可被用于与编码本发明的蛋白支架的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。见例如，ausubel,同上；colligan,同上，各自通过引用全文并入本文。

核酸的构建

本公开内容的分离的核酸采用以下方法制备：(a)重组方法，(b)合成技术；(c)纯化技术，和/或(d)其组合，如本领域熟知的。

除了本发明的多核苷酸外，所述核酸可方便地还包含其他序列。例如，包含一个或多个限制性内切酶位点的多克隆位点可插入核酸中以帮助分离多核苷酸。同样，可以插入可翻译的序列，以帮助分离本公开内容的翻译的多核苷酸。例如，六聚-组氨酸标记序列提供了一种纯化本公开内容的蛋白的便利方法。本公开内容的核酸(不包括编码序列)可任选地为用于本公开内容的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、适配体或接头。

附加序列可被加入到这样的克隆和/或表达序列中，以优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改善多核苷酸在细胞中的导入。克隆载体、表达载体、适配体和接头是本领域熟知的(见例如，ausubel,同上；或sambrook,同上)。

构建核酸的重组方法

本公开内容的分离的核酸组合物，如rna、cdna、基因组dna，或其任何组合，可以使用本领域技术人员已知的任意数量的克隆方法从生物来源获得。在一些实施方案中，在严格的条件下，与本发明的多核苷酸选择性地杂交的寡核苷酸探针被用来鉴定cdna或基因组dna库中的期望的序列。rna的分离，和cdna和基因组库的构建是本领域普通技术人员熟知的(见例如，ausubel,同上；或sambrook,同上)。

核酸筛选和分离方法

cdna或基因组库可使用基于本公开内容多核苷酸的序列的探针进行筛选。探针可被用来与基因组dna或cdna序列杂交，以分离同一或不同生物中的同源基因。本领域技术人员将意识到，该方法可采用不同程度的杂交强度；和无论是杂交还是洗涤介质都可能是严格的。因为杂交的条件越来越严格，探针和靶标之间必须有更大程度的互补性，才能形成双链。严格程度可由温度、离子强度、ph和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一个或多个因素控制。例如，通过改变反应物溶液的极性，可以例如通过控制甲酰胺的浓度在0%-50%的范围内，方便地改变杂交的严格性。为可检测的结合所需的互补性(序列同一性)程度将根据杂交培养基和/或洗涤介质的严格性而有所不同。互补性程度将最好为100%，或70-100%，或其中的任何范围或值，然而，应该理解，探针和引物中的微小序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性来补偿。

rna或dna的扩增方法是本领域熟知的并可依据本公开内容基于本文的讲述和指导采用，而无需不适当的实验。

dna或rna扩增的已知的方法包括，但不限于聚合酶链反应(pcr)和相关扩增过程(见例如，授予mullis,etal.的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予tabor,etal的4,795,699和4,921,794；授予innis的5,142,033；授予wilson,etal.的5,122,464；授予innis的5,091,310；授予gyllensten,etal的5,066,584；授予gelfand,etal的4,889,818；授予silver,etal的4,994,370；授予biswas的4,766,067；授予ringold的4,656,134)和rna介导的扩增(使用对作为双链dna合成模板的目标序列的反义rna)(授予malek,etal的美国专利号5,130,238，商品名nasba)，其参考文献的全部内容通过引用并入本文(见例如，ausubel,同上；或sambrook,同上)。

例如，聚合酶链反应(pcr)技术可被用来扩增本公开内容的多核苷酸的序列和直接来自基因组dna或cdna库的相关基因。pcr和其它体外扩增方法也可用于例如克隆编码要表达的蛋白的核酸序列，制备用作检测期望的mrna在样品中的存在，对核酸测序，或用于其它目的的探针的核酸。通过体外扩增方法足以指导技术人员的技术的实例见于berger,同上,sambrook,同上，和ausubel,同上，以及mullis,etal.,美国专利号4,683,202(1987)；和innis,etal.,pcrprotocolsaguidetomethodsandapplications,eds.,academicpressinc.,sandiego,calif.(1990)。用于基因组pcr扩增的市售可获得的试剂盒是本领域已知的。见例如，优等-gc基因组pcr试剂盒(advantage-gcgenomicpcrkit)(clontech)。另外，例如，t4基因32蛋白(boehringermannheim)可被用来提高长pcr产物的收率。

构建核酸的合成方法

本公开内容的分离的核酸也可以用已知的方法，通过直接化学合成来制备(见例如，ausubel,etal.,同上)。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板，用dna聚合酶聚合而转化成双链dna。本领域技术人员将认识到，虽然dna的化学合成可能限制在大约100个或更多碱基的序列，更长的序列可以通过连接较短的序列获得。

重组表达盒

本公开内容进一步提供包含本公开内容的核酸的重组表达盒。本公开内容的核酸序列，例如，编码本公开内容的蛋白支架的cdna或基因组序列，可被用来构建可引入至少一个期望的宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常包含可操作地连接到转录起始调控序列的本公开内容的多核苷酸，所述调控序列将指导预期宿主细胞中多核苷酸的转录。异源的和非-异源的(即，内源的)启动子都可能被用来指导本公开内容的核酸的表达。

在一些实施方案中，用作启动子,增强子，或其它元素的分离的核酸可以在本公开内容的多核苷酸的非-异源形式的适当位置(上游、下游或在内含子中)引入，以便上调或下调本公开内容的多核苷酸的表达。例如，内源性启动子可以在体内或体外通过突变、缺失和/或替代而改变。

载体和宿主细胞

本公开内容也涉及包含分离的本公开内容的核酸分子的载体、用重组载体进行基因工程改造的宿主细胞，和用重组技术制备的至少一种蛋白支架，这是本领域熟知的。见例如，sambrook,etal.,同上；ausubel,etal.,同上，各自通过引用全文并入本文。

例如，可使用pb-ef1a载体。载体包含以下核苷酸序列：

tgtacatagattaaccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttatcgaatacctgcagcccgggggatgcagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaagttgactgtgcctttcgatcgaaccatggacagttagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgagaattctaatacgactcactatagggtgtgctgtctcatcattttggcaaagattggccaccaagcttgtcctgcaggagggtcgacgcctctagacgggcggccgctccggatccacgggtaccgatcacatatgcctttaattaaacactagttctatagtgtcacctaaattccctttagtgagggttaatggccgtaggccgccagaattgggtccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttcggactctaggacctgcgcatgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgttttccccgtatccccccaggtgtctgcaggctcaaagagcagcgagaagcgttcagaggaaagcgatcccgtgccaccttccccgtgcccgggctgtccccgcacgctgccggctcggggatgcggggggagcgccggaccggagcggagccccgggcggctcgctgctgccccctagcgggggagggacgtaattacatccctgggggctttgggggggggctgtccctctcaccgcggtggagctccagcttttgttcgaattggggccccccctcgagggtatcgatgatatctataacaagaaaatatatatataataagttatcacgtaagtagaacatgaaataacaatataattatcgtatgagttaaatcttaaaagtcacgtaaaagataatcatgcgtcattttgactcacgcggtcgttatagttcaaaatcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcctcacgggagctccaagcggcgactgagatgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgctatttagaaagagagagcaatatttcaagaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctagggttaatctagctagccttaagggcgcctattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagtcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcataatattattgaagcatttatcagggttcgtctcgtcccggtctcctcccaatgcatgtcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataata(seqidno:40)。

多核苷酸可任选地连接到包含可选择标记的载体，以供在宿主中增殖。一般来说，在沉淀物中引入质粒载体，如磷酸钙沉淀，或在一个带电荷脂质的复合物中。如果载体是病毒，它可以用合适的包装细胞系在体外包装，然后导入宿主细胞。

dna插入应该可操作地连接到适当的启动子上。表达构建体还将包含转录起始、终止的位点，并在转录区包含用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录子的编码部分将优选地包含从开头开始的翻译和适当定位在要翻译的mrna末端的终止密码子(如，uaa、uga或uag)，uaa和uag优先用于哺乳动物或真核细胞表达。

表达载体将优选地(但任选地)包含至少一个可选择的标记。这样的标记包括，例如，但不限于氨苄西林、博来霉素(shbla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素b(hygb基因)、g418/遗传霉素(neo基因)、麦考酚酸，或谷氨酰胺合成酶(gs,美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)、杀稻瘟菌素(bsd基因)，对真核细胞培养以及氨苄西林、博来霉素(shbla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素b(hygb基因)、g418/新霉素(neo基因)、卡那霉素、大观霉素、链霉素、羧苄西林、博莱霉素、红霉素、多粘菌素b，或四环素的耐药基因，对在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养的耐药基因(以上专利通过引用全部并入本文)。对于上述宿主细胞的适宜的培养基和条件是本领域已知的。对于技术人员而言，合适的载体将是显而易见的。将载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它已知的方法进行。这样的方法在本领域有描述，如sambrook,同上,章节1-4和16-18;ausubel,同上,章节1、9、13、15、16。

表达载体将优选地(但任选地)包含至少一个可选择的细胞表面标记，以供分离由本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的细胞表面标记包含表面蛋白、糖蛋白，或浆细胞的或细胞的子集与另一个定义的细胞子集区分开来的蛋白组。优选地，可选择的细胞表面标记将由本公开内容的组合物和方法修饰的那些细胞与未由本公开内容的组合物和方法修饰的那些细胞区分开来。这样的细胞表面标记包括，例如，但不限于“指定簇”或“分类决定子”蛋白(通常缩写为“cd”)，例如截短的或全长形式的cd19、cd271、cd34、cd22、cd20、cd33、cd52，或其任何组合。细胞表面标记还包括自杀基因标记rqr8(philipbetal.blood.2014aug21;124(8):1277-87)。

表达载体将优选地(但任选地)包括至少一个可选择的耐药标记，以供分离由本公开内容的组合物和方法修饰的细胞。本公开内容的可选择的耐药标记可包含野生型或突变体neo、dhfr、tyms、francf、rad51c、gcs、mdr1、aldh1、nkx2.2，或其任何组合。

至少一个本公开内容的蛋白支架可以以一种修饰的形式表达，例如融合蛋白，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括额外的异源功能区。例如，额外的氨基酸区，特别是荷电的氨基酸，可被加入到蛋白支架的n-末端，以提高在纯化过程中，或在随后的处理和储存过程中的稳定性和在宿主细胞中的持久性。同样，所述肽部分可加入到本公开内容的蛋白支架以促进纯化。在最后制备蛋白支架或其至少一个片段之前，可以移除这样的区。这样的方法被描述于许多标准实验室手册，如sambrook,同上,章节17.29-17.42和18.1-18.74;ausubel,同上,章节16,17和18。

本领域普通技术人员对大量可用于表达编码本公开内容的蛋白的核酸表达系统非常了解。做为选择，通过在含有编码本公开内容的蛋白支架的内源性dna的宿主细胞中打开(通过操作)，本公开内容的核酸可在宿主细胞中表达。这样的方法是本领域熟知的，例如，如在美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述，通过引用全部并入本文。

可用于制备蛋白支架、其特定部分或变体的示例性细胞培养，是本领域已知的细菌、酵母，和表达细胞。表达细胞系统常常以单层细胞的形式存在，尽管哺乳动物细胞悬液或生物反应器也可以被使用。本领域已经开发出许多能够表达完整糖基化蛋白的合适的宿主细胞系，并包括cos-1(如，atcccrl1650)、cos-7(如，atcccrl-1651)、hek293、bhk21(如，atcccrl-10)、cho(如，atcccrl1610)和bsc-1(如，atcccrl-26)细胞系、cos-7细胞、cho细胞、hepg2细胞、p3x63ag8.653、sp2/0-ag14、293细胞、hela细胞等，可从例如美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection),manassas,va.(www.atcc.org)容易地获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是p3x63ag8.653细胞(atcc登录号crl-1580)和sp2/0-ag14细胞(atcc登录号crl-1851)。在特别优选的实施方案中，重组细胞是p3x63ab8.653或sp2/0-ag14细胞。

用于这些细胞的表达载体可包含一个或多个以下的表达控制序列，例如，但不限于复制起点；启动子(如，延迟或早期sv40启动子、cmv启动子(美国专利号5,168,062;5,385,839)、hsvtk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、ef-1α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一个人启动子；增强子，和/或处理信息位点，如核糖体结合位点、rna剪接位点、多腺苷酸化位点(例如，sv40大tag聚a加成位点)，和转录终止子序列。见例如，ausubeletal.,同上；sambrook,etal.,同上。可用于制备本发明的核酸或蛋白的其它细胞是已知的和/或可从例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(americantypeculturecollectioncatalogueofcelllinesandhybridomas)(www.atcc.org)或其它已知的或商业来源获得。

当利用真核宿主细胞时，多腺苷酸化或转录终止子序列通常被结合到载体中。终止子序列的实例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。转录本的准确剪接序列也可以包括在内。剪接序列的实例是来自sv40的vp1内含子(sprague,etal.,j.virol.45:773-781(1983))。另外，控制宿主细胞复制的基因序列可以结合到载体中，如本领域已知的。

蛋白支架的纯化

用众所周知的方法可以从重组细胞培养中回收和纯化蛋白支架，包括但不限于蛋白a纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和层析、羟基磷灰石色谱和凝集素层析。高效液相色谱(“hplc”)也可用于纯化。见例如，colligan,免疫学的通用方案(currentprotocolsinimmunology)，或蛋白质科学的通用方案(currentprotocolsinproteinscience),johnwiley&sons,ny,n.y.,(1997-2001),如，章节1、4、6、8、9、10，各自通过引用全文并入本文。

本公开内容的蛋白支架包括天然纯化的产物、化学合成工艺的产物，和通过重组技术从原核或真核宿主，包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和表达细胞生产的产物。取决于重组生产程序中所用的宿主，本公开内容的蛋白支架可以被糖基化或可以被非-糖基化。这样的方法被描述于许多标准实验室手册，如sambrook,同上,sections17.37-17.42;ausubel,同上,章节10、12、13、16、18和20,colligan,proteinscience,同上,章节12-14，所有通过引用全部并入本文。

氨基酸密码

组成本公开内容的蛋白支架的氨基酸通常都是缩写的。氨基酸命名可以通过用其单字母代码指定氨基酸、其三个字母代码，名称，或本领域普遍理解的三个核苷酸密码子来表示(见alberts,b.,etal.,细胞的分子生物学(molecularbiologyofthecell),第3版,garlandpublishing,inc.,newyork,1994)。本公开内容的蛋白支架可包含一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，无论是从自然突变或人为操纵，如本文所指定的。本公开内容的蛋白支架中为功能所必需的氨基酸，可以通过本领域已知的方法来识别，如例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(如，ausubel,同上,章节8,15;cunningham和wells,science244:1081-1085(1989))。后一种程序在分子中的每一个残基上都引入了单一的丙氨酸突变。然后对产生的突变分子进行生物活性测试，例如，但不限于至少一种中和活性。蛋白支架结合的关键位点也可以通过结构分析来确定，如结晶、核磁共振或光亲和标记(smith,etal.,j.mol.biol.224:899-904(1992)和devos,etal.,science255:306-312(1992))。

如技术人员所意识到的，本发明包括至少一个生物活性的本公开内容的蛋白支架。生物活性的蛋白支架具有天然的(非-合成)、内源的或相关和已知的蛋白支架的特异性活性的至少20%、30%，或40%，和优选至少50%、60%，或70%，且最优选至少80%、90%，或95%-99%或更多的特异性活性。酶活性和底物特异性的测定和定量测量的方法是本领域技术人员熟知的。

在另一方面，本公开内容涉及如在此描述的蛋白支架和片段，其被有机分子的共价附着修饰。这样的修饰可产生一种具有改进的药代动力学特性的蛋白支架片段(如，增加的体内血清半衰期)。有机部分可以是线性或支化的亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基。在特定的实施方案中，亲水性聚合物基团可具有约800-约120,000道尔顿的分子量并可以是聚链烷二醇(如，聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，和脂肪酸或脂肪酸酯基可包含从约8至约40个碳原子。

本公开内容的修饰蛋白支架和片段可包含一个或多个与抗体直接或间接地共价结合的有机部分。结合于本公开内容的蛋白支架或片段的每个有机部分可独立地为亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基。如本文所用的，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。如本文所用的术语“亲水性聚合物基团”，指一种比在辛烷中更易溶于水的有机聚合物。例如，聚赖氨酸比在辛烷中更易溶于水。因此，本公开内容涵盖通过聚赖氨酸的共价附着修饰的蛋白支架。适合于修饰本公开内容的蛋白支架的亲水性聚合物可以是线性或支化的并包括，例如，聚链烷二醇(如，peg，单甲氧基-聚乙二醇(mpeg)、ppg等)、碳水化合物(如，葡聚糖、纤维素、低聚糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷烃氧化物(如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本公开内容的蛋白支架的亲水性聚合物作为一个单独的分子实体时，具有约800-约150,000道尔顿的分子量。例如，可以使用peg5000和peg20,000，其中下标是聚合物的平均分子量(道尔顿)。亲水性聚合物基团可用1-约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基取代。用脂肪酸或脂肪酸酯基取代的亲水性聚合物可采用合适的方法制备。例如，包含胺基的聚合物可以偶联到脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸盐上，而脂肪酸或脂肪酸酯上的活化的羧酸盐(如，用羰基二咪唑激活)可以偶联到聚合物的羟基上。

适合于修饰本公开内容的蛋白支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，也可以包含一个或多个不饱和单位。适合于修饰本公开内容的蛋白支架的脂肪酸包括，例如，正-十二烷酸(c12，月桂酸)、正-十四烷酸(c14，豆蔻酸)、正-十八烷酸(c18、硬脂酸)、正-二十烷酸(c20、花生酸)、正-二十二烷酸(c22、山萮酸)、正-三十烷酸(c30)、正-四十烷酸(c40)、顺式-δ9-十八烷酸(c18、油酸)、所有顺式-δ5,8,11,14-二十碳四烯酸(c20，花生四烯酸)、辛二酸，十四碳二酸，十八碳二酸，二十二碳二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含线性或支化的低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可包含1-约12，优选1-约6个碳原子。

修饰的蛋白支架和片段可使用合适的方法，例如通过与一个或多个修饰剂反应来制备。如本文所用的术语“修饰剂”，指包含活化基团的合适的有机基团(如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或功能团，其可在适当的条件下与第二个化学基团反应，从而在修饰剂和第二个化学基团之间形成共价键。例如，胺-反应性活化基团包括亲电基团，如甲苯磺酸、甲磺酸、卤代(氯代、溴代、氟代、碘代)、n-羟基琥珀酰基酯(nhs)等。可与硫醇反应的活化基团包括，例如，马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶二硫醚(pyridyldisulfides)、5-硫羟基-2-硝基苯甲酸硫醇(tnb-硫醇)等。醛功能团可偶联至含有胺或酰肼的分子，而叠氮基可与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯(phosphoramidate)或磷酰亚胺键(phosphorimidelinkages)。将活化基团引入分子的合适的方法是本领域已知的(见例如，hermanson,g.t.,bioconjugatetechnoques；academicpress:sandiego,calif.(1996))。活化基团可直接连接于有机基团(如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通过接头部分，例如，二价c1-c12基团，其中一个或多个碳原子可被杂原子，如氧、氮或硫替代。合适的接头部分包括，例如，四乙二醇(tetraethyleneglycol)、-(ch2)3-、-nh-(ch2)6-nh-、-(ch2)2-nh-和-ch2-o-ch2-ch2-o-ch2-ch2-o-ch-nh-。例如，通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)的存在下，使单-boc-烷基二胺(如，单-boc-乙二胺、单-boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应，形成在游离胺和脂肪酸羧酸盐之间的酰胺键，可制备包含接头部分的修饰剂。boc保护基团可通过用三氟乙酸(tfa)处理从产物除去,以暴露于可偶联至另一个所述的羧酸盐的伯胺，或可与马来酸酐反应，并使生成的产物环化生成一种活化的马来酰亚胺脂肪酸的衍生物(见，例如，thompson,etal.,wo92/16221，其中的全部讲述都通过引用并入本文)。

本公开内容的修饰的蛋白支架可通过使蛋白支架或片段与修饰剂反应来制备。例如，通过使用胺-反应性修饰剂，例如peg的nhs酯，可以非-位点特异性方式使有机部分结合于蛋白支架。包含结合于本公开内容的蛋白支架的特定位点的有机部分的修饰蛋白支架和片段可使用合适的方法，如反向蛋白水解(fischetal.,bioconjugatechem.,3:147-153(1992);werlenetal.,bioconjugatechem.,5:411-417(1994);kumaranetal.,proteinsci.6(10):2233-2241(1997);itohetal.,bioorg.chem.,24(1):59-68(1996);capellasetal.,biotechnol.bioeng.,56(4):456-463(1997))，和在hermanson,g.t.,bioconjugatetechniques；academicpress:sandiego,calif.(1996)中描述的方法制备。

包含另外的治疗活性成分的蛋白支架组合物

本公开内容的蛋白支架化合物、组合物或组合可进一步包含任何合适的辅助剂，例如但不限于稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等的至少一种。药学上可接受的辅助剂是优选的。制备这样的无菌溶液及制备方法的非限制性实例是本领域熟知的，例如，但不限于，gennaro,ed.,remington's药物科学(remington'spharmaceuticalsciences),第18版,mackpublishingco.(easton,pa.)1990。可常规选择适合于本领域熟知的或如在此描述的蛋白支架、片段或变体组合物的给药方式、溶解度和/或稳定性的药学上可接受的载体。

可用于本发明的组合物的药物赋形剂和添加剂包括，但不限于蛋白、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(如，糖，包括单糖、二-、三-、四-，和低聚糖；衍生的糖，如醛糖、醛酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其既可以单独存在，也可以组合存在，包含单独或组合量的1-99.99%重量或体积。示例性蛋白赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(hsa)、重组人白蛋白(rha)、明胶、酪蛋白等。代表性氨基酸/蛋白组分，其也可具有缓冲功能，包括丙氨酸，甘氨酸，精氨酸，甜菜碱、组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司帕坦等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。

适合用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖，如果糖，麦芽糖，半乳糖、葡萄糖、d-甘露糖，山梨糖等；二糖，如乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖等；多糖，如棉子糖、木密三糖(melezitose)、麦芽糊精、葡聚精、淀粉等；和醛醇，如甘露醇，木糖醇，麦芽酚，丙交醇，木糖醇、山梨醇(花楸糖醇)、肌醇等。用于本发明的优选的碳水化合物赋形剂是甘露醇，海藻糖，和棉子糖。

蛋白支架组合物也可包含缓冲剂或ph-调节剂；通常地，缓冲剂是由从有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；tris,盐酸氨丁三醇，或磷酸盐缓冲液。用于本发明组合物的优选的缓冲剂是有机酸盐，例如柠檬酸盐。

此外，本发明的蛋白支架组合物可包括聚合物赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(ficolls)(聚合糖)、葡萄糖结合剂(如，环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂，抗菌剂，甜味剂，抗氧化剂，抗静电剂，表面活性剂(如，聚山梨醇酯，如“tween20”和“tween80”)、脂质(如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(如，胆固醇)，和螯合剂(如，edta)。

适合用于依据本发明的蛋白支架、部分或不同成分的这些和另外的已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如，如在“remington：药物科学和实践(remington:thescience&practiceofpharmacy)”,第19版,williams&williams,(1995)，和在“临床药师案头参考书(physician'sdeskreference)”,第52版,medicaleconomics,montvale,n.j.(1998)中列出的，其公开内容通过引用全部并入本文。优选的载体或赋形剂原料是碳水化合物(如，糖和醛醇)和缓冲剂(如，柠檬酸盐)或聚合剂。示例性载体分子是粘多醣、透明质酸，其可用于关节内递送。

从白细胞去除术(leukapheresis)产物分离t细胞

使用封闭系统和标准方法(例如，血浆分离置换系统(cobespectraapheresissystem))，白细胞去除术产物或血液可临床场所从受试者收集。优选地，依据标准医院或机构白细胞去除术程序，在标准白细胞去除术收集袋收集产物。例如，在本公开内容的方法的优选实施方案中，无额外抗凝血剂或血液添加剂(肝素等)包括在白细胞采集过程中通常使用的那些之外。

做为选择，白细胞(wbc)/外周血单核细胞(pbmc)(使用biosafesepax2(密闭的/自动化的))或t细胞(使用clinimacs®prodigy(密闭的/自动化的))可直接从全血中分离出来。然而，在某些受试者(如诊断和/或治疗癌症的那些)中，wbc/pbmc从全血中分离的产率可能比用白细胞去除术分离时要低得多。

或者，白细胞去除术程序和/或指导细胞分离的程序可用于本公开内容的任何受试者。

白细胞去除术的产物、血液、wbc/pbmc组成和/或t-细胞组成应用绝缘容器包装，并应依据为用于临床方案批准的标准医院机构血液收集程序，保持在受控制的室温下(+19℃至+25℃)。白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分不应冷藏。

在运输过程中，细胞浓缩白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分不应超过0.2x10⁹细胞每ml。应避免白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分的强烈混合。

如果白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分必须贮存例如过夜，它应该在受控制的室温下保持(与上文相同)。在贮存期间，白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分的浓度决不应超过0.2x10⁹细胞每ml。

优选地，白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分的细胞应贮存在自体血浆中。在某些实施方案中，如果白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分的细胞浓度高于0.2x109细胞每ml，产物应用自体血浆稀释。

优选地，当开始标记和分离程序时，白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分不应超过24小时。白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分可使用密闭和/或自动化系统(如，clinimacsprodigy)处理和/或准备细胞标记。

自动化的系统可能是通过渗漉(ficolation)和/或清洗细胞产物来进行额外的白血球层(buffycoat)分离(例如，白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分)。

一种密闭的和/或自动化的系统可被用来制备和标记细胞以供t-细胞分离(从例如白细胞去除术产物、血液、wbc/pbmc成分和/或t-细胞成分)。

虽然wbc/pbmc可能被直接核转染(这更容易且保存其他步骤)，本公开内容的方法可以包括在核转染之前首先分离t细胞。直接核转染pbmc的简单策略要求经由car信号传导介导的car+细胞的选择性扩增，这本身就是一种劣质的扩增方法，其通过使t细胞功能衰竭，直接降低产物的体内效率。产物可以是car+细胞包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、单核细胞，或其任何组合的非均匀成分，这增加了从患者到患者的产物的可变性，增加了剂量和crs管理的更大的难度。因为t细胞被认为是抑制和杀伤肿瘤的主要效应物，t细胞分离用于制造一种自体产物可能导致超过其他更不均匀的成分的显著的好处。

t细胞可以通过富集标记细胞或在单向标记程序中耗尽标记细胞来直接分离，或者在两步标记程序中间接地分离。根据本公开内容的某些富集策略，t细胞可以收集在细胞收集袋，而未标记的细胞(非-靶细胞)在负分压袋中收集。本公开内容的富集策略相反，未标记的细胞(靶细胞)在细胞收集袋中收集，而标记的细胞(非-靶细胞)分别在负分压袋或非-靶细胞袋中收集。选择的试剂可包括，但不限于抗体包覆的珠。抗体包覆的珠可或者在修饰和/或扩增步骤之前除去，或者在修饰和/或扩增步骤之前保留在细胞上。细胞标记的一个或多个以下非-限制性实例可被用来分离t-细胞：cd3、cd4、cd8、cd25,抗-生物素、cd1c、cd3/cd19、cd3/cd56、cd14、cd19、cd34、cd45ra、cd56、cd62l、cd133、cd137、cd271、cd304、ifn-γ、tcrα/β，和/或其任何组合。用于分离t-细胞的方法可包括一个或多个试剂，其特异性地结合和/或可检测地-标记可被用来分离t-细胞的细胞标记的一个或多个以下非-限制性实例：cd3、cd4、cd8、cd25、抗-生物素、cd1c、cd3/cd19、cd3/cd56、cd14、cd19、cd34、cd45ra、cd56、cd62l、cd133、cd137、cd271、cd304、ifn-γ、tcrα/β，和/或其任何组合。这些试剂可能是或可能不是“良好操作规范”(“gmp”)级。试剂可包括，但不限于thermodynabeads和miltenyiclinimacs产物。分离本公开内容的t-细胞的方法可能包括标记和/或隔离步骤的多次迭代。在分离本公开内容的t-细胞的方法的任何点，不需要的细胞和/或不需要的细胞类型可通过积极或消极地选择不需要的细胞和/或不想要的细胞类型，可以从本公开内容的t细胞产物组成中耗尽。本公开内容的t细胞产物组合物可含有额外的可表达cd4、cd8，和/或另一个t细胞标记的细胞类型。

本公开内容的用于t细胞的核转染的方法可通过例如，在一个群体中或由wbc/pbmc组成的t细胞核转染过程中(在核转染后，包括分离步骤或经由tcr信号传导的选择性扩增步骤)消除t细胞分离的步骤。

某些细胞群可在t细胞富集和/或分选前后，通过积极或消极地选择来消除。可从细胞产物成分中耗尽的细胞成分的实例，可包括髓细胞、cd25+调节t细胞(tregs)、树突细胞、巨噬细胞、红细胞、肥大细胞、γ-δt细胞、天然杀伤(nk)细胞、天然杀伤(nk)-样细胞(如细胞因子诱导的杀伤(cik)细胞)、诱导型天然杀伤(ink)t细胞、nkt细胞、b细胞，或其任何组合。

本公开内容的t细胞产物组成可包括cd4+和cd8+t-细胞。cd4+和cd8+t-细胞可被分离到分开的收集袋中。cd4+t细胞和cd8+t细胞可被进一步地分开处理，或经重组(组合呈相同组成)以特定比例处理。

可重组的特定比例的cd4+t细胞和cd8+t细胞可取决于所用扩增技术的类型和功效、细胞培养基，和/或为扩增t-细胞产物成分所用的生长条件。可能的cd4+:cd8+比例的实例包括，但不限于50%:50%、60%:40%、40%:60%75%:25%和25%:75%。

cd8+t细胞表现出强大的杀死肿瘤细胞的能力，而cd4+t细胞提供许多支持cd8+t细胞增殖能力和功能所需的细胞因子。因为从正常供体分离的t细胞主要是cd4+，t-细胞产物成分在体外根据cd4+:cd8+比例进行人工调节，以提高cd4+t细胞与cd8+t细胞的比值，否则在体内就会以别的比值出现。优化比值也可用于自体的t-细胞产物成分的离体扩增。鉴于人工调节的t-细胞产物成分的cd4+:cd8+比例，重要的是要注意到，本公开内容的产物的组成与任何天然存在的t-细胞群相比，可能存在显著差异，并提供了更大的优势。

用于t细胞分离的优选的方法可包括一个负选择策略，以产生未接触的pant细胞，这意味着生成的t-细胞组成包括未被操纵并且含有天然存在的种类/比例的t-细胞的t-细胞。

可用于正或负选择的试剂包括但不限于磁性细胞分离珠。在本公开内容的t-细胞分离方法的下一步骤之前，磁性细胞分离珠可能或不可能从选定的cd4+t细胞、cd8+t细胞群，或cd4+和cd8+t细胞二者的混合群体中移除或耗尽。

可以准备t细胞成分和t细胞产物成分以供冷冻保存、标准t细胞培养基中保存和/或基因修饰。

t细胞组成、t细胞产物成分、未刺激的t细胞组合物、静息的t细胞成分或其任何部分可以用一种标准的冷冻保存方法进行冷冻保存，这种方法是为储存和恢复具有高恢复能力、活力、表型和/或功能能力的人细胞而优化的。可采用市售可获得的冷冻保存介质和/或方案。本公开内容的冷冻保存方法可包括无dmso冷冻剂(如cryosofree™无dmso冷冻保存介质)，以减少冷冻-相关毒性。

t细胞组成、t细胞产物成分、未刺激的t细胞组成、静息t细胞成分或其任何部分可保存在培养基中。本公开内容的t细胞培养基可被优化以供细胞储存、细胞基因修饰、细胞表型和/或细胞扩增。本公开内容的t细胞培养基可包括一个或多个抗体。因为在细胞培养基中包含抗生素可能会经由核转染降低基因修饰后的转染效率和/或细胞得量，特定抗生素(或其组合)和它们各自的浓度可能会被改变，以在经由核转染的基因修饰后获得最佳的转染效率和/或细胞产量。

本公开内容的t细胞培养基可包括血清，而且，血清成分和浓度可能会改变，以获得最佳的细胞结果。人ab血清比fbs/fcs更适合于t细胞的培养，因为，虽然考虑在本公开内容的t细胞培养基中使用，fbs/fcs可能会引入异种蛋白。血清可从打算给予受试者培养的t-细胞成分的血液中分离出来，因此，本公开内容的t细胞培养基可包含自体的血清。无血清培养基或血清-代用品也可用于本公开内容的t细胞培养基。在t-细胞培养基的某些实施方案和本公开内容的方法中，无血清培养基或血清-代用品可提供超过用异种血清补充培养基的优势，包括,但不限于在核转染后表现出更高的活力，表现出更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的更健康的细胞。

t细胞培养基可包括市售可获得的细胞生长培养基。示例性市售可获得的细胞生长培养基包括，但不限于pbs、hbss、optimem、dmem、rpmi1640、aim-v、x-vivo15、cellgrodc培养基、ctsoptimizert细胞扩增sfm、texmacs培养基、prime-xvt细胞扩增培养基、immunocult-xft细胞扩增培养基，或其任何组合。

可准备t细胞成分、t细胞产物成分、未刺激的t细胞成分、静息t细胞成分或其任何部分以供基因修饰。为基因修饰而进行的t细胞成分、t细胞产物成分、未刺激的t细胞成分、静息t细胞成分或其任何部分的准备工作可包括细胞洗涤和/或再悬浮于期望的核转染缓冲剂中。冷冻保藏的t-细胞成分可以解冻和制备由核转染修饰的基因。冷冻保藏的细胞可依据标准或已知的方案解冻。冷冻保藏细胞的解冻和准备可被优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染，核转染后表现出更大的活力，表现出更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。例如，grifolsalbutein(25%人白蛋白)可用于解冻和/或准备过程。

自体的t细胞产物成分的基因修饰

t细胞成分、t细胞产物成分、未刺激的t细胞成分、静息t细胞成分或其任何部分可使用例如核转染策略例如电穿孔进行基因修饰。要进行核转染的细胞总数，核转染反应的总体积，和样品准备的精确时间可以优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染，核转染后表现出更大的活力，表现出更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。

核转染和/或电穿孔可使用，例如，lonzaamaxa、maxcytepulseagile、harvardapparatusbtx，和/或invitrogenneon实现。非-金属电极系统，包括但不限于塑料聚合物电极，对于核转染可能是优选的。

在通过核转染的基因修饰之前，t细胞成分、t细胞产物成分、未刺激的t细胞成分、静息t细胞成分或其任何部分可再悬浮于核转染缓冲液中。本公开内容的核转染缓冲液包括市售可获得的核转染缓冲液。本公开内容的核转染缓冲液可被优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染，核转染后表现出更大的活力，表现出更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。本公开内容的核转染缓冲液可包括，但不限于pbs、hbss、optimem、btxpress、amaxanucleofector、人t细胞核转染缓冲剂和其任何组合。本公开内容的核转染缓冲液可包含一种或多种补充因子，以产生具有更大活力、更高效率的核转染，核转染后表现出更大的活力，表现出更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。示例性补充因子包括，但不限于重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素和其任何组合。示例性细胞因子、趋化因子，和白细胞介素包括，但不限于、il2、il7、il12、il15、il21、il1、il3、il4、il5、il6、il8、cxcl8、il9、il10、il11、il13、il14、il16、il17、il18、il19、il20、il22、il23、il25、il26、il27、il28、il29、il30、il31、il32、il33、il35、il36、gm-csf、ifn-γ、il-1α/il-1f1、il-1β/il-1f2、il-12p70、il-12/il-35p35、il-13、il-17/il-17a、il-17a/f异二聚体、il-17f、il-18/il-1f4、il-23、il-24、il-32、il-32β、il-32γ、il-33、lap(tgf-β1)、淋巴毒素-α/tnf-β、tgf-β、tnf-α、trance/tnfsf11/rankl和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性盐、矿物质和代谢物包括，但不限于hepes、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、mem非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、fbs/fcs、人血清、血清替代品、抗生素、ph调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、nucleofectorplus补充剂、kcl、mgcl2、na2hpo4、nah2po4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、cina、葡萄糖、ca(no3)2、tris/hcl、k2hpo4、kh2po4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、pop313、crown-5，和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于培养基例如pbs、hbss、optimem、dmem、rpmi1640、aim-v、x-vivo15、cellgrodc培养基、ctsoptimizert细胞扩增sfm、texmacs培养基、prime-xvt细胞扩增培养基、immunocult-xft细胞扩增培养基和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于细胞dna传感、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括，但不限于tlr9、myd88、irak、traf6、traf3、irf-7、nf-kb、1型干扰素、促炎细胞因子、cgas、sting、sec5、tbk1、irf-3、rnapoliii、rig-1、ips-1、fadd、rip1、traf3、aim2、asc、半胱天冬酶1、pro-il1b、pi3k、akt、wnt3a的抑制剂，糖原合酶激酶-3β(gsk-3β)的抑制剂(如tws119)、bafilomycin、氯喹、奎纳克林、ac-yvad-cmk、z-vad-fmk、z-ietd-fmk和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于以增强细胞传递，增强核传递或转运，促进核酸进入细胞核，促进表染色体核酸的降解，和/或降低dna-介导的毒性的方式，修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。修饰或稳定一种或多种核酸的示例性试剂包括，但不限于ph调节剂、dna-结合蛋白、脂质、磷脂、capo4、带有或没有nls序列的净中性电荷dna结合肽、trex1酶，和其任何组合。

转位试剂，包括转座子和转座酶，可在将细胞加入到核转染缓冲剂(任选地，包含在核转染反应小瓶或比色杯中)之前、于加入同时，或之后加入到本公开内容的核转染反应中。本公开内容的转座子可包含质粒dna、线性质粒dna、pcr产物、doggybone™dna、mrna模板、单链或双链dna、蛋白-核酸组合或其任何组合。本公开内容的转座子可包含一个或多个序列，其编码一个或多个ttaa位点、一个或多个反向末端重复(itrs)、一个或多个长尾重复(ltrs)、一个或多个绝缘子、一个或多个启动子、一个或多个全长或截短的基因、一个或多个聚a信号、一个或多个自切2a肽裂解位点、一个或多个内部核糖体进入位点(ires)、一个或多个增强子、一个或多个调节基因、一个或多个复制起点，和其任何组合。

本公开内容的转座子可包含一个或多个序列，其编码一个或多个全长或截短的基因。由本公开内容的转座子引入的全长和/或截短的基因可编码一个或多个信号肽、centyrin、单链可变片段(scfv)、铰链、跨膜结构域、共刺激结构域、一种嵌合抗原受体(car)、嵌合t-细胞受体(car-t)、cartyrin(包含centyrin的car-t)、受体、配体、细胞因子、耐药性基因、肿瘤抗原、同种异体抗原(alloantigen)或自体抗原(autoantigen)、酶、蛋白、肽、多肽、荧光蛋白、突变蛋白或其任何组合。

本公开内容的转座子可在水、tae、tbe、pbs、hbss、培养基、本公开内容或其任何组合补充因子中制备。

本公开内容的转座子可被设计以优化临床安全性和/或提高可制备性。作为一个非限制性实例，本公开内容的转座子可被设计以通过消除不必要的序列或区域和/或包括一个非抗生素选择标记，优化临床安全性和/或提高可制备性。本公开内容的转座子可能是或可能不是gmp级。

本公开内容的转座酶可通过质粒dna、mrna、蛋白、蛋白-核酸组合或其任何组合的一个或多个序列编码。

本公开内容的转座酶可在水、tae、tbe、pbs、hbss、培养基、本公开内容或其任何组合补充因子中制备。本公开内容的转座酶或编码或递送它们的序列/构建体可能是或可能不是gmp级。

本公开内容的转座子和转座酶可通过任何方式递送到细胞。

虽然本公开内容的组合物和方法包括通过质粒dna(pdna)将本公开内容的转座子和/或转座酶递送至细胞，使用质粒递送可允许转座子和/或转座酶被整合进细胞的染色体dna，这可导致连续的转座酶表达。因此，本公开内容的转座子和/或转座酶可作为mrna或者蛋白被递送到细胞，以除去任何染色体整合的可能性。

本公开内容的转座子和转座酶可在转座子和/或转座酶引入核转染反应之前，可以单独或联合进行预孵育。每个转座子和转座酶的绝对量，以及相对量，例如，转座子与转座酶的比例可以优化。

在准备核转染反应后，任选地，在小瓶或比色杯中，根据制造商的协议，反应可能被加载到细胞核转染液装置中，并被激活以传送电流脉冲。递送本公开内容的转座子和/或转座酶(或编码本公开内容的转座子和/或转座酶的序列)给细胞所用的电流脉冲条件可被优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染，核转染后表现出更大的活力，更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。对于amaxa2b或4d细胞核转染液，每一个不同的核转染程序都被考虑在内。

在本公开内容的核转染反应后，细胞可以轻轻地添加到细胞培养基中。例如，当t细胞经历核转染反应，t细胞可加入到t细胞培养基中。本公开内容的核转染后细胞培养基可包含任何一个或多个市售可获得的培养基。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后t细胞培养基)可被优化以产生具有更大活力、更高效率的核转染，核转染后表现出更大的活力，展示出更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后t细胞培养基)可包含pbs、hbss、optimem、dmem、rpmi1640、aim-v、x-vivo15、cellgrodc培养基、ctsoptimizert细胞扩增sfm、texmacs培养基、prime-xvt细胞扩增培养基、immunocult-xft细胞扩增培养基和其任何组合。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后t细胞培养基)可包含本公开内容的一种或多种补充因子，以提高活力、核转染效率、效率核转染后表现出更大的活力、细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。示例性补充因子包括，但不限于重组人细胞因子、趋化因子、白细胞介素和其任何组合。示例性细胞因子、趋化因子，和白细胞介素包括，但不限于、il2、il7、il12、il15、il21、il1、il3、il4、il5、il6、il8、cxcl8、il9、il10、il11、il13、il14、il16、il17、il18、il19、il20、il22、il23、il25、il26、il27、il28、il29、il30、il31、il32、il33、il35、il36、gm-csf、ifn-γ、il-1α/il-1f1、il-1β/il-1f2、il-12p70、il-12/il-35p35、il-13、il-17/il-17a、il-17a/f异二聚体、il-17f、il-18/il-1f4、il-23、il-24、il-32、il-32β、il-32γ、il-33、lap(tgf-β1)、淋巴毒素-α/tnf-β、tgf-β、tnf-α、trance/tnfsf11/rankl和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于盐、矿物质、代谢物或其任何组合。示例性盐、矿物质和代谢物包括，但不限于hepes、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、mem非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、fbs/fcs、人血清、血清替代品、抗生素、ph调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、nucleofectorplus补充剂、kcl、mgcl2、na2hpo4、nah2po4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、cina、葡萄糖、ca(no3)2、tris/hcl、k2hpo4、kh2po4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、pop313、crown-5，和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于培养基例如pbs、hbss、optimem、dmem、rpmi1640、aim-v、x-vivo15、cellgrodc培养基、ctsoptimizert细胞扩增sfm、texmacs培养基、prime-xvt细胞扩增培养基、immunocult-xft细胞扩增培养基和其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于细胞dna传感、代谢、分化、信号转导、凋亡途径及其组合的抑制剂。示例性抑制剂包括，但不限于tlr9、myd88、irak、traf6、traf3、irf-7、nf-kb、1型干扰素、促炎细胞因子、cgas、sting、sec5、tbk1、irf-3、rnapoliii、rig-1、ips-1、fadd、rip1、traf3、aim2、asc、半胱天冬酶1、pro-il1b、pi3k、akt、wnt3a的抑制剂、糖原合酶激酶-3β(gsk-3β)的抑制剂(如tws119)、bafilomycin、氯喹、奎纳克林、ac-yvad-cmk、z-vad-fmk、z-ietd-fmk及其任何组合。示例性补充因子包括，但不限于以增强细胞传递，增强核传递或转运，促进核酸进入细胞核，促进表染色体核酸的降解，和/或降低dna-介导的毒性的方式修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。修饰或稳定一种或多种核酸的示例性试剂包括，但不限于ph调节剂、dna-结合蛋白、脂质、磷脂、capo4、capo4、带有或没有nls序列的净中性电荷dna结合肽、trex1酶，和其任何组合。

本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后t细胞培养基)可在室温或预热至，例如32℃-37℃之间(包括端点)使用。本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后t细胞培养基)可预热至维持或提高细胞成活力和/或表达本公开内容的转座子或其部分的任何温度。

本公开内容的核转染后细胞培养基(包括本公开内容的核转染后t细胞培养基)可包含在组织培养烧瓶或培养皿、g-rex烧瓶、生物反应器或细胞收获培养袋，或任何其它标准贮器中。本公开内容的核转染后细胞培养物(包括本公开内容的核转染后t细胞培养)可保持不动，或者，做为选择，它们也可以被搅动(例如震动、旋转或摇动)。

核转染后细胞培养物可包含基因-修饰细胞。核转染后t细胞培养物可包含基因-修饰的t细胞。本公开内容的基因修饰细胞可以静息一段特定的时间，也可以通过添加t细胞expander技术来刺激扩增。在某些实施方案中，本公开内容的基因修饰细胞可以或者静息一段特定的时间。或者立即刺激扩增，例如，加入一种t细胞expander技术。本公开内容的基因修饰细胞可以静息以允许它们有足够的时间适应，足够的时间发生易位，和/或积极或消极选择的时间，导致细胞具有更高的存活率，更高的核转染效率，效率核转染后更大的活力，理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增。本公开内容的基因修饰细胞可以静息，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，或更多个小时。在某些实施方案中，本公开内容的基因修饰细胞可以静息，例如过夜。在某些方面，过夜是约12小时。本公开内容的基因修饰细胞可以静息，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

本公开内容的基因修饰细胞可在加入expander技术之前，在核反应后选择。为了基因-修饰细胞的最佳选择，细胞可允许在核转染后细胞培养基中静息至少2-14天，以便于鉴定经修饰的细胞(如，修饰与非-修饰细胞的区别)。

在早至核转染后24-小时，本公开内容的car/cartyrin和选择标记的表达在本公开内容的转座子成功核转染后，可在修饰的t细胞中检测到。由于转座子在表染色体上的表达，单个选择标记的表达可能无法将修饰的t细胞(其中转座子已经成功地整合的那些细胞)与未修饰的t细胞(其中转座子未成功整合的那些细胞)区分开来。当转座子的表染色体表达模糊时，通过选择标记检测修饰细胞，核转染细胞(修饰和未修饰的细胞二者)可以静息一段时间(如2-14天)，以使细胞停止表达或丧失所有表染色体转座子表达。在这个标准静息期后，只有经修饰的t细胞才能保持选择标记的阳性表达。这个标准静息期的长度可针对每种核转染反应和选择过程进行优化。当通过选择标记检测修饰细胞，转座子的表染色体表达模糊时，选择可以在没有这个标准静息期的情况下执行，但是，可以在稍后的时间点包含额外的选择步骤(如或者在扩增阶段期间或者在扩增阶段之后)。

本公开内容的基因修饰细胞的选择可用任何方式执行。在本公开内容的方法的某些实施方案中，公开内容的基因修饰细胞的选择可通过分离细胞表达特定选择标记执行。本公开内容的选择标记可通过一个或多个转座子中的序列编码。本公开内容的选择标记可能是由于成功的易位(即转座子中的一个或多个序列未编码)而被修饰的细胞所表达的。在某些实施方案中，本公开内容的基因修饰细胞含有一种选择标记，其赋予核转染后细胞培养基对有害化合物的抗性。有害化合物可包含，例如，抗生素或药物，其在选择标记赋予修饰细胞的抗性缺乏时，会导致细胞死亡。示例性选择标记包括，但不限于野生型(wt)或一个或多个以下基因的突变形式：neo、dhfr、tyms、aldh、mdr1、mgmt、fancf、rad51c、gcs，和nkx2.2。示例性选择标记包括，但不限于，表面-表达的选择标记或表面-表达的标签可分别通过ab-包覆磁珠技术或柱的选择来靶向目标。可裂解的标签例如用于蛋白纯化的那些可加入到本公开内容的选择标记中，以便进行有效的柱选择、洗涤和洗脱。在某些实施方案中，本公开内容的选择标记并不由天然修饰的细胞(包括修饰的t细胞)表达，因此，可用于修饰细胞的物理分离(例如，通过细胞分选技术)。示例性本公开内容的选择标记并不由天然修饰的细胞(包括修饰的t细胞)表达，包括，但不限于全长、突变的，或截短形式的cd271、cd19、cd52、cd34、rqr8、cd22、cd20、cd33和其任何组合。

本公开内容的基因修饰细胞可在核转染反应后选择性扩增。在某些实施方案中，包含car/cartyrin的修饰的t细胞可通过car/cartyrin刺激而选择性地扩增。包含car/cartyrin的修饰的t细胞可通过接触目标覆盖的试剂来刺激(如肿瘤细胞系或正常细胞系，表达靶点或被靶点覆盖的扩张珠)。做为选择，包含car/cartyrin的修饰的t细胞可通过与辐照的肿瘤细胞、辐照的同种异体正常细胞、辐照的自体的pbmc接触来刺激。为尽量减少用于刺激的靶标-表达细胞对本公开内容的细胞产物成分的污染，例如，当细胞产物成分可以直接给予受试者时，可以用涂有car/cartyrin靶蛋白的扩张珠进行刺激。由car/cartyrin刺激的包含car/cartyrin的修饰t细胞的选择性扩增可经优化，以避免在功能上耗尽修饰的t-细胞。

本公开内容的选择的基因修饰细胞可经冷冻保藏，静息一段特定的时间，或通过加入细胞expander技术刺激扩增。本公开内容的选择的基因修饰细胞可经冷冻保藏，静息一段特定的时间，或即刻通过加入细胞expander技术刺激扩增。当选择的基因工程-修饰细胞是t细胞时，t细胞可通过加入t-细胞expander技术刺激扩增。选择的本公开内容的基因修饰细胞可静息，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，或更多个小时。在某些实施方案中，选择的本公开内容的基因修饰细胞可静息，例如过夜。在某些方面，过夜是约12小时，本公开内容的选择的基因修饰细胞可静息，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。本公开内容的选择的基因修饰细胞可静息任何时间段，导致具有更大活力、更高效率的核转染，核转染后表现出更大的活力，更理想的细胞表型，和/或在增加扩增技术后更大/更快的扩增的细胞。

选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的t细胞)可使用任何标准冷冻保存方法冷冻保藏，其可经优化以供贮存和/或以高回收率、活力、表型和/或功能能力回收人细胞。本公开内容的冷冻保存方法可包括市售可获得的冷冻保存介质和/或方案。

选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的t细胞)的易位效率可用任何方法评价。例如，在应用expander技术之前，由选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的t细胞)表达的转座子可通过荧光-激活的细胞分选(facs)测量。选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的t细胞)的易位效率的测定可包括测定选择的细胞表达转座子(如car)的百分率。做为选择，或者另外地，t细胞的纯度、平均荧光强度(mfi)、car(转座子传递)介导表达car配体的靶细胞脱颗粒和/或杀伤的能力，和/或选择的基因-修饰细胞(包括本公开内容的选择的基因-修饰的t细胞)的表型可用任何方法评价。

本公开内容的细胞产物成分可在符合某些释放标准的情况下被释放出来给予受试者。示例性释放标准可包括，但不限于，修饰、选择和/或扩增t细胞在细胞表面上表达car的可检测水平的特定百分率。

自体t细胞产物成分的基因修饰

本公开内容的基因-修饰细胞(包括基因-修饰的t细胞)可使用expander技术扩增。本公开内容expander水平技术可包含市售可获得的expander技术。本公开内容的示例性expander水平技术包括经由tcr刺激本公开内容的基因-修饰的t细胞。虽然刺激本公开内容的基因-修饰t细胞的所有方式都是被考虑的，经由tcr刺激本公开内容的基因-修饰的t细胞是优选的方法，产生具有较高杀伤力水平的产物。

为经由tcr刺激本公开内容的基因-修饰的t细胞，thermoexpanderdynabeads可以珠与t细胞3:1的比例使用。如果膨胀剂珠是不能生物降解的，则可将珠从膨胀剂组合物中除去。例如，在约5天后，珠可从膨胀剂组合物中除去。为经由tcr刺激本公开内容的基因-修饰的t细胞，可以使用miltenyit细胞激活扩增试剂(miltenyitcellactivation/expansionreagent)。为经由tcr刺激本公开内容的基因-修饰的t细胞，可以使用肝细胞水平技术的免疫培养人cd3/cd28或cd3/cd28/cd2t细胞激活剂试剂(stemcelltechnologies’immunoculthumancd3/cd28或cd3/cd28/cd2tcellactivatorreagent)。这个技术可能是优选的，因为可溶性四聚体抗体复合物会在一段时间后降解，而不需要将其从流程中移除。

人工抗原呈递细胞(apcs)可经改造以共同表达目标抗原并可被用来通过本公开内容的tcr和/或car刺激本公开内容的细胞或t-细胞。人工apcs可包含或可源自肿瘤细胞系(包括，例如，永生化髓系白血病细胞系k562)并可经改造以共同表达多个共刺激分子或技术(例如cd28、4-1bbl、cd64、mbil-21、mbil-15、car目标分子等)。当本公开内容的人工apcs与共刺激分子结合时，条件可经优化以防止发育或出现一种不理想的表型和功能能力，即终末分化的效应子t细胞。

辐照的pbmc(自体或同种异体)可表达一些目标抗原，如cd19，并可被用来通过本公开内容的tcr和/或car刺激本公开内容的细胞或t-细胞。可供选择地，或者另外地，辐照的肿瘤细胞可表达一些目标抗原并可被用来通过本公开内容的tcr和/或car刺激本公开内容的细胞或t-细胞。

板结合和/或可溶性抗-cd3、抗-cd2和/或抗-cd28刺激可被用来通过本公开内容的tcr和/或car刺激本公开内容的细胞或t-细胞。

抗原-涂布的珠可显示出目标蛋白并可被用来通过本公开内容的tcr和/或car刺激本公开内容的细胞或t-细胞。可供选择地，或者另外地，用car/cartyrin目标蛋白涂布的膨胀剂珠可被用来通过本公开内容的tcr和/或car刺激本公开内容的细胞或t-细胞。

通过tcr或car/cartyrin和经由表面-表达的cd2、cd3、cd28、4-1bb，和/或基因-修饰的t细胞上的其它标记刺激本公开内容的细胞或t-细胞的扩增方法。

扩增技术可在核转染后即刻直至核转染后大约24小时应用于本公开内容的细胞。虽然各种细胞培养基可在扩增程序期间使用，本公开内容的理想的t细胞扩增培养基可得到具有例如，更大活力、细胞表型、总扩增，或具有更大的体内持久性、植入性和/或car-介导的杀伤能力的细胞。本公开内容的细胞培养基可经优化以改进/提高本公开内容的基因-修饰细胞的扩增、表型，和功能。扩增t细胞的优选的表型可包括t干细胞记忆、t中枢和t效应记忆细胞的混合物。expanderdynabeads可主要产生中枢记忆t细胞，其可导致优越的临床表现。

本公开内容的示例性t细胞扩增培养基可能包括部分或全部pbs、hbss、optimem、dmem、rpmi1640、aim-v、x-vivo15、cellgrodc培养基(cellgrodcmedium)、ctsoptimizert细胞扩增(tcellexpansion)sfm、texmacs培养基(texmacsmedium)、prime-xvt细胞扩增培养基(prime-xvtcellexpansionmedium)、immunocult-xft细胞扩增培养基(immunocult-xftcellexpansionmedium)，或其任何组合。本公开内容的t细胞扩增培养基可进一步包括一种或多种补充因子。可包括在本公开内容的t细胞扩增培养基中的补充因子提高活力、细胞表型、总扩增，或增加体内持久性、植入性和/或car-介导的杀伤能力。可包括在本公开内容的t细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于重组人细胞因子、趋化因子，和/或白细胞介素例如il2、il7、il12、il15、il21、il1、il3、il4、il5、il6、il8、cxcl8、il9、il10、il11、il13、il14、il16、il17、il18、il19、il20、il22、il23、il25、il26、il27、il28、il29、il30、il31、il32、il33、il35、il36、gm-csf、ifn-γ、il-1α/il-1f1、il-1β/il-1f2、il-12p70、il-12/il-35p35、il-13、il-17/il-17a、il-17a/f异二聚体、il-17f、il-18/il-1f4、il-23、il-24、il-32、il-32β、il-32γ、il-33、lap(tgf-β1)、淋巴毒素-α/tnf-β、tgf-β、tnf-α、trance/tnfsf11/rankl，或其任何组合。可包括在本公开内容的t细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于盐、矿物质，和/或代谢物，例如hepes、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、l-谷氨酰胺、mem非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、fbs/fcs、人血清、血清替代品、抗生素、ph调节剂、厄尔氏盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、nucleofectorplus补充剂、kcl、mgcl2、na2hpo4、nah2po4、乳糖酸钠、甘露醇、丁二酸钠、氯化钠、cina、葡萄糖、ca(no3)2、tris/hcl、k2hpo4、kh2po4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、pop313、crown-5或其任何组合。可包括在本公开内容的t细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于细胞dna传感、代谢、分化、信号转导，和/或凋亡途径的抑制剂，例如tlr9、myd88、irak、traf6、traf3、irf-7、nf-kb、1型干扰素、促炎细胞因子、cgas、sting、sec5、tbk1、irf-3、rnapoliii、rig-1、ips-1、fadd、rip1、traf3、aim2、asc、半胱天冬酶1、pro-il1b、pi3k、akt、wnt3a的抑制剂，糖原合酶激酶-3β(gsk-3β)的抑制剂(如tws119)、bafilomycin、氯喹、奎纳克林、ac-yvad-cmk、z-vad-fmk、z-ietd-fmk，或其任何组合。

可包括在本公开内容的t细胞扩增培养基中的补充因子包括，但不限于以增强细胞传递，增强核传递或转运，促进核酸进入细胞核，促进表染色体核酸的降解，和/或降低dna-介导的毒性的方式修饰或稳定核酸的试剂，如ph调节剂、dna-结合蛋白、脂质、磷脂、capo4、capo4、带有或没有nls序列的净中性电荷dna结合肽、trex1酶，或其任何组合。

本公开内容的基因-修饰细胞可在扩增过程期间通过采用可选择的药物或化合物来选择。例如，在某些实施方案中，当本公开内容的转座子可编码选择赋予基因-修饰细胞对添加到培养基的药物的耐药性，选择可发生在扩增过程期间并可能需要大约1-14天的培养才能进行选择。可用作由本公开内容的转座子编码的选择标记的耐药基因实例，包括，但不限于野生型(wt)或突变形式的基因neo、dhfr、tyms、aldh、mdr1、mgmt、fancf、rad51c、gcs、nkx2.2，或其任何组合。可添加到选择标记可赋予抗性的培养基中的相应的药物或化合物实例包括，但不限于g418、嘌呤霉素、氨苄西林、卡那霉素、甲氨蝶呤、美法仑、替莫唑胺、长春新碱、依托泊苷、多柔比星、苯达莫司汀、氟达拉滨、aredia(帕米膦酸二钠)、becenum(卡莫司汀)、bicnu(卡莫司汀)、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、carmubris(卡莫司汀),卡莫司汀、clafen(环磷酰胺)、环磷酰胺、cytoxan(环磷酰胺)、达雷木单抗、darzalex(达雷木单抗)、doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星脂质体、dox-sl(盐酸多柔比星脂质体)、lotuzumab、empliciti(埃罗妥珠单抗(elotuzumab))、evacet(盐酸多柔比星脂质体)、farydak(帕比司他(panobinostat))、伊沙佐米(ixazomib)柠檬酸盐、kyprolis(卡非佐米)、来那度胺、lipodox(盐酸多柔比星脂质体)、mozobil(普乐沙福(plerixafor))、neosar(环磷酰胺)、ninlaro(伊沙佐米柠檬酸盐)、帕米膦酸二钠、帕比司他(panobinostat)、普乐沙福(plerixafor)、泊马度胺(pomalidomide)/pomalyst(泊马度胺)、revlimid(来那度胺)、synovir(沙利度胺)、沙利度胺、thalomid(沙利度胺)、velcade(硼替佐米)、唑来膦酸(zoledronicacid)、zometa(唑来膦酸)，或其任何组合。

本公开内容的t-细胞扩增过程可发生在wave生物反应器、g-rex烧瓶，或在任何其它合适的容器和/或反应器中的细胞培养袋中。

本公开内容的细胞或t-细胞培养可保持稳定、摇动、旋转或震动。

本公开内容的细胞或t-细胞扩增过程可优化某些条件，包括但不限于培养持续时间、细胞浓度、t细胞培养基添加/除去的程序、细胞大小、总细胞数、细胞表型、细胞群的纯度、生长中的细胞群的基因-修饰细胞的百分率、补充剂的使用和组成、expander水平技术的添加/除去，或其任何组合。

本公开内容的细胞或t-细胞扩增过程可继续直至预先定义的端点，然后配制生成的扩增细胞群。例如，本公开内容的细胞或t-细胞扩增过程可继续预定量的时间：至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周；至少1、2、3、4、5、6月，或至少1年。本公开内容的细胞或t-细胞扩增过程可继续直至生成的培养达到预定的总细胞密度：1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010细胞每体积(μl、ml、l)或之间的任何密度。本公开内容的细胞或t-细胞扩增过程可继续直至生成的培养基因-修饰细胞显示出本公开内容的转座子的预定水平的表达：1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或100%或之间的任何百分比的阈值水平的表达(最小、最大或平均水平的表达表明生成的基因-修饰细胞是临床上-有效的)。本公开内容的细胞或t-细胞扩增过程可继续直至生成的培养物基因-修饰细胞的比例与未修饰的细胞的比例达到预定阈值：至少1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、2:1、4:1、5:1、6:1,7:1、8:1、9:110:1或之间的任何比例。

基因-修饰的自体t细胞释放的分析

基因-修饰细胞的百分率可在本公开内容的扩增过程期间或之后评价。本公开内容的基因-修饰细胞的转座子细胞表达可通过荧光-激活的细胞分选(facs)测量。例如，facs可被用来测定本公开内容的表达car的细胞或t细胞的百分率。做为选择，或者另外地，可评价基因-修饰细胞或t细胞的纯度，由本公开内容的基因-修饰细胞或t细胞表达的car的平均荧光强度(mfi)，car介导表达car配体的靶细胞脱颗粒和/或杀伤的能力，和/或car+t细胞的表型。

计划给予受试者的本公开内容的组合物可被要求满足一个或多个“释放标准”，这些标准表明对于配制为药品和/或给予受试者而言，所述组合物是安全和有效的。释放标准可包括这样的要求，即一种本公开内容的组合物(如本公开内容的t-细胞产物)包含特定百分率的在其细胞表面上表达可检测水平的、本公开内容的car的t细胞。

扩增过程应继续直至特定标准已得到满足(如获得一定数量的细胞，实现特定数量的记忆细胞，达到特定规模的种群)。

扩增过程应在某些标准信号点结束。例如，细胞一旦达到300fl(否则，超过这个阈值大小的细胞可能会开始死亡)的大小，就应该被配方、重新激活或冷冻保存细胞。当细胞群达到300fl以下的平均细胞大小时，立即冷冻保存，解冻和培养后可获得更好的细胞回收，因为细胞在冷冻保存前还没有达到完全静止状态(完全静止的大小大约是180fl)。扩增前，本公开内容的t细胞可具有约180fl的细胞大小，但在扩张后3天，它们的细胞大小可能会翻两番，达到大约900fl。在接下来的6至12天内，t细胞的数量将缓慢减少到180fl时的完全静止状态时的细胞大小。

一种制备用于制剂的细胞群的方法可包括，但不限于浓集细胞群细胞，洗涤细胞，和/或经由针对特定表面-表达的标记的耐药或磁珠分选进一步选择细胞的步骤。一种制备用于制剂的细胞群的方法还可以包括分选步骤，以确保最终产品的安全性和纯度。例如，如果来自患者的肿瘤细胞已被用于刺激本公开内容的基因-修饰的t-细胞或已被基因改造，以刺激正在准备配制的本公开内容的基因-修饰t-细胞，重要的是，患者的肿瘤细胞不包括在最终产品中。

细胞产物输注和/或冷冻保存以供输注

本公开内容的药物制剂可分装成袋，用于输液、冷冻保存和/或储存。

本公开内容的药物制剂可使用标准方案冷冻保藏，且任选地，用不熔的冷冻保存介质。例如，无dmso的低温保存剂(如cryosofree™无dmso冷冻保存介质)可被用来减少冷冻-相关的毒性。冷冻保藏的本公开内容的药物制剂可能会在稍后的日期储存以供注入患者。有效的治疗可需要多次给予本公开内容的药物制剂，因此，药物制剂可以用预先等分部分的“剂量”包装，这些“剂量”可以被冷冻储存，但可以分开用于单个剂量的解冻。

本公开内容的药物制剂可在室温下储存。有效的治疗可需要多次给予本公开内容的药物制剂，且因此，药物制剂可以用预先等分部分的“剂量”包装，这些“剂量”可以被储存在一起，但分开用于单个剂量的解冻。

本公开内容的药物制剂可封存，以便随后重新扩增和/或选择以供在同种异体治疗的情况下为相同患者产生额外剂量，该患者可能需要在以后的某一天进行治疗，例如，病情的缓解和复发。

制剂

如上所述，本公开内容提供稳定的制剂，其优选地包含含盐水或选择盐的磷酸盐缓冲液，以及保存的溶液和含有防腐剂和多用途保藏制剂的制剂，其适用于医药或兽医用途，包含在药学上可接受的制剂中的至少有一个蛋白支架。保存的制剂含有至少一个已知的防腐剂或任选地选自在水性稀释剂中的苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(如，六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、聚合物或其混合物的至少一种。可如本领域已知的使用任何合适的浓度或混合物，如约0.0015%，或任何范围、值，或其中的部分。非-限制性实例包括，除防腐剂外，约0.1-2%间-甲酚(如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%)、约0.1-3%苄醇(如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、约0.001-0.5%硫柳汞(如，0.005、0.01)、约0.001-2.0%苯酚(如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005-1.0%对羟基苯甲酸烷基酯(如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)等。

如上所述，本发明提供一种制造物品，包括包装材料和至少一个小瓶，小瓶包含含有规定的缓冲液和/或防腐剂的至少一个蛋白支架的溶液，任选在水性稀释剂中，其中所述包装材料包含指示这样的溶液可保持1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长的时期的标签。本发明进一步包含一种制造物品，其包含包装材料、包含冻干的至少一个蛋白支架的第一个小瓶，和第二个小瓶包含规定的缓冲剂或防腐剂的水性稀释剂，其中所述包装材料包含一个标签，该标签指示患者在水性稀释剂中重新构成至少一个蛋白支架，以形成可在24小时或更长时间内保持的溶液。

根据本发明所用的至少一个蛋白支架可通过重组方法，包括从哺乳动物细胞或转基因制剂产生，或可从其他生物源中提纯，如本文所述或本领域所知的。

在本发明的产物中至少一个蛋白支架的范围包括在重新构成时产生的量，如果是在湿/干系统中，则浓度是从约1.0μg/ml至约1000mg/ml，尽管较低和更高的浓度是可操作的，并且取决于预定的递送介质，例如溶液制剂将不同于透皮贴片，肺，经粘膜，或渗透或微泵方法。

优选地，水性稀释剂任选地进一步包含药学上可接受的防腐剂。优选的防腐剂包括从苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯。丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物组成的一组选择的那些。用于制剂的防腐剂的浓度是足以产生抗-微生物效应的浓度。这样的浓度取决于所选择的防腐剂并很容易由熟练的技术人员决定。

其它赋形剂，例如，等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂，和防腐增强剂可任选地和优选地添加到稀释剂中。等渗剂，如甘油，通常以已知的浓度使用。优选加入生理上耐受的缓冲液，以提供改进的ph控制。制剂可覆盖广泛范围的phs，如从约ph4-约ph10，优选从约ph5至约ph9的范围，且最优选从约6.0-约8.0的范围。优选地，本发明的制剂具有在约6.8和约7.8之间的ph。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最优选磷酸钠，特别是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。

其它添加剂，例如药学上可接受的增溶剂如tween20(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)、tween40(聚氧乙烯(20)脱水山梨醇单棕酸酯),tween80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、普朗尼克f68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)，和peg(聚乙二醇)或非-离子表面活性剂，如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188、普朗尼克®多元醇、其它嵌段共聚物，和螯合剂，如edta和egta，可任选地添加到制剂或组合物中以减少聚集。这些添加剂是特别有用的，如果使用泵或塑料容器给予制剂的话。药学上可接受的表面活性剂的存在减轻蛋白聚集的倾向。

本发明的制剂可通过这样的方法制备，其包括将至少一个蛋白支架与选自苯酚、间-甲酚、对-甲酚、邻-甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯。丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、聚合物或其混合物的防腐剂在水性稀释剂中混合。在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架和防腐剂使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的制剂，例如，在缓冲溶液中至少有一个蛋白支架的测量的量与缓冲溶液中足以提供所需浓度的蛋白和防腐剂的量合并在一起。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如，组分加入的次序，是否使用额外的添加剂，制备制剂的温度和ph，都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。

要求的制剂可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者，包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架，所述支架用第二瓶中含有的水、防腐剂和/或赋形剂(最好是磷酸盐缓冲液和/或盐水以及选定的盐)在水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者疗法，从而可以提供比目前获得的更方便的治疗方案。

目前要求的制造物品可用于在当即到24小时或更长的时间范围内给药。因此，目前要求的制造物品给患者提供显著的优点。本发明的制剂可任选地在从约2℃至约40℃的温度下安全地储存并长时间保持蛋白的生物活性，因此，允许使用一个包装标签，该标签指示该溶液可以在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长的一段时间内持有和/或使用。如果使用保存的稀释剂，这样的标记可使用至多1-12个月、半年、1年半，和/或两年。

本发明的至少一个蛋白支架的溶液可通过包括在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架的方法制备。混合使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的稀释剂，例如，至少一个蛋白支架在水或缓冲剂中测量的量与足以提供所需浓度蛋白和任选的防腐剂或缓冲剂的量合并。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如，组分加入的次序，是否使用额外的添加剂，制备制剂的温度和ph，都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。

要求的产物可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者，包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架，所述支架用第二瓶中含有的水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者疗法，从而可以提供比目前获得的更方便的治疗方案。

要求的产物可通过向药房、诊所或其他此类机构和设施提供澄清的溶液或双瓶而间接提供给患者，所述双瓶包括一小瓶冻干的至少一个蛋白支架，其用第二瓶中含有的水性稀释剂中重新构成。在这种情况下的澄清溶液可以达到一升或甚至更大的大小，提供一个大储藏室，从中至少一个蛋白支架溶液的较小部分可被回收一次或多次以供转移到较小的小瓶中并由药房或诊所提供给其顾客和/或患者。

包含单瓶系统的识别装置包括用于输送溶液的笔式喷射器装置，如bdpens、bdautojector®、humaject®、novopen®、b-d®pen、autopen®，和optipen®、genotropinpen®、genotronormpen®、humatropen®、reco-pen®、roferonpen®、biojector®、iject®、j-tipneedle-freeinjector®、intraject®、medi-ject®，例如，如由bectondickinson(franklinlakes,n.j.,www.bectondickenson.com),disetronic(burgdorf,switzerland,www.disetronic.com;bioject,portland,oreg.(www.bioject.com)；nationalmedicalproducts,westonmedical(peterborough,uk,www.weston-medical.com)、medi-jectcorp(minneapolis,minn.,www.mediject.com)制造或开发的，及类似的合适装置。包含双瓶系统的识别装置包括那些用于在药盒中重新构成冻干药物以供递送已重构的溶液的笔式喷射器系统，如humatropen®。其它合适的装置的实例包括预填充注射器、自动注射器、无针注射器和无针静脉输液器。

目前要求的产物包括包装材料。包装材料除提供监管机构要求的信息外，还提供产品使用的条件。本发明的包装材料提供给患者操作的指示，在水性稀释剂中重新构成至少一个蛋白支架，以形成溶液并在2-24小时或更长的时间内使用该溶液，用于两瓶(湿/干)产品。对于单瓶溶液产品，标签指明这种溶液可以在2-24小时或更长的时间内使用。目前要求的产品对于人类药品的使用是有用的。

本发明的制剂可通过这样的方法制备，其包括混合至少一个蛋白支架和选择的缓冲剂，优选地，磷酸盐缓冲剂含有盐水或选择的盐。在水性稀释剂中混合至少一个蛋白支架和缓冲剂使用传统的溶解和混合程序进行。为制备合适的制剂，例如，使至少一个蛋白支架在水或缓冲剂中测量的量与足以提供所需浓度的蛋白和缓冲剂的所需缓冲剂在水中的量合并。这一过程的变化将为本领域普通技术人员所认知。例如，组分加入的次序，是否使用额外的添加剂，制备制剂的温度和ph，都是可以优化使用的浓度和给药方式的因素。

要求的稳定或保存的制剂可作为澄清的溶液或作为双瓶提供给患者，包括一小瓶冻干的蛋白支架，所述支架用第二瓶中含有的防腐剂和赋形剂在水性稀释剂中重新构成。需要重新构成的单一溶液小瓶或双瓶可多次重复使用并可以满足一个或多个周期的患者疗法，从而可以提供比目前获得的更方便的治疗方案。

稳定蛋白支架的其它制剂或方法可导致包含蛋白支架的冻干粉末的澄清溶液以外的其他制剂。在非澄清的溶液中有含有微粒悬浮液的制剂，所述微粒是一种组合物，其含有可变尺寸的结构和各种被称为微球、微粒、纳米颗粒、纳米球或脂质体的蛋白支架。这样的相对均一的，基本上是球形的含有活性物质的微粒制剂可通过使含有活化剂和聚合物的水相和非水相接触，接着使非水相蒸发，导致水相中粒子的聚结而形成，如在美国专利号4,589,330中讲述的。多孔微粒可使用含有活化剂的第一相和分散在连续溶剂中的聚合物并用冷冻干燥或稀释萃取沉淀从悬浮液中除去所述溶剂来制备，如在美国专利号4,818,542中讲述的。用于此类制剂的优选的聚合物是选自以下的天然或合成共聚物或聚合物：明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原蛋白、聚羟基乙酸、聚乳酸、乙交酯-l(-)丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-co-乳酸)、聚(ε-己内酯-co-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚环氧乙烷、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羟基乙基dl-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(l-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-六亚甲基二异氰酸酯)和聚(甲基甲基丙烯酸酯)。特别优选的聚合物是聚酯，如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-l(-)丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-co-乳酸)，和聚(ε-己内酯-co-乙醇酸。可用于溶解聚合物和/或活性剂的溶剂包括：水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、正己烷、苯，或六氟丙酮倍半水合物。用第二相分散含活性剂相的过程可包括压力迫使所述的第一相通过喷嘴中的孔来影响液滴的形成。

干粉制剂可从冻干以外的过程产生，例如通过喷雾干燥或溶剂萃取，通过蒸发或沉淀结晶成分，然后采取一个或多个步骤去除水性或非水性溶剂。喷雾干燥蛋白支架制剂的制备在美国专利号6,019,968中讲述。蛋白支架基干粉组合物可在提供一种可吸入的干粉的条件下，通过喷雾干燥蛋白支架的溶液或浆液以及任选的在溶剂中的赋形剂来制备。溶剂可包括极性化合物，如水和乙醇，它们可容易被干燥。蛋白支架稳定性可在没有氧气的情况下(例如在氮气覆盖下)执行喷雾干燥程序或通过使用氮气作为干燥气体来增强。另一个相对干燥的制剂是分散在通常包含氢氟烷烃推进剂的悬浮介质中的多个穿孔微结构的分散体，如在wo9916419中讲述的。使用计量吸入器，可将稳定的分散剂应用于患者的肺部。可用于喷雾干燥药物工业生产的设备由buchiltd.或nirocorp.制造。

至少一个蛋白支架在本文所述的稳定或保存的制剂或溶液中，可根据本发明，经由各种递送方法给予患者，包括sc或im注射；透皮，肺，经粘膜，植入物，渗透泵，药盒，微型泵，或技术人员认可的其他方法。如本领域熟知的。

治疗应用

本发明也提供一种使用至少一个本发明的蛋白支架在细胞、组织、器官、动物，或患者中调节或治疗疾病的方法，如本领域已知的或如在此描述的，例如用治疗有效量的蛋白支架给予或接触细胞、组织、器官、动物，或患者。本发明也提供一种在细胞、组织、器官、动物，或患者中调节或治疗疾病(包括，但不限于恶性疾病)的方法。

本发明也提供一种在细胞、组织、器官、动物或患者中调节或治疗至少一种恶性疾病的方法，包括，但不限于至少一种以下的疾病：白血病、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(all)、急性淋巴细胞白血病、b-细胞、t-细胞或faball、急性髓性白血病(aml)、急性骨髓性白血病，慢性髓细胞性白血病(cml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、毛细胞白血病，骨髓增生异常综合征(mds)、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤，卡波济氏肉瘤，结肠直肠癌，胰腺癌、鼻咽癌，恶性组织细胞增生症，副肿瘤综合征/恶性肿瘤高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、头癌、颈部癌、遗传性非息肉病癌、何杰金氏淋巴瘤、肝癌、肺癌，非小细胞肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，肾细胞癌，睾丸癌、腺癌，肉瘤，恶性黑色素瘤，血管瘤，转移性疾病，癌症相关骨吸收，癌症相关骨痛等。

本发明的任何方法可包括将包含至少一个蛋白支架的有效量的组合物或药物组合物给予需要这样的调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这样一种方法可任选地进一步包括共同给药或组合疗法以供治疗这样的疾病或障碍，其中所述至少一个蛋白支架、特定的部分或其变体的给予，进一步包括之前、同时和/或之后给予至少一种选自烷化剂、有丝分裂抑制剂，和放射性药物中的至少一种。合适的剂量是本领域熟知的。见例如，wellsetal.,eds.,药物治疗手册(pharmacotherapyhandbook),第二版,appleton和lange,stamford,conn.(2000);pdrpharmacopoeia,tarasconpocketpharmacopoeia2000,deluxeedition,tarasconpublishing,lomalinda,calif.(2000);nursing2001药物手册(handbookofdrugs),21st版,springhousecorp.,springhouse,pa.,2001;卫生专业药物指南(healthprofessional’sdrugguide)2001,ed.,shannon,wilson,stang,prentice-hall,inc,uppersaddleriver,n.j.，其中的各个参考文献通过引用全部并入本文。

优选的剂量可任选地包括约0.1-99和/或100-500mg/kg/给予，或任何范围、值或其分数，或达到约0.1-5000μg/ml血清浓度每单次或多次给予的血清浓度，或任何范围、值或其分数。对于本发明的蛋白支架的优选剂量范围是从约1mg/kg，至多约3、约6或约12mg/kg患者体重。

做为选择，给予的剂量可能会有所不同，这取决于已知的因素，如特定药物的药效学特征及其给药方式和给药途径；的年龄、健康和体重；症状的性质和程度，合并治疗的种类，治疗的频率和期望的效果。通常活性成分的剂量可以是约0.1-100毫克每千克体重。普通地，0.1-50，和优选0.1-10毫克每千克每次给予或缓慢释放的形式对获得期望的结果是有效的。

作为一个非限制性实例，人或动物的治疗可作为至少一个本发明的蛋白支架的1次或定期剂量提供，每天约0.1-100mg/kg或任何范围、值或其分数，在第1-40天中至少有一天，或者，做为选择或此外，在第1-52周中至少有一天，或者做为选择或此外，1-20年中至少有一天，或其任何组合，使用单次、输注或重复剂量。

适合于内部给予的剂型(组合物)通常每单位或容器含有从约0.001毫克至约500毫克活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将普通地以基于组合物总重量约0.5-99.999%重量的量存在。

对于胃肠外给予，蛋白支架可配制为溶液、悬浮液、乳剂、颗粒、粉末或冻干粉，与药学上可接受的胃肠外媒介组合，或单独提供。这样的媒介的实例有水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液，和约1-10%人血清白蛋白。脂质体和非水媒介，如固定油，也可以使用。媒介或冻干粉末可含有保持等渗性(如，氯化钠、甘露醇)和化学稳定性(如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。制剂用已知的或合适的技术灭菌。

合适的药物载体被描述于最新版本的remington’s药物科学(remington’spharmaceuticalsciences),a.osol，一本本领域的标准参考书。

可供选择的给药

依据本发明可采用许多已知的和已开发的模式给予药物有效量的至少一个依据本发明的蛋白支架。虽然在下面的描述中使用了肺给药，根据本发明，可以使用其他给予方式，并取得适当的效果。本发明的蛋白支架可在载体中递送，作为溶液、乳液、胶体或悬浮液，使用在此描述的或本领域已知的各种适合吸入或其他方式给药的装置和方法的任何一种。

胃肠外制剂和给药

对于胃肠外给予的制剂可含有作为普通赋形剂的无菌水或盐水、聚烷二醇，如聚乙二醇、植物油、氢化萘等。用于注射的水性或油性悬浮液可根据已知的方法，使用适当的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备。用于注射的试剂可以是无毒的、非口服的稀释剂，如水溶液、无菌注射液或在溶剂中的悬浮液。作为合适的介质或溶剂，水、林格氏溶液、等渗盐水等是允许的；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可使用无菌的非挥发油。为了这些目的，可以使用任何种类的非挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成单-或二-或三-甘油酯。胃肠外给予是本领域已知的并包括，但不限于传统的注射方式，一种如在美国专利号5,851,198中描述的气体加压无针注射装置，和如在美国专利号5,839,446中描述的激光射孔器装置，通过引用全部并入本文。

可供选择的递送

本发明进一步涉及通过胃肠外、皮下、肌肉、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、囊内、软骨内、腔内、体腔颈内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内，胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹腔内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内，肾内、视网膜内、椎管内、滑膜腔内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、团状、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径给予至少一个蛋白支架。至少一个蛋白支架组合物可被制备用于胃肠外(皮下、肌肉或静脉)或任何其他给药方式，特别是以液体溶液或悬浮液的形式；用于阴道或直肠给予方式，特别是以半固体的形式，例如，但不限于乳膏和栓剂；用于口腔或舌下给药，例如，但不限于片剂或胶囊的形式；或鼻内，例如，但不限于粉末、滴鼻剂、喷雾剂或某些制剂的形式；或经皮，如不限于凝胶、软膏、洗剂、悬浮液或具有化学促进剂例如二甲亚砜以或者改变皮肤结构或者增加透皮贴剂的药物浓度的贴剂递送系统(junginger,etal.in“药物渗透增强(drugpermeationenhancement)”;hsieh,d.s.,eds.,pp.59-90(marceldekker,inc.newyork1994，通过引用全部并入本文)，或使用氧化剂，其能使含有蛋白和肽的制剂应用在皮肤上(wo98/53847)，或应用电场以建立瞬态传输路径，如电穿孔，或增加带电药物通过皮肤的移动性，如离子导入，或超声波的应用，如声纳电泳(美国专利号4,309,989和4,767,402)(以上出版物和通过引用全部并入本文)。

肺/鼻给予

对于肺给药，优选地，至少一个蛋白支架组合物以颗粒大小递送到达肺或鼻窦的下气道是有效的。依据本发明，至少一个蛋白支架可由本领域已知的任何一种吸入或鼻腔装置递送，用于吸入治疗剂。能够在患者的窦腔或肺泡内沉积雾化的制剂的这些装置包括计量剂量吸入器，雾化器，干粉发生器，喷雾器等。其他适用于指引蛋白支架的肺或鼻给药的装置也是本领域已知的。所有这样的装置可使用适用于给予在气溶胶中分布蛋白支架的制剂。这样的气溶胶可包含或者溶液(水性和非水性两种溶液)或者固体颗粒。

计量剂量吸入器如ventolin计量剂量吸入器，通常使用推进剂气体，在吸气时需要驱动(见例如，wo94/16970,wo98/35888)。干粉吸入器像turbuhaler™(astra)、rotahaler®(glaxo)、diskus®(glaxo)、spiros™吸入器(dura)，由inhaletherapeutics销售的装置，和sp吸入器®粉末吸入器(fisons)，使用混合粉末的呼吸驱动(美国专利号4,668,218astra、ep237507astra、wo97/25086glaxo、wo94/08552dura、美国专利号5,458,135inhale、wo94/06498fisons，通过引用全部并入本文)。喷雾器像aerx™aradigm，ultravent®喷雾器(mallinckrodt)，和acornii®喷雾器(marquestmedicalproducts)(美国专利号5,404,871aradigm，wo97/22376)，以上参考文献通过引用并入本文，从溶液产生气溶胶，而计量剂量吸入器、干粉吸入器等生成小颗粒气溶胶。这些商业上可获得的吸入装置的具体例子旨在代表适合于本发明实践的特定装置，且并不是为了限制本发明的范围。

优选地，包含至少一个蛋白支架的组合物通过干粉吸入器或喷雾器递送。吸入装置有几个理想的特性，用于给予至少一个本发明的蛋白支架。例如，吸入装置的递药可靠，重复性好，准确性高。为了良好的呼吸适合性，吸入装置可任选地递送小干燥颗粒，例如少于约10μm，优选约1-5μm。

给予作为喷雾剂的蛋白支架组合物

包含蛋白支架组合物的喷雾剂可通过在压力下强制至少一种蛋白支架的悬浮液或溶液通过喷嘴而产生。可以选择喷嘴的尺寸和结构、施加的压力和液体进给率来达到预期的输出和粒度。例如，电喷雾可以通过与毛细管或喷嘴进料有关的电场产生。有利地，由喷雾器递送的至少一个蛋白支架组合物的颗粒具有少于约10μm，优选在约1μm至约5μm，且最优选约2μm至约3μm的范围内的粒度。

适用于喷雾器的至少一个蛋白支架组合物的制剂通常包括蛋白支架组合物的水溶液，其浓度为约0.1mg至约100mg的至少一个蛋白支架组合物每ml溶液或mg/gm，或其中的任何范围、值，或分数。制剂可包括试剂，例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，且优选锌。制剂也可包括赋形剂或用于稳定蛋白支架组合物的试剂，例如缓冲剂、还原剂、大体积蛋白，或是碳水化合物。可用于配制蛋白支架组合物的散装蛋白包括白蛋白、精蛋白等。可用于配制蛋白支架组合物的典型碳水化合物包括蔗糖，甘露醇，乳糖，海藻糖，葡萄糖等。蛋白支架组合物制剂也可包括表面活性剂，其可减少或防止在形成气溶胶中溶液雾化引起的蛋白支架组合物表面诱导的聚集。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。所述量通常介于制剂的0.001和14%重量之间的范围内。为了本发明目的，特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领域已知的用于配制蛋白，如蛋白支架，或特定的部分或变体的另外的试剂也可包括在制剂中。

用喷雾器给予蛋白支架组合物

本发明的蛋白支架组合物可通过喷雾器给予，如喷射雾化器或超声波雾化器。通常地，在喷射雾化器中，压缩空气源被用来制造高速空气射流通过孔板。当气体在喷嘴外膨胀时，产生低压区，这迫使蛋白支架组合物的溶液通过连接到贮液器的毛细管被抽出。从毛细管流出的液体流被剪切成不稳定的细丝和液滴，当它离开管时，产生气溶胶。可以使用一系列的配置、流速和挡板类型来实现给定的喷射雾化器所需的性能特性。在超声波雾化器中，高频电能被用来产生振动，机械能，典型使用压电换能器。这种能量被直接或通过耦合流体传递到蛋白支架组合物的制剂中，创建包含蛋白支架组合物的气溶胶。有利地，由雾化器递送的蛋白支架组合物的颗粒具有少于约10μm，优选约1μm至约5μm，且最优选约2μm至约3μm的范围内的粒度。

适用于雾化器，无论是喷射雾化器还是超声波雾化器的至少一个蛋白支架的制剂，通常包括浓度约0.1mg至约100mg的至少一个蛋白支架每ml溶液。制剂可包括试剂，例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，且优选锌。制剂也可包含赋形剂或稳定至少一个蛋白支架组合物的试剂，例如缓冲剂、还原剂、散装蛋白，或碳水化合物。可用于配制至少一个蛋白支架组合物的散装蛋白包括白蛋白、精蛋白等。可用于配制至少一个蛋白支架的典型的碳水化合物包含蔗糖，甘露醇，乳糖，海藻糖，葡萄糖等。至少一个蛋白支架制剂也可包括表面活性剂，其可减少或防止在形成气溶胶中溶液雾化引起的至少一个蛋白支架表面诱导的聚集。可使用各种常规表面活性剂，如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。所述量通常介于制剂的0.001和4%重量之间的范围内。为了本发明目的，特别优选的表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。本领域已知的用于配制蛋白，如蛋白支架的另外的试剂也可包括在制剂中。

用计量剂量吸入器给予蛋白支架组合物

在计量剂量吸入器(mdi)中，推进剂、至少一个蛋白支架，和任何赋形剂或其它添加剂作为一种混合物包含在罐内，其中包含液化压缩气体。计量阀的驱动作用将混合物释放为气溶胶，优选地含有在少于约10μm，优选约1μm至约5μm，且最优选约2μm至约3μm的大小范围内的颗粒。所需的气溶胶粒度可通过使用蛋白支架组合物的制剂而获得，由本领域技术人员已知的各种方法，包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点凝结等产生。优选的计量剂量吸入器包括由3m或glaxo制造的那些并使用氢氟碳化合物推进剂。用于计量剂量装置吸入器的至少一种蛋白支架的制剂将一般包含细分散粉末，其含有至少一个蛋白支架作为在非-水性培养基中的悬浮液，例如，在表面活性剂的帮助下悬浮在推进剂中。推进剂可以是用于此目的的任何常规材料，如氯氟烃、氢氯氟烃、氟烃，或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1,1,1,2-四氟乙烷、hfa-134a(氢氟烷烃-134a)、hfa-227(氢氟烷烃-227)等。优选地，推进剂是氟烃。可选择表面活性剂以稳定至少一个蛋白支架作为在推进剂中的悬浮液，保护活性剂免受化学降解等。合适的表面活性剂包含脱水山梨醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。在一些情况下，溶液气溶胶优先使用溶剂，如乙醇。用于蛋白制剂的本领域已知的另外的试剂也可包括在制剂内。本领域普通技术人员将认识到，本发明的方法可经由此处未描述的装置，将至少一个蛋白支架组合物经肺给予实现。

口服制剂和给药

用于口服给予的制剂依赖于共同给予辅助剂(如，间苯二酚和非离子表面活性剂，如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)，以人为地增加肠壁的通透性，以及酶抑制剂的共同给予(如，胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(dff)和抑肽酶)以抑制酶降解。用于递送亲水剂的制剂，包括蛋白和蛋白支架以及至少两种表面活性剂的组合，打算用于口腔、粘膜、鼻腔肺、阴道跨膜，或直肠给予，讲述于美国专利号6,309,663中。口服用固体剂型的活性成分化合物可与至少一种添加剂混合，包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物，和甘油。这些剂型也可含有其它类型的添加剂，例如，非活性稀释剂、润滑剂、如硬脂酸镁、对羟基本甲酸酯、保水剂，如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚，抗氧化剂，如半胱氨酸，崩解剂，粘合剂，增稠剂，缓冲剂，甜味剂，调味剂，香料。

片剂和丸剂可被进一步加工成包肠衣的制剂。用于口服给予的液体制剂包括乳剂、糖浆、酏剂、悬浮液和考虑到医学应用的溶液制剂。这些制剂可以含有通常用于上述领域的不活跃稀释剂，例如水。脂质体也被描述为胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物微球已被用于递送药物(美国专利号4,925,673)。此外，在美国专利号5,879,681和美国专利号5,871,753中描述的并用来口服递送生物活性剂的载体化合物是本领域已知的。

粘膜制剂和给药

用于口服包封在一种或多种生物相容性聚合物或共聚物赋形剂(优选可生物降解的聚合物或共聚物)中的生物活性剂，由于所合成的微胶囊的适当尺寸而提供的微胶囊，导致药物到达并被毛囊淋巴聚集物吸收，也称为动物的“集合淋巴小结(peyer'spatch)”或“galt”，而不会因药物通过胃肠道而失效。类似的毛囊淋巴聚集物可在支气管(balt)和大肠中被发现。上述组织一般称为粘膜相关淋巴网组织(malt)。为了通过粘膜表面吸收，给予至少一个蛋白支架的组合物和方法包括由多个亚微米粒子、粘液粘附大分子、生物活性肽和水连续相组成的乳液，其通过实现乳化液颗粒的粘结作用，促进通过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适用于本发明的乳剂应用的粘液表面可包括角膜、结膜、口、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给药途径。用于阴道或直肠给予的制剂，例如，栓剂，可含有赋形剂，例如聚烷二醇、凡士林、可可脂等。鼻内给予的制剂可以是固体并含有赋形剂，例如，乳糖或可以是水或含油的滴鼻液。对于粘膜给药，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸、预凝胶化淀粉等(美国专利号5,849,695)。

透皮制剂和给予

对于透皮给药，至少一个蛋白支架被封装在递送装置中，如脂质体或聚合物纳米粒子、微粒、微胶囊或微球(统称为微粒，除非另有说明)。许多合适的装置是已知的，包括由合成聚合物组成的微粒，如聚羟基酸，如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物，聚原酸酯、多元酸酐、聚磷腈(polyphosphazenes)和天然聚合物，如胶原蛋白、聚氨基酸、白蛋白和其它蛋白、藻酸盐和其它聚糖，及其组合(美国专利号5,814,599)。

长期给药和制剂

将本发明的化合物在延长的时间段递送至受试者可能是可取的，例如，为期一周至一年的单次给药。可使用各种缓释剂、贮库或植入物剂型。例如，剂型可含有药学上可接受的化合物的非-毒性盐，其在体液中的溶解度低，例如(a)与多元酸，如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、扑酸、藻酸，聚谷氨酸，萘单或二磺酸，聚半乳糖醛酸等所成的酸加成盐；(b)与多价金属阳离子，如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或与从如，n,n′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子所成的盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如，单宁酸锌盐。此外，本发明的化合物，或者最好是一种相对不溶的盐，如刚才所述的盐，可在凝胶中配制，例如单硬脂酸铝凝胶，配以芝麻油，适合注射用。特别优选的盐是锌盐、单宁酸锌盐、扑酸盐等。另一类用于注射的缓慢释放贮库制剂将含有分散在缓慢降解、无毒、无抗原聚合物中以供包封的化合物或盐，例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物例如，如在美国专利号3,773,919中所述。化合物或优选相对不溶的盐，例如上述的那些，也可以在胆固醇基质硅橡胶颗粒中配制，特别是在动物中使用。另外的缓慢释放，贮库或植入制剂，例如气体或液体脂质体，是在文献这已知的(美国专利号5,770,222和“缓释和控释给药系统(sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems)”,j.r.robinsoned.,marceldekker,inc.,n.y.,1978)。

作为过继性细胞疗法的修饰细胞的输注

本公开内容提供表达一个或多个本公开内容的car和/或cartyrin的修饰细胞，其已经选择和/或扩增以供给予有需要的受试者。本公开内容的修饰细胞可被配制以供在任何温度(包括室温和体温)下储存。本公开内容的修饰细胞可被配制以供冷冻保存和随后的解冻。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中配制，以指导从无菌包装给予受试者。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中与细胞成活力和/或car/cartyrin表达水平的指示剂一起配制，以确保最小水平的细胞功能和car/cartyrin表达。本公开内容的修饰细胞可在药学上可接受的载体中以规定的密度与一个或多个试剂配制，以抑制剂进一步扩增和/或防止细胞死亡。

诱导型前凋亡多肽

本公开内容的诱导型前凋亡多肽优于现有的诱导型多肽，因为本公开内容的诱导型前凋亡多肽是免疫原性极其低的。虽然本公开内容的诱导型前凋亡多肽是重组体多肽，因此，经重组产生本公开内容的诱导型前凋亡多肽的非-天然存在的序列不包含宿主人免疫系统可识别为“非-自身”的非-人序列，从而在接受本公开内容的诱导型前凋亡多肽，包含诱导型前凋亡多肽的细胞或包含诱导型前凋亡多肽的组合物或包含诱导型前凋亡多肽的细胞的受试者中诱导免疫反应。

本公开内容提供包含配体结合区、接头，和前凋亡肽的诱导型前凋亡多肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。在某些实施方案中，前凋亡肽是半胱天冬酶多肽。在某些实施方案中，半胱天冬酶多肽是半胱天冬酶9多肽。在某些实施方案中，半胱天冬酶9多肽是截短的半胱天冬酶9多肽。本公开内容的诱导型前凋亡多肽可以是非-天然存在的。

本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12，和半胱天冬酶14。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于那些与细胞凋亡相关的半胱天冬酶多肽，包括半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9，和半胱天冬酶10。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于那些与初始细胞凋亡相关的半胱天冬酶多肽，包括半胱天冬酶2、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9，和半胱天冬酶10。本公开内容的半胱天冬酶多肽包括，但不限于那些执行凋亡的半胱天冬酶多肽，包括半胱天冬酶3、半胱天冬酶6，和半胱天冬酶7。

本公开内容的半胱天冬酶多肽与野生型氨基酸或核酸序列相比，可由具有一个或多个修饰的氨基酸或核酸序列编码。本公开内容的编码半胱天冬酶多肽的核酸序列可以是优化的密码子。对本公开内容的半胱天冬酶多肽的氨基酸和/或核酸序列的一个或多个修饰可增加相互作用、交联、交叉激活，或本公开内容的半胱天冬酶多肽的激活(与野生型氨基酸或核酸序列比较)。做为选择，或者另外地，对本公开内容的半胱天冬酶多肽的氨基酸和/或核酸序列的一个或多个修饰可降低本公开内容的半胱天冬酶多肽与野生型氨基酸或核酸序列相比的免疫原性。

与野生型半胱天冬酶多肽比较，本公开内容的半胱天冬酶多肽可以是截短的。例如，半胱天冬酶多肽可被截短以消除编码半胱天冬酶激活和招募结构域(card)的序列，以除了在包含本公开内容的诱导型半胱天冬酶多肽的细胞中引发细胞凋亡外，还消除或尽量减少激活局部炎症反应的可能性。本公开内容的编码半胱天冬酶多肽的核酸序列可剪接，以形成本公开内容的半胱天冬酶多肽的变异氨基酸序列(与野生型半胱天冬酶多肽比较)。本公开内容的半胱天冬酶多肽可由重组体和/或嵌合序列编码。本公开内容的重组和/或嵌合半胱天冬酶多肽可包括来自一个或多个不同的半胱天冬酶多肽的序列。可供选择地，或者另外，本公开内容的重组和/或嵌合半胱天冬酶多肽可包括来自一个或多个物种的序列(如人序列和非-人序列)。本公开内容的半胱天冬酶多肽可以是非-天然存在的。

本公开内容的诱导型前凋亡多肽的配体结合区可包括任何多肽序列，其利于或促进第一个本公开内容的诱导型前凋亡多肽与第二个本公开内容的诱导型前凋亡多肽的二聚，二聚作用激活或诱导前凋亡多肽的交联和诱导细胞凋亡。

配体-结合(“二聚”)区可包含任何多肽或其功能结构域，其将允许使用天然或非天然配体(即和诱导剂)引入，例如，非天然合成配体。配体-结合区可能是细胞膜的内部或外部，取决于诱导型前凋亡多肽的性质和配体(即诱导剂)的选择。广泛种类的配体-结合多肽及其功能结构域，包括受体，是已知的。本公开内容的配体-结合区可包括来自受体的一个或多个序列。特别令人感兴趣的是配体结合区，其中配体(例如，小的有机配体)是已知的或可能容易产生。这些配体-结合区或受体可包括，但不限于，fkbps和亲环蛋白受体、甾体受体、四环素受体等，以及“非天然”受体，其可从抗体，特别是其重链或轻链亚单位、突变序列、经随机过程得到的随机氨基酸序列、组合合成等而获得。在某些实施方案中，配体-结合区选自fkbp配体-结合区、亲环蛋白受体配体-结合区、甾体受体配体-结合区、亲环蛋白受体配体-结合区，和四环素受体配体-结合区。

包含一个或多个受体结构域的配体-结合区可以有至少约50个氨基酸，和少于约350个氨基酸，通常少于200个氨基酸，或者作为天然结构域或其截短的活性部分。结合区可以例如是小的(<25kda，允许在病毒载体中有效转染)、单体的、非免疫的、具有易于合成的、细胞可渗透的、无毒的配体，其可配置用于二聚。

包含一个或多个受体结构域的配体-结合区可以在细胞内或细胞外，取决于诱导型前凋亡多肽的设计和适宜的配体(即诱导剂)的可利用性。对于疏水性配体，结合区可以是在膜的任一面上，但对于亲水性配体，特别是蛋白配体，结合区将通常是在细胞膜的外面，除非有一种转运系统将配体以一种可供结合的形式内化。对于细胞内受体，包含诱导型前凋亡多肽的诱导型前凋亡多肽或转座子或载体可编码信号肽和受体结构域序列的跨膜结构域5′或3′或可具有受体结构域序列的脂质附着信号序列5′。当受体结构域是在信号肽和跨膜结构域之间，受体结构域将是在细胞外。

抗体和抗体亚单位，例如重链或轻链，特别是片段，更特别是所有或部分的可变区，或重链和轻链的融合以建立高-亲和性结合，可用作本公开内容的配体结合区。设想中的抗体包括为外生表达的人类产物的抗体，如胞外结构域，它不会引起免疫反应，通常不会在周围(即，cns/脑区外)表达。这样的实例包括，但不限于低亲和力神经生长因子受体(lngfr)，和胚胎表面蛋白(即癌胚抗原)。此外，还可以制备抗触觉分子的抗体，其在生理上可以接受的，以及筛选出的个体抗体亚基的结合亲和力。cdna编码亚单位可通过缺失恒定区、可变区的部分、可变区的突变等分离和修饰，以获得对配体具有适当亲和力的结合蛋白结构域。这样，几乎任何生理上可以接受的触觉化合物都可以用作配体或为配体提供一个表位。可以用天然受体代替抗体单位，其中结合区或结构域是已知的，并且有一个有用的或已知的配体来结合。

为使受体多聚化，对于诱导型前凋亡多肽的配体-结合区/受体结构域的配体可能是多聚体，因为在这个意义上，配体可有至少两个结合位点，每个结合位点都能够结合于配体受体区(即配体具有能够结合第一个诱导型前凋亡多肽的配体-结合区的第一个结合位点和能够结合诱导型前凋亡多肽的配体-结合区的第二个结合位点，其中第一个和第二个诱导型前凋亡多肽的配体-结合区是相同或不同的)。因此，如本文所用的，术语“多聚体配体结合区”指结合于多聚体配体的本公开内容的诱导型前凋亡多肽的配体-结合区。本公开内容的多聚体配体包括二聚配体。本公开内容的二聚配体可具有两个能够结合配体受体结构域的结合位点。在某些实施方案中，本公开内容的多聚体配体是二聚体或高阶低聚物，通常由小的合成有机分子组成的不大于约四聚的配体，单个分子通常是至少约150da和少于约5kda，通常少于约3kda。可以使用多种合成配体和受体对。例如，在涉及天然受体的实施方案中，二聚fk506可与fkbp12受体一起使用，二聚环孢菌素a可与亲环蛋白受体一起使用，二聚雌激素与雌激素受体、二聚糖皮质激素与糖皮质激素受体、二聚四环素与四环素受体、二聚维生素d与维生素d受体等。另外，也可以使用高阶配体，例如，三聚体。对于涉及非天然受体的实施方案，例如抗体亚单位、修饰的抗体亚单位、由重链和轻链可变区串联而成的单链抗体，由柔性接头分开，或修饰受体，及其突变列等，可用于多种化合物中的任何一种。包含本公开内容的多聚体配体的单元的一个显著特征是，各个结合位点能够以高亲和力结合受体，且优选地，它们能够在化学上二聚化。同样，所述方法可用来平衡配体的疏水性/亲水性，以便它们能够以功能水平溶解在血清中，而在大多数应用中则能扩散越过质膜。

本公开内容的诱导型前凋亡多肽的激活可通过例如，由诱导剂介导的化学诱导的二聚(cid)完成，以产生一种条件控制的蛋白或多肽。由于不稳定的二聚化剂的降解或单聚竞争抑制剂的使用，本公开内容的前凋亡多肽不仅是诱导型的，而且这些多肽的诱导也是可逆的。

在某些实施方案中，配体结合区包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽。在某些实施方案中，配体结合区包含具有缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v)的fkbp12多肽。在某些实施方案中，其中配体结合区包含具有缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v)的fkbp12多肽，诱导剂可包含ap1903、合成药物(cas索引名：2-哌啶羧酸,1-[(2s)-1-氧代-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁基]-,1,2-乙烷二基双[亚氨基(2-氧代-2,1-乙烷二基)氧基-3,1-亚苯基[(1r)-3-(3,4-二甲氧基苯基)亚丙基]]酯,[2s-[1(r*),2r*[s*[s*[1(r*),2r*]]]]]-(9cl)cas登记号：195514-63-7；分子式：c78h98n4o20；分子量：1411.65))。在某些实施方案中，其中配体结合区包含具有缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v)的fkbp12多肽，诱导剂可包含ap20187(cas登记号：195514-80-8和分子式：c82h107n5o20)。在某些实施方案中，诱导剂是ap20187同系物，例如，ap1510。如本文所用的，诱导剂ap20187、ap1903和ap1510可互换使用。

ap1903api由alphoraresearchinc.产生，而用于注射的ap1903药品由formatechinc制造。它被配制为ap1903在非-离子增溶剂solutolhs15(250mg/ml,basf)的25%溶液中的5mg/ml溶液。在室温，这个制剂是稍显黄色的澄清溶液。在制冷时，这个制剂经历了可逆的相变，形成了乳白色的溶液。这种相变在再加热到室温时被逆转。在3ml玻璃小瓶中装入2.33ml(每小瓶注射总共大约10mgap1903)。在确定给予ap1903的需要量时，患者可以例如，在2小时内，使用一种非-dehp、非-环氧乙烷消毒输液器，经由iv输注注射(0.4mg/kg)给予单次固定剂量的ap1903。对所有患者的ap1903的剂量分别计算，且不再重新计算，除非体重波动≧10%。经计算的剂量在100ml的0.9%正常盐水中稀释，然后输注。在ap1903的先前的i期研究中，24名健康志愿者用注射单剂量的ap1903治疗，以0.01、0.05、0.1、0.5和1.0mg/kg的剂量水平经iv输注2小时。ap1903血浆水平与剂量成正比，平均cmax值在大约10-1275ng/ml剂量范围内，约为0.01-1.0mg/kg。初始输注期后，血液浓度显示出快速的分布期，血浆水平在给药后0.5、2和10小时分别减少至大约18、7和1%最大浓度。对于注射而言，ap1903显示在所有剂量水平都是安全和耐受性好的，并显示出良好的药动学特征。iuliuccijd,etal.,jclinpharmacol.41:870-9,2001。

供注射用的ap1903的固定剂量，例如，可以是0.4mg/kg，静脉内输注2小时。细胞有效信号转导所需的体外ap1903的量是10-100nm(1600damw)。这等于16-160μg/l或˜0.016-1.6μg/kg(1.6-160μg/kg)。高达1mg/kg的剂量在上述ap1903的i期研究中是良好耐受的。因此，0.4mg/kg可以是ap1903用于与治疗细胞组合的这个i期研究的安全有效的剂量。

与野生型氨基酸或核酸序列相比，本公开内容的编码配体结合的氨基酸和/或核酸序列可含有序列一个或多个修饰。例如，本公开内容的氨基酸和/或核酸序列编码配体结合区可以是密码子-优化的序列。与野生型多肽比较，一个或多个修饰可增加配体(如诱导剂)对本公开内容的配体结合区的结合亲和力。做为选择，或者另外地，与野生型多肽比较，一个或多个修饰可降低本公开内容的配体结合区的免疫原性。本公开内容的配体结合区和/或本公开内容的诱导剂可以是非-天然存在的。

本公开内容的诱导型前凋亡多肽包含配体结合区，接头和前凋亡肽，其中诱导型前凋亡多肽不包含非-人序列。在某些实施方案中，非-人序列包含限切酶位点。接头可包含允许配体结合区二聚、相互作用、交联、交叉激活，或激活前凋亡多肽的任何有机或无机材料，以致前凋亡多肽的相互作用或激活启动细胞凋亡。在某些实施方案中，接头是多肽。在某些实施方案中，接头是包含g/s富含氨基酸序列(“gs”接头)的多肽。在某些实施方案中，接头是包含氨基酸序列ggggs(seqidno:25)的多肽。在优选的实施方案中，接头是多肽，编码多肽的核酸不含限制性内切酶的限切酶位点。本公开内容的接头可以是非-天然存在的。

本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在任何启动子能够引发和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在细胞中的表达的转录调节下，在细胞中表达。如本文所用的术语“启动子”指用作启动对rna聚合酶的结合位点以转录基因的启动子。例如，本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在能够启动和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在哺乳动物细胞中的表达的任何启动子的转录调节下，在哺乳动物细胞中表达，包括，但不限于天然的、内源的、外源的，和异源的启动子。优选的哺乳动物细胞包括人细胞。因此，本公开内容的诱导型前凋亡多肽可在任何启动子能够启动和/或调节本公开内容的诱导型前凋亡多肽在人细胞中的表达的任何启动子的转录调节下，在人细胞中表达，包括，但不限于人启动子或病毒性启动子。人细胞中表达的示例性启动子包括，但不限于，人巨细胞病毒(cmv)即刻早期基因启动子、sv40早期启动子、rous肉瘤病毒长端重复、β-肌动蛋白启动子、大鼠胰岛素启动子和甘油醛-3-磷酸盐脱氢酶启动子，其中的每一个可被用来获得高水平表达的本公开内容的诱导型前凋亡多肽。也考虑了使用本领域熟知的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子，以达到本公开内容的诱导型前凋亡多肽的表达，只要表达水平足以引发细胞凋亡。通过使用具有熟知的特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣蛋白的表达水平和表达模式。

选择响应特定生理或合成信号而调节的启动子可允许本公开内容的诱导型前凋亡多肽的诱导型表达。蜕皮激素系统(ecdysonesystem)(invitrogen,carlsbad,calif.)就是一个这样的系统。这种系统被设计以允许相关基因在哺乳动物细胞中的调节表达。它由一种严格调控的表达机制组成，几乎不允许转基因的基础水平表达，但是超过200倍的可诱导性。系统是建立在果蝇(drosophila)异二聚体蜕皮激素受体的基础上的，且当蜕皮激素或类似物例如muristeronea结合受体时，受体激活启动子，以启动mrna转录子的下游转基因高水平的表达。在该系统中，异二聚体受体的两个单体由一个载体构成表达，而蜕皮激素-反应性启动子，其驱动感兴趣基因的表达，位于另一个质粒上。因此，将这种类型的系统设计成感兴趣的载体可能是有用的。另一个可能有用的诱导型系统是tet-off™或tet-on™系统(clontech,paloalto,calif.)，最早由gossenandbujard(gosseandbujard,proc.natl.acad.sci.usa,89:5547-5551,1992;gossenetal.,science,268:1766-1769,1995)开发。这种系统还允许对四环素或四环素衍生物如多西环素的反应来调节高水平的基因表达。在tet-on™系统中，基因表达在多西环素的存在下开启，而在tet-off™系统中，基因表达在多西环素的不存在下开启。这些系统是基于从大肠杆菌的四环素抗药性操纵子衍生出的两个调节元件：四环素算符序列(四环素抑制剂结合的序列)和四环素抑制剂蛋白。感兴趣的基因被克隆到启动子后面的质粒中，启动子中含有四环素反应元件。第二个质粒含有称为四环素-受控反式激活剂的调节元件，其在tet-off™系统中由源自单纯疱疹病毒和野生型四环素抑制剂的vp16结构域组成。因此在多西环素的存在下，转录是构成性的。在tet-on™系统中，四环素抑制剂不是野生型的，且在多西环素的存在下激活转录。对于基因疗法载体生产，可使用tet-off™系统，以使细胞可以在四环素或多西环素存在下培养产生，并防止潜在毒性转基因的表达，但当载体引入患者时，基因表达将是构成性的。

在某些情况下，需要调节转基因在基因治疗载体中的表达。例如，采用具有不同活性强度的不同病毒性启动子，这取决于期望水平的表达。在哺乳动物细胞中，cmv即刻早期启动子常常被用来提供强的转录激活。cmv启动子在donnelly,j.j.,etal.,1997.annu.rev.immunol.15:617-48中有评述。当期望转基因的表达水平减少时，效力较差的cmv启动子的修饰版本也被使用。当转基因在造血细胞中的表达是期望的情况下，通常采用逆病毒性启动子例如来自mlv或mmtv的ltrs。取决于所需效果而使用的其它病毒性启动子包括sv40、rsvltr、hiv-1和hiv-2ltr，腺病毒启动子例如e1a、e2a，或mlp区，aavltr、hsv-tk，和禽肉瘤病毒。

在其它例子中，启动子的选择可能受到发育调控，并且在特定的分化细胞中是活跃的。因此，例如，启动子在多能干细胞中可能不活跃，但是，例如，多能干细胞分化成更成熟的细胞，然后启动子可能被激活。

类似地，组织特定启动子被用来在特定组织或细胞中进行转录，以减少对非-靶标组织的潜在的毒性或不需要的效应。这些启动子可导致与较强启动子例如cmv启动子比较的表达减少，但也可导致更有限的表达，和免疫原性(bojak,a.,etal.,2002.vaccine.20:1975-79;cazeaux,n.,etal.,2002.vaccine20:3322-31)。例如，组织特定启动子例如psa相关启动子或前列腺特异性腺激肽释放酶，或肌肉肌酸激酶基因，可酌情使用。

组织特异性或分化特异性启动子的例子包括，但不限于以下：b29(b细胞)；cd14(单核细胞)；cd43(白细胞和血小板)；cd45(造血细胞)；cd68(巨噬细胞)；肌间线蛋白(肌肉)；弹性蛋白酶-1(胰腺腺泡细胞)；内皮蛋白(内皮细胞)；纤连蛋白(分化细胞、愈合组织)；和flt-1(内皮细胞)；gfap(星形胶质细胞)。

在某些适应症中，在给予基因治疗载体后的特定时间激活转录是可取的。这是用那些激素或细胞因子可以调节的此类启动子来完成的。可使用的细胞因子和炎症蛋白应答启动子包括k和t激肽原(kageyamaetal.,(1987)j.biol.chem.,262,2345-2351),c-fos、tnf-α、c-反应性蛋白(arcone,etal.,(1988)nucl.acidsres.,16(8),3195-3207),触珠蛋白(olivieroetal.,(1987)emboj.,6,1905-1912)，血清淀粉状蛋白a2、c/ebpα、il-1、il-6(poli和cortese,(1989)proc.nat'lacad.sci.usa,86,8202-8206)，补体c3(wilsonetal.,(1990)mol.cell。biol.,6181-6191)、il-8,α-1酸糖蛋白(prowse和baumann,(1988)molcellbiol,8,42-51)、α-1抗胰蛋白酶、脂蛋白脂肪酶(zechneretal.,mol.cell.biol.,2394-2401,1988)，血管紧张素原(ron,etal.,(1991)mol.cell.biol.,2887-2895)，纤维蛋白原、c-jun(被佛波醇酯诱导、tnf-α、uv辐射、维甲酸和过氧化氢)、胶原酶(佛波醇酯和维甲酸诱导的)、金属硫蛋白(重金属和糖皮质激素诱导型)、基质溶素(佛波醇酯、白细胞介素-1和egf诱导)、α-2巨球蛋白和α-1抗-糜蛋白酶。其它启动子包括，例如，sv40、mmtv、人免疫缺陷病毒(mv)、莫罗尼病毒、alv、爱泼斯坦-巴尔病毒、劳氏肉瘤病毒、人肌动蛋白、肌球蛋白、血红蛋白和肌酸。

已设想上述任何一种启动子单独或与另一种启动子结合使用可能是有用的。选择启动子和其它调节元件以使它们在期望的细胞或组织发挥功能。此外，启动子的这个列表不应视为是穷举的或限制性的；其它启动子与本文公开的启动子和方法一起使用。

实施例

实施例1：p-bcma-101(a/k/a抗-bcmacartyrin(a08))的特征鉴定

在编码cartyrin的序列的mrna电穿孔进入t细胞后，评价本公开内容的cartyrin的表达。cartyrin-表达t细胞的功能通过针对肿瘤细胞系的脱粒法测量。特征进一步分析与功能的相关性。

图4描述a08抗-bcmacartyrin的结构。

图5-8显示出p-bcma-101(编码a08抗-bcmacartyrin)的体外和体内特征。

a08cartyrin的体外评价显示出人原代t细胞慢病毒转导后高水平的表面表达和对抗bcma+肿瘤细胞的强细胞毒作用(如增殖)(见图5a-c)。基于这个强烈的体外表现，对a08cartyrin在体内发挥功能的能力进行了评价。

图6描述了使用a08cartyrin用于小鼠的体内研究的治疗方案。这个研究的结果显示，用p-bcma-101(编码a08cartyrin)治疗的小鼠在第21天100%存活(见图7)。在接受治疗的动物在第21天完全存活的同时，肿瘤负荷显示为零(如通过m-蛋白丰度所评价的，其在第21天，在这些动物中未检测出)(见图7)。图8提供进一步说明在对照动物以及用p-bcma-101治疗的那些动物中的肿瘤负荷的一系列照片。表达a08cartyrin的动物与对照组比较显示出肿瘤负荷减少。

实施例2：piggybac整合的ic9安全开关在人pant-细胞中的表达和功能

使用具有4个piggybac转座子之一的amaxa4d细胞核转染液，对人pant-细胞进行核转染。用空piggybac转座子对接受“模拟”条件的修饰的t细胞进行核转染。修饰的t细胞接受含有单独治疗剂(编码cartyrin的序列)的piggybac转座子或者含有整合的ic9序列和治疗剂(编码cartyrin的序列)的piggybac转座子。

图8提供ic9安全开关的示意图，所述开关含有配体结合区、接头，和截短的半胱天冬酶9多肽。特别地，ic9多肽含有包含fk506结合蛋白12(fkbp12)多肽(包括缬氨酸(v)取代位置36的苯丙氨酸(f)(f36v))的配体结合区。ic9多肽的fkbp12多肽由包含gvqvetispgdgrtfpkrgqtcvvhytgmledgkkvdssrdrnkpfkfmlgkqevirgweegvaqmsvgqrakltispdyaygatghpgiipphatlvfdvellkle(seqidno:23)的氨基酸序列编码。ic9多肽的fkbp12多肽由包含ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggag(seqidno:24)的核酸序列编码。ic9多肽的接头区由包含ggggs(seqidno:25)的氨基酸和包含ggaggaggaggatcc(seqidno:26)的核酸序列编码。编码ic9多肽的接头区的核酸序列由包含gfgdvgaleslrgnadlayislmepcghcliinnvnfcresglrtrtgsnidceklrrrfsslhfmvevkgdltakkmvlallelaqqdhgaldccvvvilshgcqashlqfpgavygtdgcpvsvekivnifngtscpslggkpklffiqacggeqkdhgfevastspedespgsnpepdatpfqeglrtfdqldaisslptpsdifvsystfpgfvswrdpksgswyvetlddifeqwahsedlqslllrvanavsvkgiykqmpgcnflrkklffkts(seqidno:27)的氨基酸编码。编码ic9多肽的接头区的核酸序列由包含tttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc(seqidno:28)的核酸序列编码。

为测试ic9安全开关，4个修饰的t细胞的每一个与0、0.1nm、1nm、10nm、100nm或1000nmap1903(ap1903的诱导剂)一起培养24小时。使用7-原放线菌素d(7-aad)、荧光嵌入剂(作为细胞经历凋亡的标记)，通过流式细胞术评价活力。

细胞成活力在第12天评价(见图9)。数据显示出细胞群从右下象限迁移到左上象限，诱导剂在含有ic9构建体的细胞中的浓度逐渐增加；然而，这个效应在缺乏ic9构建体的细胞(仅接受cartyrin的那些)中未观察到，其中细胞在这两个区域均匀地分布，而与诱导剂的浓度无关。而且，细胞成活力在第19天评价(见图10)。数据显示如在图9(核转染后第12天)所示的相同趋势；然而，在这个较晚的时间点(核转染后第19天)，细胞群向左上象限的迁移更为明显。

对聚集结果进行了量化，如图11所示，显示在第12天(图9和左图)或第19天(图10和右图)，ic9安全开关对细胞成活力百分比的显著影响，所述细胞成活力百分比作为每个修饰细胞类型的ic9开关诱导剂(ap1903)的浓度的函数。ic9安全开关的存在到第12天在绝大多数细胞中诱导细胞凋亡，到第19天效果甚至更显著。

这个研究结果显示，ic9安全开关在与诱导剂(如ap1903)接触时，极其有效地消除活性细胞，因为ap1903即使在研究的最低浓度(0.1nm)下也诱导细胞凋亡。此外，ic9安全开关可以在功能上作为三顺反子载体的一部分表达。

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