化学修饰siRNA的制作方法

本发明涉及化学修饰sirna。更具体而言，本发明涉及在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna，其在与裂裥菌素(schizophyllan)进行了复合化的情况下，对核糖核酸酶(rnase)的耐性高，而且有效地显示出rnai活性。

背景技术：

对于1998年发现的rna干扰(rnai)而言，由于其效果的大小、持续性与现有的反义法相比显著优异，且是突破性的基因表达抑制方法，因此一直以来期待药物应用。然而，显示出rnai活性的双链rna(即sirna)在从给药至摄入靶细胞的过程中或在细胞内大多被分解，难以在细胞内形成作为其活性主体的risc复合体。

对于利用适合的算法设计出的未修饰的sirna而言，为了发挥期待的rnai活性，由于在生物体内、细胞内的脆弱性、例如由于存在于血液中等的核糖核酸酶(rnase)而极易被分解，因此在靶细胞中发挥rnai效果的sirna很少。因此，一直以来提出了对sirna实施成为核糖核酸酶耐性那样的各种化学修饰(非专利文献1～3)。然而，作为核酸药物开发出的sirna中大部分对全部碱基实施了化学修饰，由此导致无法发挥序列设计最初对未修饰的sirna期待的rnai活性的结果。即，现状是尚未发现以很少的化学修饰使核糖核酸酶耐性优异、且如原本期待的那样诱导rnai活性的化学修饰sirna(非专利文献4)。

另一方面，作为sirna的递送技术，提出了添加有多聚脱氧腺苷酸的sirna与裂裥菌素(spg)的sirna/spg复合体(参照专利文献1)。该sirna/spg复合体能够针对树状细胞等dectin-1表达细胞选择性地递送sirna，而且递送至细胞内时，能够有效地发挥rnai效果，因此期待作为核酸药物的实用化。由于该sirna/spg复合体处于sirna被spg包埋的状态，因此，虽然能够期待一定程度的核糖核酸酶耐性，但在核糖核酸酶大量存在的血液中无法避免由核糖核酸酶导致的分解，为了将该sirna/spg复合体开发为核酸药物，期望开发出在保持rnai活性的同时提高对核糖核酸酶的耐性的技术。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：developmentoftherapeutic-gradesmallinterferingrnasbychemicalengineering,jesperb.bramsenandjorgenkjems,frontgenet.2012；3:154.

非专利文献2：oligonucleotidetherapies:thepastandthepresent,karine.lundin,olofgissberg,andc.i.edvardsmith,humgenether.2015aug1；26(8):475-485.

非专利文献3：sirnamod:adatabaseofexperimentallyvalidatedchemicallymodifiedsirnas,showkatahmaddar,anamikathakur,abidqureshi&manojkumar,scirep.2016；6:20031.

非专利文献4：preclinicalandclinicaldevelopmentofsirna-basedtherapeutics,gulnihalozcan,bulentozpolat,robertl.coleman,anilk.sood,andgabriellopez-berestein,advdrugdelivrev.2015june29；87:108-119.

专利文献

专利文献1：wo2009/078470公报

发明的内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供一种在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸(除非另有特别限定，以下以也包含经硫代磷酸酯化的多聚脱氧腺苷酸的意思使用)的化学修饰sirna，其在与裂裥菌素进行了复合化的情况下，对核糖核酸酶的耐性高，而且有效地显示出rnai活性。

用于解决问题的方案

在对在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸的sirna进行化学修饰来提高对核糖核酸酶的耐性时，作为本领域技术人员通常会认为：(1)在被认为与有义链的接合力特别弱的无义链的5’末端侧、(2)在sirna与多聚脱氧腺苷酸的连接点的附近，在这两处通过化学修饰来增强对核糖核酸酶的耐性是必不可少的，但本发明人等确认了，即使对这两处实施化学修饰，对核糖核酸酶的耐性也未充分提高。另外，对公知文献中报道的sirna的化学修饰法进行了研究。

在这样的情况下，本发明人等通过深入研究发现：与通常的未添加多聚脱氧腺苷酸的sirna相比，对于在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸的sirna，通过对特定的碱基实施特定的化学修饰，即使是较少的化学修饰，也可以使在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸的sirna与裂裥菌素复合化时的对核糖核酸酶的耐性得到显著提高，能够有效地显示出rnai活性。本发明是基于上述见解并进行进一步研究而完成的。

即，本发明提供下述所示的方式的发明。在本说明书中，也将下述项目1的条件(i)～(ix)所示的本发明的修饰方法称为a-3修饰。

项目1.一种化学修饰sirna，其在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸，

有义链的碱基序列包含选自ca、ua及ug中的至少1种二核苷酸序列，

无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列包含选自ca、ua及ug中的至少1种二核苷酸序列，且

所述化学修饰sirna满足以下条件(i)～(ix)：

(i)在有义链的碱基序列中，包含由ca组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的胞苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代；

(ii)在有义链的碱基序列中，包含由ua组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代；

(iii)在有义链的碱基序列中，包含由ug组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的鸟苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代；

(iv)在无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列中，包含由ca组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的胞苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代；

(v)在无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列中，包含由ua组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代；

(vi)在无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列中，包含由ug组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的鸟苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代；

(vii)无义链的从5’末端侧起第1～7位的核糖核苷酸残基未实施化学修饰；

(viii)在按照上述(i)～(vi)实施化学修饰时，在有义链的从5’末端侧起第1位和无义链的从5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基均未被化学修饰的情况下，有义链的从5’末端侧起第1位的核糖核苷酸残基为胞苷酸残基或尿苷酸残基时，2’位被氟基修饰，该核糖核苷酸残基为腺苷酸残基或鸟苷酸残基时，2’位被甲氧基修饰；

(ix)在按照上述(i)～(vi)实施化学修饰时，在有义链的从5’末端侧起第1位和无义链的从5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基均被化学修饰的情况下，不对无义链的从5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基实施化学修饰。

项目2.根据项目1所述的化学修饰sirna，其中，上述多聚脱氧腺苷酸为10～100个碱基长。

项目3.一种裂裥菌素/化学修饰sirna复合体，其是将项目1或2所述的化学修饰sirna与裂裥菌素复合化而成的。

发明的效果

根据本发明，可以提供一种化学修饰sirna，其是通过实施较少的化学修饰而在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna，且所述化学修饰sirna在与裂裥菌素复合化的情况下，对核糖核酸酶的耐性高，而且有效地显示出rnai活性。

附图说明

图1是示出参考试验例1中，对于各种化学修饰sirna、及使用了化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了基因表达抑制效果的结果的图。

图2是示出参考试验例2中，对于各种化学修饰sirna、及使用了化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了在血清中的稳定性的结果的图。

图3是示出参考试验例3中，对于使用了各种化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了基因表达抑制效果的结果的图。

图4是示出参考试验例4中，对于使用了各种化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了血清中的稳定性的结果的图。

图5是示出试验例1中，对于各种化学修饰sirna、及使用了化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了基因表达抑制效果的结果的图。

图6是示出试验例2中，对于使用了各种修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了血清中的稳定性的结果的图。

图7是示出试验例3中，对于使用了各种修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，利用x-vivomlr(混合淋巴细胞培养)测定评价了细胞增殖抑制效果的结果的图。

图8是示出试验例4中，对于各种化学修饰sirna、及使用了化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了基因表达抑制效果的结果的图。

具体实施方式

在本发明中，在表示由2个以上的碱基组成的碱基序列时，碱基序列的左端为5’末端，右端为3’末端。

1.化学修饰sirna

添加了多聚脱氧腺苷酸的sirna的碱基序列/结构

本发明的化学修饰sirna的特征在于，在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸，有义链和无义链包含特定的二核苷酸序列，对该二核苷酸序列实施了特定的化学修饰。以下，对本发明的化学修饰sirna进行详细说明。

在本发明的化学修饰sirna中，对于有义链和无义链的碱基序列，根据靶基因中的靶序列来设定。靶基因中的靶序列可以按照idt公司(integrateddnatechnologies,inc)的手册(dicersubstraternaidesign)等利用公知的方法进行设定。sirna通常被设计为包含如下序列，所述序列为：与该靶序列100％一致的序列；或只要可以得到希望的rna干扰效果则在该靶序列中置换/添加了1个或多个碱基的序列。另外，还报道了可以通过设计如下双链rna来设计具有优异的rna干扰效果的sirna，所述双链rna的无义链的5’末端为a/u对，有义链的5’末端为g/c对，在无义链的5’末端侧有5个左右的a/u对，且在双链中不具有9个以上的g/c对(ui-teiet.al,nucleicacidsres.,32,936-948(2004))。例如，作为针对cd40的sirna，可以列举：包含由序列号1所示的碱基序列组成的有义链和由序列号2所示的碱基序列组成的无义链的sirna、包含由序列号3所示的碱基序列组成的有义链和由序列号4所示的碱基序列组成的无义链的sirna、包含由序列号5所示的碱基序列组成的有义链和由序列号6所示的碱基序列组成的无义链的sirna、包含由序列号7所示的碱基序列组成的有义链和由序列号6所示的碱基序列组成的无义链的sirna、包含由序列号9所示的碱基序列组成的有义链和由序列号10所示的碱基序列组成的无义链的sirna等。

在本发明的化学修饰sirna中，有义链的碱基序列包含选自ca、ua和ug中的至少1种二核苷酸序列，且无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列包含选自ca、ua和ug中的至少1种二核苷酸序列。通过对上述二核苷酸序列实施后述的特定的化学修饰，从而在与spg复合化时，能够在保持rnai活性的同时提高对核糖核酸酶的耐性。

对于本发明的化学修饰sirna的靶基因，没有特别限制，可以基于该化学修饰sirna的用途而适当选择，从应用于药物用途这样的观点出发，优选为与病状相关且期望其表达抑制的基因。

作为本发明的化学修饰sirna的靶基因的优选的一个方式，可列举出在dectin-1表达细胞中表达、且对该细胞所承担的生物体内功能产生影响的基因。dectin-1是存在于细胞膜上的具有c型凝集素类型的糖链识别结构域的受体(模式识别受体：patternrecognitionreceptor)。dectin-1在细胞外具有特异性识别spg的区域，且细胞内具有被称为itam(immunoreceptortyrosinase-basedactivationmotif-1：免疫受体酪氨酸激活基序1)的传递激活信号的基序。在dectin-1识别spg时，促进nf-κb、炎性细胞因子的产生，引起生物体防御反应。作为dectin-1表达细胞，具体可以列举出：巨噬细胞、树状细胞、中性粒细胞等。已知spg具有β-1,3-葡聚糖骨架，并通过与dectin-1表达细胞的细胞膜中存在的dctin-1结合而在内吞作用下被递送至dectin-1表达细胞内。将本发明的化学修饰sirna与spg复合化时，通过使spg被dectin-1识别，从而能使本发明的化学修饰sirna选择性地递送至dectin-1表达细胞内。另外，通过选择对dectin-1表达细胞所承担的生物体内功能产生影响的基因作为本发明的化学修饰sirna的靶基因，可以诱导生物体内的免疫抑制，调节免疫。

在本发明的化学修饰sirna中，将在dectin-1表达细胞中表达且对该细胞所承担的生物体内功能产生影响的基因作为靶基因时，该基因的种类没有特别限制，可以基于本发明的化学修饰sirna的用途而适当选择，从生物体内的免疫调节、特别是更有效地诱导免疫抑制的观点出发，作为适合的靶基因，可列举出与以编码cd40等共刺激因子(也称为共刺激分子)的基因为代表的抗原提呈相关的基因等。

在本发明的化学修饰sirna中，对于有义链和无义链的碱基长没有特别限制，优选列举出21个。

另外，在本发明的化学修饰sirna中，有义链和无义链可以进行杂交而形成双链，从而在两3’末端具有由2～5个左右的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的悬挂端。

作为本发明的化学修饰sirna的优选方式的一个例子，可列举出：有义链和无义链的碱基长均为21个、且在有义链的5’末端及无义链的3’末端形成了由2个核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的悬挂端的化学修饰sirna。即，在这样的sirna的情况下，从无义链的3’末端侧起第3～21位的核糖核苷酸序列与从有义链的5’末端侧起第1～19位的核糖核苷酸序列互补。

在本发明的化学修饰sirna中，在有义链的5’末端添加了多聚脱氧腺苷酸。该多聚脱氧腺苷酸与2个spg形成三螺旋结构，起到使本发明的化学修饰sirna与spg复合化的作用。

作为构成多聚脱氧腺苷酸的脱氧腺苷酸残基的数量，以能够形成与spg的复合体为限度，没有特别限制，例如可列举出：10～100个，优选为20～100个，更优选为20～80个，进一步优选为30～50个。

在本发明的化学修饰sirna中，多聚脱氧腺苷酸优选通过磷酸二酯键与有义链的5’末端直接键合，也可以经由接头(间隔物)与有义链的5’末端连接。

另外，在本发明的化学修饰sirna中，有义链、无义链及多聚脱氧腺苷酸的磷酸二酯键中的一部分或全部可以被硫代磷酸酯化(s化)。对于本发明的化学修饰sirna的多聚脱氧腺苷酸部分，优选经过s化。经s化的磷酸二酯键是磷酸二酯键部分的磷酸残基中一个氧原子被硫原子取代的键合结构。

sirna的化学修饰

对于本发明的化学修饰sirna而言，对有义链和无义链实施了按照后述的条件(i)～(ix)进行的化学修饰(a-3修饰)。需要说明的是，在本发明的化学修饰sirna中，需要不对有义链和无义链进行除后述的条件(i)～(ix)以外的化学修饰。

＜有义链的化学修饰＞

本发明的化学修饰sirna的有义链以满足以下条件(i)～(iii)的方式实施化学修饰。

(i)在有义链的碱基序列中，包含由ca组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的胞苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代。

(ii)在有义链的碱基序列中，包含由ua组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代。

(iii)在有义链的碱基序列中，包含由ug组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的鸟苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代。

即，例如，在sirna的有义链为表1的(a)所示的21个碱基长的碱基序列时，作为实施了按照条件(i)～(iii)进行的化学修饰的sirna，可列举出表1的(b)所示的方式。

[表1]

表中，“dt”是指脱氧胸苷酸残基，“u(f)”是指2’位羟基被氟基修饰的尿苷酸残基，“g(m)”是指2’位羟基被甲氧基取代的鸟苷酸残基，“c(f)”是指2’位羟基被氟基修饰的胞苷酸残基，“a(m)”是指2’位羟基被甲氧基取代的腺苷酸残基。

＜无义链的化学修饰＞

本发明的化学修饰sirna的无义链以满足以下条件(iv)～(vii)的方式实施化学修饰。

(iv)在无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列中，包含由ca组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的胞苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代。

(v)在无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列中，包含由ua组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的腺苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代。

(vi)在无义链的从5’末端侧起第8位以后的碱基序列中，包含由ug组成的二核苷酸序列时，该二核苷酸序列中的尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，该二核苷酸序列中的鸟苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代。

(vii)无义链的从5’末端侧起第1～7位的核糖核苷酸残基未实施化学修饰。

即，例如，在sirna的无义链为表2的(a)所示的21个碱基长的碱基序列时，作为实施了按照条件(iv)～(vii)进行的化学修饰的sirna，可列举出表2的(b)所示的方式。

[表2]

表中，“dt”、“u(f)”、“g(m)”及“a(m)”如上述表1所示。

<多聚脱氧腺苷酸附近的化学修饰>

在本发明的化学修饰sirna中，从有义链的5’末端侧起第1位和从无义链的5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基设置于最接近多聚脱氧腺苷酸的位置。在本发明的化学修饰sirna中，对于这些核糖核苷酸残基，有时不能直接适用上述条件(i)～(vii)。

具体而言，在本发明的化学修饰sirna中，有义链和无义链实施按照上述条件(i)～(vii)进行的化学修饰，但在按照所述条件实施了化学修饰的情况下，在从有义链的5’末端侧起第1位和从无义链的5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基均未被化学修饰或均被化学修饰时，需要进行按照下述条件(viii)和(ix)进行的化学修饰。

(viii)在按照上述(i)～(vi)实施化学修饰时，在有义链的从5’末端侧起第1位和无义链的从5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基均未被化学修饰的情况下，有义链的从5’末端侧起第1位的核糖核苷酸残基为胞苷酸残基或尿苷酸残基时，2’位被氟基修饰，该核糖核苷酸残基为腺苷酸残基或鸟苷酸残基时，2’位被甲氧基修饰。

(ix)在按照上述(i)～(vi)实施化学修饰时，在有义链的从5’末端侧起第1位和无义链的从5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基均被化学修饰的情况下，不对无义链的从5’末端侧起第19位的核糖核苷酸残基实施化学修饰。

＜化学修饰的方法＞

用氟基取代(修饰)胞苷酸残基和尿苷酸残基的核糖部分的2’位羟基的方法、用甲氧基取代(修饰)腺苷酸残基和鸟苷酸残基的核糖部分的2’位羟基的方法是公知的，本发明的化学修饰sirna可以利用公知的方法来制造。

2.spg/化学修饰sirna复合体

本发明的化学修饰sirna以与spg复合化而成的裂裥菌素/化学修饰sirna复合体的状态使用。spg是具有β-1,3-葡聚糖骨架的多糖，裂裥菌素/化学修饰sirna复合体通过spg与上述的存在于细胞表面的受体dctin-1结合而在内吞作用下被递送至细胞内。

作为spg/化学修饰sirna复合体的构成成分的裂裥菌素(有时简称为spg)，可以按照文献(a.c.s.38(1),253(1997)；carbohydrateresearch,89,121-135(1981))中记载的常规方法来制造。由此得到的裂裥菌素可以通过超声波处理而得到期望的分子量的裂裥菌素。

对于spg/化学修饰sirna复合体中使用的裂裥菌素的分子量，没有特别限制，可以根据添加至化学修饰sirna中的多聚脱氧腺苷酸的链长等而适当设定。具体而言，作为裂裥菌素的分子量，可示例出通常为25,000～500,000，优选为25,000～250,000。

spg/化学修饰sirna复合体可以按照使spg与多聚脱氧腺苷酸复合化的公知方法来制备。具体而言，可示例出通过以下的工序(1)～(3)来制造的方法：(1)按照公知方法制备包含多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna；(2)另外，另行准备spg；(3)接着，使用与化学修饰sirna结合了的多聚脱氧腺苷酸和spg来形成复合体。

在上述方法的工序(3)中，化学修饰sirna与spg的混合比可以根据多聚脱氧腺苷酸的链长、spg的分子量而适当选择。spg/化学修饰sirna复合体形成如下结构：spg主链的1分子葡萄糖对应于多聚脱氧腺苷酸的1个脱氧腺苷酸残基，且1个多聚脱氧腺苷酸和2个spg形成三螺旋结构。即，在spg/化学修饰sirna复合体中，在由2个spg形成的双螺旋结构的1处或2处以上引入多聚脱氧腺苷酸而形成了三螺旋结构。例如，在包含40个碱基长的多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna和分子量150000的spg的情况下，以在2分子分子量150000的spg中包含17分子的含有碱基长的多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna的方式成为三螺旋结构。作为包含多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna与spg的优选摩尔比，优选的是：以20:1～1:5、优选以10:1～1:1混合，使spg和与化学修饰sirna结合了的单链多聚脱氧腺苷酸区域复合。通过以这样的摩尔比将包含多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna和spg暴露于复合体形成条件下，可以使两者有效地相互作用，能够提高spg/化学修饰sirna复合体的制造效率。

spg/化学修饰sirna复合体中的多聚脱氧腺苷酸与spg的三链螺旋结构的形成具体而言可以按照以下方法来实施。spg在自然界或水中具有三螺旋结构。将该spg溶解于dmso(二甲基亚砜)等极性溶剂、氢氧化钠水溶液等碱性水溶液中而变性为单链，然后加入包含多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna，将溶剂返回水中或对碱性水溶液进行中和(再生过程)，由此，可以形成由与化学修饰sirna连接的多聚脱氧腺苷酸单链部分和2个spg组成的、复合化为三螺旋型的结构(缔合结构)。可以认为，这样的多聚脱氧腺苷酸与多糖的复合化主要借助氢键和疏水性相互作用而形成。

通过将spg/化学修饰sirna复合体导入细胞内，能够在细胞内抑制靶基因的表达，因此可以用作以抑制靶基因的表达为目的的药物组合物。对于该药物组合物而言，可以通过含有治疗有效量的spg/化学修饰sirna复合体作为有效成分，并进一步与药学上允许的载体适当组合来制备。作为这样的载体，可列举出：纯化水、含糖水溶液、缓冲液、生理盐水、无核酸酶的水等的水性载体；赋形剂等。

spg/化学修饰sirna复合体的给药途径可以基于患者的症状、病情、疾病的种类等从目前利用的方法如经口、非经口(包括静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、直肠内、阴道内给药)、吸入、全身给药、局部给药(包括对皮肤、口腔的外用；对眼、耳、鼻等实质上不进入血流的部位的滴注)等中适当选择。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限定于此。

制造例：spg/化学修饰sirna复合体的制造

以如下方式形成了以下试验例中使用的spg/化学修饰sirna复合体。在0.25n氢氧化钠水溶液中以最终浓度为15mg/ml的方式制备分子量约15万的spg，然后振动搅拌1小时，在4℃下静置1天使其变性。在该变性spg溶液中加入溶解于330mm的磷酸二氢钠中的、经s化的添加了多聚脱氧腺苷酸的给定序列的化学修饰sirna的溶液，进行中和，在4℃下静置24小时以上。此时，相对于化学修饰sirna1摩尔，使spg为0.27摩尔。需要说明的是，经s化的添加了多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna是使40个脱氧腺苷酸通过磷酸酯键与sirna的有义链5’末端连接而成的化学修饰sirna。

参考试验例1

使用经化学修饰的针对cd40的化学修饰sirna(表3所示的nj050.11和nj050.13)制备了spg/化学修饰sirna复合体。另外，作为未添加多聚脱氧腺苷酸的化学修饰sirna，准备了表3所示的nj050.12和nj050.13。该化学修饰sirna的有义链和无义链的碱基序列分别对应于序列号1和2。

对于nj050.11而言，在有义链中，用甲氧基取代了所有的腺苷酸和鸟苷酸残基的2’位羟基，用氟基取代了所有的胞苷酸和尿苷酸残基的2’位羟基，在无义链中，用甲氧基取代了从5’末端侧起第8位以后的腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基，用氟基取代了从5’末端侧起第8位以后的胞苷酸和尿苷酸残基的2’位羟基。

对于nj050.12而言，在有义链和无义链这两者中，用氟基取代了由ca、ua和ug组成的二核苷酸序列中的胞苷酸残基和尿苷酸残基的2’位羟基，而且用甲氧基取代了该二核苷酸序列中的腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基。

对于nj050.13而言，在有义链中，用氟基取代了由ca、ua和ug组成的二核苷酸序列中的胞苷酸残基和尿苷酸残基的2’位羟基，而且用甲氧基取代了该二核苷酸序列中的腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基，在无义链中，用甲氧基取代了从5’末端侧起第8位以后的腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基，用氟基取代了从5’末端侧起第8位以后的胞苷酸残基和尿苷酸残基的2’位的甲氧基。

[表3]

表中，“dt”、“u(f)”、“g(m)”及“a(m)”如上述表1所示。

利用电穿孔法将各spg/化学修饰sirna复合体和化学修饰sirna导入20万个c-wrt-7lr细胞(来自于大鼠骨髓单核细胞白血病的细胞)中。在导入后，将各细胞接种在48孔板，使其为2×10⁵细胞/孔，并在37℃、5％co2下孵育2小时。然后，在各孔中添加脂多糖(lps)，使其为10ng/ml，在37℃、5％co2下孵育22小时。接着，从细胞中提取总rna，由总rna合成了cdna。将合成的cdna作为模板，使用cd40引物进行实时pcr，测定了cd40的mrna量。将未插入sirna而进行了lps处理的试样作为阳性对照，将未插入sirna且也未进行lps处理的试样作为阴性对照。另外，cd40的mrna量用作为持家基因的18srrna量进行了校正。

将得到的结果示于图1。在图1中，“lps(-)”表示阴性对照，“lps(+)”为阳性对照，“21bp的nj050.12”表示nj050.12的化学修饰sirna(21个碱基长)，“21bp的nj050.13”表示nj050.13的化学修饰sirna(21个碱基长)，“nj050.11(da40-dsrna)”表示使用了nj050.11的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，“nj050.13(da40-dsrna)”表示使用了nj050.13的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体。

其结果是确认了，对于nj050.13的化学修饰sirna而言，与nj050.12的化学修饰sirna相比，cd40的mrna量降低、无义链中从5’末端侧起至第7位的核糖核苷酸残基未实施化学修饰者，基因表达抑制效果增高。另一方面，在使用了nj050.13的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体中，未观察到基因表达抑制效果。

参考试验例2

对于使用了nj050.13的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体而言，作为未观察到基因表达抑制效果的主要原因，可以考虑是因碱基序列的脆弱性而导致向rlc中的摄入缺陷的可能性，因此，在本试验中进行了化学修饰sirna和spg/化学修饰sirna复合体在血清中的稳定性的评价。

将通过磷酸酯键使40个脱氧腺嘌呤与有义链5’末端连接而成的nj050.13的化学修饰sirna(naked)添加至包含10容量％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基(gibco)中，使其为1μm，在37℃下孵育16小时。接着，加入与试样等量的te饱和苯酚/氯仿，利用涡漩进行强烈搅拌后，以12000×g进行了15分钟离心分离。接着，回收上清液，用分光光度计测定上清液中的核酸浓度，将相当200ng核酸的量供于使用了15％聚丙烯酰胺凝胶的电泳。另外，作为对照，使用了通过磷酸酯键使40个经s化的多聚脱氧腺苷酸与有义链5’末端连接而成的nj003.2的dsrna。nj003.2的dsrna的碱基序列如表4所示，可知在血清中也是比较稳定的。

另外，对于使用了nj050.13的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体和使用了nj003.2的dsrna的spg/sirna复合体，除了将供于电泳的核酸量设定为400ng以外，与上述同样地进行了试验。

将得到的结果示于图2。图2的(a)示出了nj050.13的化学修饰sirna(naked)和nj050.13的化学修饰sirna(naked)的结果。在图2的(a)中，“naked(裸的)”是指未在fbs存在下进行孵育的情况，“nakedinfbs(裸的、在fbs存在下)”是指在fbs存在下进行了孵育的情况。图2的(b)示出了使用了nj050.13的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体和使用了nj003.2的dsrna的spg/sirna复合体的结果。在图2的(b)中，“naked(裸的)”是指未在fbs的存在下对nj050.13的化学修饰sirna或nj003.2的dsrna进行孵育的情况，“complex(复合体)”是指在fbs存在下对spg/化学修饰sirna复合体或spg/sirna复合体进行了孵育的情况，“complexinfbs(复合体、在fbs存在下)”是指在fbs存在下对spg/化学修饰sirna复合体或spg/sirna复合体进行了孵育的情况。

该结果表明，在有义链的5’末端添加了经s化的多聚脱氧腺苷酸而成的nj050.13的化学修饰sirna有可能在多聚脱氧腺苷酸与有义链的结合部位附近被切断了。

参考试验例3

由于根据参考试验例2的结果启示了提高经s化的多聚脱氧腺苷酸与sirna的有义链的结合部位附近的稳定性的必要性，因此，在有义链的接合部位加入化学修饰。另外，根据参考试验例1的结果，由于担心nj050.11中采用的有义链修饰会失去活性，因此制备了表4所示的nj050.14的实施了化学修饰的sirna。

[表4]

表中，“dt”、“u(f)”、“g(m)”及“a(m)”如上述表1所示。

将draw细胞(小鼠巨噬细胞；过表达dectin-1的raw264细胞)接种于48孔板，使其为2×10⁴细胞/孔，并在37℃、5％co2下孵育24小时。接着，添加spg/化学修饰sirna复合体，使其为200nm或400nm，并在37℃、5％co2下孵育12小时。然后，在各孔中添加干扰素γ(ifnr)，使其为0.2ng/ml，并在37℃、5％co2下孵育4小时。接着，从细胞中提取总rna，由总rna合成了cdna。将合成的cdna作为模板，使用cd40引物进行实时pcr，测定了cd40的mrna量。将未添加spg/化学修饰sirna复合体而进行了ifnr处理的试样作为阳性对照，将未添加spg/化学修饰sirna复合体且也未进行ifnr处理的试样作为阴性对照。另外，cd40的mrna量用作为持家基因的18srrna量进行了校正。

将得到的结果示于图3。在图3中，“nt”表示阴性对照，“ifnγ(+)”表示阳性对照，“nj050.13spg复合体”表示使用了nj050.13的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，“nj050.14spg复合体”表示使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体。根据其结果确认了，使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体与使用了nj050.13的化学修饰sirna的复合体的情况具有相同程度的良好的基因表达抑制效果。

参考试验例4

将使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体200ng添加至血清(小鼠血清、人血清和fbs)中，在37℃下孵育1分钟或30分钟。接着，加入与试样等量的te饱和苯酚/氯仿，利用涡漩进行强烈搅拌后，以12000×g进行15分钟离心分离。接着，回收上清液，用分光光度计测定上清液中的核酸浓度，将相当200ng核酸的量供于使用了15％聚丙烯酰胺凝胶的电泳。

将得到的结果示于图4。在图4中，泳道1的“naked(裸的)”是指未在血清存在下对经s化的添加了多聚脱氧腺苷酸的nj050.13的化学修饰sirna进行孵育的情况，泳道2的“complex(复合体)”是指未在血清存在下对使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体进行孵育的情况，泳道3～5和9～11的“nj050.14复合体”是指使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，泳道12的“21mer”是指nj003.2的化学修饰sirna部分的有义链序列，其作为长度标记使用。根据该结果确认了，使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体在血清存在下是比较稳定的。

试验例1

对于nj050.14的化学修饰sirna而言，用甲氧基取代了腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基的部位很多，在制造上有收率降低的隐患。另外，尽管nj050.14的化学修饰sirna在血清存在下比较稳定，但与nj050.13的化学修饰sirna相比，在血清中的稳定性差，可以认为不能耐受体内(invivo)使用。因此，即使对经s化的多聚脱氧腺苷酸与sirna的有义链的结合部位的化学修饰是必不可少的，即使牺牲稳定性，也要尽可能地减少化学修饰的数量，开发出具备适当的基因表达抑制效果的化学修饰sirna。

因此，制备了表5所示的nj050.15的实施了化学修饰的sirna。nj050.15的实施了化学修饰的sirna满足本发明中给定的条件(i)～(ix)。

[表5]

表中，“dt”、“u(f)”、“g(m)”及“a(m)”如上述表1所示。

将draw细胞(小鼠巨噬细胞；过表达dectin-1的raw264细胞)接种于48孔板，使其为5×10⁴细胞/孔，同时添加200nm的spg/化学修饰sirna复合体(使用nj050.14和nj050.15的化学修饰sirna)和0.2ng/ml的干扰素γ(ifnr)，在37℃、5％co2下孵育24小时。接着，从细胞中提取总rna，由总rna合成了cdna。将合成的cdna作为模板，使用cd40引物进行实时pcr，测定了cd40的mrna量。将未添加spg/化学修饰sirna复合体而进行了ifnr处理的试样作为阳性对照，将未添加spg/化学修饰sirna复合体且也未进行ifnr处理的试样作为阴性对照。需要说明的是，cd40的mrna量用作为持家基因的18srrna量进行了校正。另外，为了进行比较，使用经s化的添加了多聚脱氧腺苷酸的nj050.14和nj050.15的化学修饰sirna，同样地进行了试验。

将得到的结果示于图5。在图5中，“nt”是阴性对照，“ifnγ(+)”是阳性对照，“nj050.14裸的”是通过磷酸酯键使40个脱氧腺嘌呤与有义链5’末端连接而成的nj050.14的化学修饰sirna，“nj050.14复合体”是使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，“nj050.15裸的”是通过磷酸酯键使40个脱氧腺苷酸与有义链5’末端连接而成的nj050.15的化学修饰sirna，“nj050.15复合体”是使用了nj050.15的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体。其结果确认了，与使用了nj050.14的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体相比，使用了nj050.15的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体具有同等或良好的基因表达抑制效果。

试验例2

对于使用了nj050.14或nj050.15的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体和使用了表6所示的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，评价了在血清中的稳定性。具体而言，将各spg/化学修饰sirna复合体添加至血清(人血清和fbs)中，使其为1μm，在37℃下孵育16小时。接着，加入与试样等量的te饱和苯酚/氯仿，利用涡漩进行强烈搅拌后，以12000×g进行15分钟离心分离。接着，回收上清液，用分光光度计测定上清液中的核酸浓度，将相当于20ng核酸的量供于使用了15％聚丙烯酰胺凝胶的电泳。对于未分解的化学修饰sirna，使用imagej分析软件进行定量，求出了残留率(％)。

[表6]

将得到的结果示于图6。图6的(a)示出了使用人血清的结果，图6的(b)示出了使用fbs的结果。令人意外的是，与使用了nja050.14的情况相比，使用了nja050.15的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体尽管化学修饰的数量少，但具备与其同等或良好的稳定性。

试验例3

使用利用了nj050.14或nj050.15的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，进行x-vivomlr(混合淋巴细胞培养)测定，评价了细胞增殖抑制效果。具体而言，将使用了nj050.14或nj050.15的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体以0.2μg/只或2μg/只通过尾静脉对balb/c小鼠(雄、9周龄)进行给药。经过20小时后，从balb/c小鼠摘取脾脏，按照常规方法制备了脾脏细胞(5×10⁶细胞/ml)。对得到的脾脏细胞照射15gy的辐射线来进行灭活处理，准备了刺激器(stimulator)细胞。另行摘取c57bl/6小鼠(雄、9周龄)的脾脏，按照常规方法制备脾脏细胞(5×10⁶细胞/ml)，准备了效应器(responder)细胞。在96孔板的各孔中加入刺激器细胞和效应器细胞各100μl，在37℃、5％co2下进行了96小时的混合淋巴细胞反应(mlr)。在反应后，使用cellproliferationelisa,brdu试剂盒(rochelifescence)对细胞进行了细胞增殖测定。需要说明的是，将使用了pbs的试样代替spg/化学修饰sirna复合体作为对照。

将得到的结果示于图7。根据该结果确认了，使用了nj050.15的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体通过更少的化学修饰使稳定性提高，且能够诱导高敲除活性。

试验例4

使用在特定法则下实施了化学修饰的sirna(针对cd40的sirna、人序列用)制备了spg/化学修饰sirna复合体。具体而言，准备通过磷酸酯键使40个经s化的脱氧腺苷酸与表7所示的各种化学修饰sirna的有义链5’末端连接而成的化学修饰sirna，利用上述的方法制备了各种spg/化学修饰sirna复合体。需要说明的是，表7所示的hsicd40(208)的有义链和无义链的碱基序列分别对应于序列号3和4，hsicd40(867)的有义链和无义链的碱基序列分别对应于序列号5和6，hsicd40(1019)的有义链和无义链的碱基序列分别对应于序列号7和8，hsicd40(998)的有义链和无义链的碱基序列分别对应于序列号9和10。

预先对添加了经s化的多聚脱氧腺嘌呤的sirna与spg的复合体的稳定化进行研究的结果是，表7所示的化学修饰模式a-1是所发现的稳定性较高、活性强的修饰模式。对于该化学修饰模式a-1而言，在有义链中，用氟基取代了从5’末端侧起第1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、13、16、17和18位的核糖核苷酸残基的2’位羟基，用甲氧基取代了从5’末端侧起第6、12、14、15和19位的核糖核苷酸残基的2’位羟基。另外，对于该化学修饰模式a-1而言，在无义链中，用氟基取代了由ca、ua和ug组成的二核苷酸序列中的胞苷酸残基和尿苷酸残基的2’位羟基，且用甲氧基取代了该二核苷酸序列中的腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基。

对于表7所示的化学修饰模式a-2而言，在有义链中，全部的胞苷酸残基和尿苷酸残基的2’位羟基被氟基取代，全部的腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基被甲氧基取代。另外，对于该化学修饰模式a-2而言，在无义链中，用氟基取代了由ca、ua和ug组成的二核苷酸序列中的胞苷酸残基和尿苷酸残基的2’位羟基，且用甲氧基取代了该二核苷酸序列中的腺苷酸残基和鸟苷酸残基的2’位羟基。其中，未对无义链的从5’末端侧起第1～7位的核糖核苷酸残基进行修饰。

表7所示的化学修饰模式a-3满足本发明中给定的条件(i)～(ix)。

[表7]

表中，“dt”、“u(f)”、“g(m)”及“a(m)”如上述表1所示。

利用电穿孔法将各spg/化学修饰sirna复合体400nm导入了50万个人外周血单个核细胞(pbmc)中。在导入后，将各细胞接种于48孔板，使其为2×10⁵细胞/孔，同时添加tnfα，使其为2.5ng/ml，在37℃、5％co2下孵育24小时。接着，从细胞中提取总rna，由总rna合成了cdna。将合成的cdna作为模板，使用cd40引物进行实时pcr，测定了cd40的mrna量。将未插入sirna而进行了lps处理的试样作为阳性对照，将未插入sirna且也未进行lps处理的试样作为阴性对照。另外，结果的分析利用δδct法进行，cd40的mrna量用作为持家基因的gapdh量进行了校正。另外，为了进行比较，使用利用了未实施化学修饰的sirna的spg/sirna复合体、及通过磷酸酯键使经s化的40个脱氧腺苷酸与有义链5’末端连接而成的各种化学修饰sirna来代替spg/化学修饰sirna复合体，同样地进行了试验。

将得到的结果示于图8。图8中，“复合体”是指使用了未实施化学修饰的sirna的spg/sirna复合体，“a-1”是指通过磷酸酯键使经s化的40个脱氧腺苷酸与实施了化学修饰模式a-1的化学修饰sirna的有义链5’末端连接而成的sirna，“复合体a-1”是指使用实施了化学修饰模式a-1的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，“a-2”是指通过磷酸酯键使经s化的40个脱氧腺苷酸与实施了化学修饰模式a-2的化学修饰sirna的有义链5’末端连接而成的sirna，“复合体a-2”是指使用实施了化学修饰模式a-2的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，“a-3”是指通过磷酸酯键使经s化的40个脱氧腺苷酸与实施了化学修饰模式a-3的化学修饰sirna的有义链5’末端连接而成的sirna，“复合体a-3”是指使用实施了化学修饰模式a-3的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体。其结果是，在使用spg/化学修饰sirna复合体、且该spg/化学修饰sirna复合体使用实施了化学修饰模式a-3的化学修饰sirna的情况下，基因表达抑制效果最高。

由以上的试验例1～4的结果明确了：通过使用实施了满足本发明中给定的条件(i)～(ix)的化学修饰的化学修饰sirna的spg/化学修饰sirna复合体，对核糖核酸酶的耐性和rnai活性均高，即使在体内使用，也可以发挥充分的基因表达效果。

序列表

<110>日商那帕洁制药股份有限公司（napajenpharma,inc.）

<120>化学修饰sirna

<130>17105wo

<150>jp2016-230640

<151>2016-11-28

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于cd40的sirna的有义链

<400>1

cgugcagugacaaacaguatt21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于cd40的sirna的反义链

<400>2

uacuguuugucacugcacgtt21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(208)的有义链

<400>3

gacagaaacuggugagugatt21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(208)的反义链

<400>4

ucacucaccaguuucuguctt21

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(867)的有义链

<400>5

aguguggccacgugggcaatt21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(867)的反义链

<400>6

uugcccacguggccacacutt21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(1019)的有义链

<400>7

cagaaacaguucaccuugatt21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(1019)的反义链

<400>8

ucaaggugaacuguuucugtt21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(998)的有义链

<400>9

caggagaccuggcacuggatt21

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hsicd40(998)的反义链

<400>10

uccagugccaggucuccugtt21