一种可识别铁离子和磷酸二氢根离子的荧光探针分子及其制备方法和应用与流程

本发明属于离子检测领域，具体涉及一种可识别铁离子、磷酸二氢根离子的荧光探针分子及其制备方法和应用。

背景技术：

对离子具有选择性识别的荧光化学传感器的设计与合成是超分子化学研究的一个活跃领域。在金属离子中，Fe³⁺ 对于人类生存和健康也是至关重要的，Fe³⁺是生物系统中最重要的金属离子之一，在许多生理过程中起到关键作用，包括细胞代谢、酶催化和氧运输，以及DNA和RNA合成。(a)Kim, J. S.; Quang, D. T.Chem. Rev. 2007, 107, 3780–3799;(b)Duke, R. M.; Veale, E. B.; Pfeffer, F. M.; Kruger, P. E.; Gunnlaugsson, T. Chem. Soc. Rev.2010, 39, 3936–3953;(c)Aisen P, W.-R. M.; Leibold, E. A.; Current opinion in chemical biology. 1999, 3, 200–206. Fe³⁺ 异常往往是疾病的标志，如贫血、智力下降、关节炎、心力衰竭、糖尿病和癌症。(d)Narayanaswamy, N.; Govindaraju, T.; Sensors and Actuators B: Chemical. 2012, 161, 304–310;(e)Xu, J. H.; Hou, Y. M.; Ma, Q. J.; Wu, X. F.; Wei, X. J. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc.2013, 112, 116–124.因此，设计对Fe³⁺具有识别作用的分子是特别重要的。目前，分光光度法、原子吸收光谱法、伏安法、原子发射光谱法和荧光分析法已用来检测铁离子。然而这些方法大多需要复杂的仪器以及繁琐的样品制备过程，相比之下，荧光技术具有选择性好、灵敏度高、成本低、简便快捷等优点，提供了一个方便、快捷的检测方式。(f)Ohashi, A.; Ito, H.; Kanai, C.; Imura, H.; Ohashi, K. Talanta. 2005, 65, 525–530;(g)Akatsuka, K.; McLaren, J. W.; Lam, J. W.; Berman, S. S. J. Anal. At. Spectrom.1992, 7, 889–894;(h)Elrod, V. A.; Johnson, K. S.; Coale, K. H. Anal. Chem.1991, 63, 893–898;(i)Tesfaldet, Z. O.; van Staden, J. F.; Stefan, R. I. Talanta.2004, 65, 1189–1195;(j)Valeur , B.; Leray, I.Coordination Chem. Rev. 2000, 205, 3–40;(k)Petrat, F.; Rauen, U.; Groot, de H. Hepatology. 1999, 29, 1171–1179;(m)Li, P.; Ji, C.; Ma, H.; Zhang, M.; Cheng, Y. Chemistry. 2014, 20, 5741–5745;(n)Li, Y.; Gao, Y.; Cao, Y.; Li, H. Sensors and Actuators B: Chemical.2012, 171, 726–733;(o)Qu, X.; Liu, Q.; Ji, X.; Chen, H.; Zhou, Z.; Shen, Z. Chem Commun. 2012, 48, 4600–4602;(p)Wu, X.; Xu, B.; Tong, H.; Wang, L. Macromolecules.2010, 43, 8917–8923. 近年来，有关Fe³⁺的荧光探针分子也越来越多的被报道，但大多荧光探针分子只能在有机溶剂中进行选择性识别，因而不能得到广泛的应用。目前有关在水溶液中选择识别Fe³⁺的荧光探针分子的报道比较少。

化学传感器探针的开发与研究在生物、环境、化工等领域具有重要的意义。而荧光化学传感器由于能够实现快速检测，并且成本较低，已经成为非常受欢迎的检测分析手段。从生物学的角度来看，磷酸二氢根离子被认为在代谢过程中是必不可少的，磷酸二氢根离子在信号转导、储能和构建DNA和RNA的骨架中起关键作用。设计合成对磷酸二氢根离子具有识别作用的探针分子具有很重要的意义。(q)Zhang, D.; Jiang, X.; Yang, H.; Martinez, A.; Feng, M.; Dong, Z.; Gao, G. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 3375–3381;(r)Jadhav, J. R.; Bae, C. H.; Kim, H. S.; Tetrahedron letters. 2011, 52, 1623–1627;(s)Lee, G. W.; Singh, N.; Jung, H. J.; Jang, D. O.; Tetrahedron Letters.2009, 50, 807–810;(t)Xu, Z.; Xiao, Y.; Qian, X.; Cui, J.; Cui, D. Org. Lett. 2005, 7, 889–892.而目前大多数报道的H2PO4^-荧光传感器的荧光响应多是荧光淬灭或增强。事实上，在实际应用中，一些可变因素，如光漂白、传感器分子浓度和传感器分子周围的微环境也可能导致荧光淬灭或增强。相反，荧光红移可作为阴离子检测的新策略。(u)Eshghi, H.; Rahimizadeh, M.; Hasanpour, M.; Bakavoli, M. Research on Chemical Intermediates.2014, 41, 4187–4197; (v)Zhang, D.; Cochrane, J. R.; Martinez, A.; Gao, G. Rsc Adv. 2014, 4, 29735–29749。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可识别铁离子、磷酸二氢根离子的荧光探针分子及其制备方法和应用。该荧光探针分子可选择性识别铁离子、磷酸二氢根离子，对Fe³⁺的最低检测限可以达到4.43×10^-6 M (0.247 mg/L)，对H2PO4^-的最低检测限可以达到2.89×10^-7 M。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一、荧光探针分子及其制备

本发明荧光探针分子，化学名称为：(1²Z,5²Z)-1¹H,5¹H-8,11-二氧杂-3(4,5)-吖啶-1,5(3,1)-双咪唑-3-鎓大环十三蕃-1³,5³-双鎓六氟磷酸盐；其结构式如下：

合成步骤：。

荧光探针分子的合成方法：首先根据已知参考文献合成了1,2-双（2-（1H-咪唑-1-基）乙氧基）乙烷原料1与4,5-二溴甲基吖啶原料2，（w）Eshghi, H.; Rahimizadeh, M.; Hasanpour, M.; Bakavoli, M. Research on ChemicalIntermediates.2014, 41, 4187–4197；（x）Hasanpour, M.; Eshghi, H.; Bakavoli, M.; Mirzaeia, M.; J. Chi. Chem. Soc. 2015, 62, 412–419；（y）Zhang, D.; Jiang, X.; Yang, H.; Martinez, A.; Feng, M.; Dong, Z.; Gao, G. Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 3375–3381.然后以氯仿为溶剂，使4,5-二溴甲基吖啶与1,2-双（2-（1H-咪唑-1-基）乙氧基）乙烷以1:1的摩尔比反应（如式1所示），反应温度控制在50~60 ℃，氮气保护下反应4~6天，后加入3当量的六氟磷酸铵，常温反应20-30h，析出固体，过滤，洗涤，得到淡黄色固体。

式1

其中：将反应物分别缓慢滴入反应体系中，通过高度稀释法，从而减少副反应的产生。

二、荧光探针分子的荧光性能

将荧光探针分子配制成1.0×10^-5mol/L的水溶液进行对金属离子的荧光光谱性质测试。激发狭缝宽度为2.5 nm，发射狭缝5.0nm，电压为700 V，进行荧光发射光谱扫描。另将荧光探针分子配制成0.5×10^-5 mol/L的乙腈溶液对阴离子进行荧光光谱性质测试。激发狭缝宽度为5.0 nm，发射狭缝5.0nm，电压为700 V，进行荧光发射光谱扫描。

1、荧光探针分子在不同含水量的乙腈混合溶剂中的荧光强度研究

将荧光探针分子在不同含水量的乙腈混合溶剂中配制成浓度为1.0×10^-5 mol/L的检测液。以360 nm为激发波长，扫描荧光探针分子的发射谱图。如图1，随着加入水的比例逐渐增大，荧光强度呈现先增大后减小。当在CH3CN:H2O (V:V=1:49)体系时，荧光强度达到最大，因此以CH3CN:H2O (V:V=1:49)混合溶剂进行后续的阳离子识别测试。

2、荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-荧光识别

将荧光探针分子在CH3CN:H2O (V:V=1:49)混合溶剂下配制成浓度为1.0×10^-5 mol/L。向荧光探针分子溶液中加入100当量的不同金属离子(Al³⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)。当向荧光探针分子溶液中加入Fe³⁺时，荧光强度发生了淬灭；而滴入其它阳离子（Al³⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺）时，荧光探针的荧光基本没有变化。如图2所示。可以清楚看出，只有Fe³⁺的加入，荧光探针分子的荧光强度发生了淬灭，说明荧光探针分子在乙腈水溶液中可以高效选择性识别Fe³⁺。

另将荧光探针分子在乙腈中配制成浓度为0.5×10^-5 mol/L。向荧光探针分子溶液中加入10当量的不同阴离子(F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO4^-、AcO^-、OH^-、ClO4^-、H2PO4^-)。当向荧光探针分子溶液中加入H2PO4^-时，荧光光谱发生了红移；而滴入其它阴离子（F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO4^-、AcO^-、OH^-、ClO4^-）时，受体分子的荧光光谱基本没有变化。如图4所示。可以清楚看出，只有H2PO4^-的加入，荧光探针分子的荧光光谱发生了红移，说明荧光探针分子在乙腈中可以高效选择性识别H2PO4^-。

3、荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-识别的抗干扰性

对离子识别的受体来说，抗干扰性能是一个非常重要的指标，为了研究荧光探针分子对Fe³⁺识别的抗干扰性能，我们做了如下的抗干扰实验：将100当量的不同金属离子(Al³⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺)分别加入荧光探针分子(c=1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)的水溶液后，再将100当量的Fe³⁺分别加入上述体系中，进行荧光测试。实验结果与只加入Fe³⁺的现象是相同的。选取荧光光谱中455 nm处的荧光强度数据做柱状图。如图2所示，我们可以清晰的看到，其他阳离子对Fe³⁺的识别没有干扰。因此，荧光探针分子可以高效选择性识别Fe³⁺。

为了研究荧光探针分子对H2PO4^-识别的抗干扰性能，我们做了如下的抗干扰实验：将10当量的不同阴离子(F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO4^-、AcO^-、OH^-、ClO4^-)分别加入荧光探针分子(c=0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液中后，再将10当量的H2PO4^-加入上述体系中，进行荧光测试。实验结果与只加入H2PO4^-的现象是相同的。如图4所示，我们可以清晰的看到，其他阴离子对H2PO4^-的识别没有干扰。因此，荧光探针分子可以高效选择性识别H2PO4^-。

4、荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-的荧光滴定

为了进一步探究荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-的作用趋势，我们进行了荧光发射光谱滴定实验。荧光探针分子对Fe³⁺的荧光滴定：移取2 mL荧光探针分子(c=1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)的水溶液于4 mL离心管，分别依次加入不同当量的Fe³⁺的水溶液，静置，进行荧光测试。如图3a所示，随着Fe³⁺的加入，荧光光谱在455nm处的荧光强度逐渐减弱；当加入150当量Fe³⁺时，荧光强度完全淬灭。荧光探针分子对H2PO4^-的荧光滴定：移取2 mL荧光探针分子(c=0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液于4 mL离心管，分别依次加入不同当量的H2PO4^-的乙腈溶液，静置，进行荧光测试。如图5a所示，随着H2PO4^-的加入，荧光光谱在434 nm的荧光强度逐渐减弱，在515 nm的荧光强度逐渐增强，荧光光谱发生了明显地红移。

5、荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-的荧光最低检测限

根据3σ/k方法计算荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-的荧光光谱最低检测限分别可以达4.43×10^-6 M (0.247 mg/L)和2.89×10^-7 M。如图6所示，因此，该荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-的检测具有较高的灵敏度。

6、荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-的结合常数测定

根据Job’splots方程和Benesi-Hildebrand方程可计算出荧光探针分子对Fe³⁺的结合常数及结合比。以Fe³⁺浓度的倒数为横坐标，以 (F0-F) 的倒数为纵坐标作图(如图7和8)。(F0-F) 的倒数与Fe³⁺浓度的倒数呈现线性关系，R²为0.99。因此表明荧光探针分子与Fe³⁺的结合比为1: 1，结合常数为3.094×10³ M^-1。根据Job’splots方程可计算出荧光探针分子对H2PO4^-的结合比(如图7)，结果表明荧光探针分子与H2PO4^-的结合比为1: 1。以H2PO4^-的浓度为横坐标，以 (F-F0)/ (Fmax-F0)为纵坐标作图。(F-F0)/ (Fmax-F0)与H2PO4^-的浓度呈现线性关系(如图9)，R²为0.99。经计算得结合常数为5.37×10⁴ M^-1。

附图说明

图1 荧光探针分子(c=1.0×10^-5 mol/L)在含有不同水的乙腈溶液中的荧光发射光谱(λex=360 nm)及波长在455 nm处的荧光强度柱状图；

图2 荧光探针分子(1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)的水溶液中，加入100 equiv.不同阳离子(Al³⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺, c=10.0×10^-3 mol/L)的荧光发射光谱图；荧光探针分子(1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)的水溶液中对Fe³⁺(c=10.0×10^-3 mol/L)识别的抗干扰柱状图；

图3a 荧光探针分子(1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)的水溶液中对Fe³⁺的荧光滴定图；图3b为在455 nm处的荧光强度变化图；

图4 荧光探针分子(0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液中，加入10 equiv.不同阴离子 (F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO4^-、AcO^-、OH^-、ClO4^-、H2PO4^-, c=5.0×10^-3 mol/L)的荧光发射光谱图和荧光探针分子(0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液中对H2PO4^- (c=5.0×10^-3 mol/L)识别的抗干扰图；

图5a 荧光探针分子(0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液中对H2PO4^-的荧光滴定图；图5b为在434和515nm处的荧光强度变化图；

图6 荧光探针分子分别与Fe³⁺和H2PO4^-的线性相关曲线；

图7 荧光探针分子对Fe³⁺和H2PO4^-的Job’splots工作曲线；

图8 荧光探针分子(1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)的水溶液对Fe³⁺的Benesi-Hildebrand曲线；

图9 荧光探针分子(0.5×10^-5 mol/L)的CH3CN溶液对H2PO4^-的结合常数图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明荧光探针分子的合成、结构及对铁离子和磷酸二氢根离子识别的方法进行了详细的说明。

1、荧光探针分子的制备

以氯仿为溶剂，使4,5-二溴甲基吖啶与1,2-双（2-（1H-咪唑-1-基）乙氧基）乙烷以1:1的摩尔比反应，反应温度控制在50~60 ℃，氮气保护下反应4~6天，后加入3当量的六氟磷酸铵，常温反应20-30h，析出固体，过滤，洗涤，得到淡黄色固体。产率为57%，mp >250 ℃。

2、荧光探针分子的结构表征

荧光探针分子的NMR、HRMS、IR数据如下：¹H NMR (400 MHz, CD3CN) δH 3.64 (s, 4H, C-CH2), 3.79-3.77 (m, 4H, C-CH2), 4.26-4.24 (m, 4H, N-CH2), 5.97 (s, 4H, Ar-CH2), 7.26 (s, 2H, C=CH), 7.37 (s, 2H, C=CH), 7.76-7.72 (m, 2H, Ar-H), 7.98 (d, 2H, J = 6.7 Hz, Ar-H), 8.31 (d, 2H, J = 8.6 Hz, Ar-H), 8.55 (s, 2H, N=CH), 9.20 (s, 1H, Py-H). ¹³C NMR (101 MHz, CH3CN) δ 49.36, 49.66, 68.00, 69.62, 121.98, 123.18, 126.02, 126.93, 130.46, 130.74, 133.22, 135.87, 138.39, 146.19. HRMS (ESI): C27H29N5O2P2F12, (3+PF6^-)测定值600.1957, 真实值600.1979; M/2测定值227.6155, 真实值227.6163. IR (neat): νmax (cm^-1) = 837, 557.

3、荧光探针受体分子的识别性能研究

在光谱分析实验中，精确称量一定量的受体，用光谱级乙腈溶解后，再加入二次蒸馏水，配制成浓度为1.0×10^-5 mol/L的 CH3CN:H2O (V:V=1:49)溶液。各种用于检测分析的金属离子用二次蒸馏水配成10.0×10^-3 mol/L。在室温下进行各种测试，荧光测定中，激发波长为360 nm，激发狭缝2.5 nm，发射狭缝5.0 nm；另精确称量一定量的受体，用光谱级乙腈溶解，配制成浓度0.5×10^-5 mol/L的溶液。各种用于检测分析的阴离子均用光谱纯乙腈配成5.0×10^-3 mol/L。在室温下进行各种测试，荧光测定中，激发波长为365 nm，激发狭缝5.0 nm，发射狭缝5.0 nm。

4、荧光探针受体分子识别Fe³⁺的选择性研究

在荧光测试实验中，用移液枪移取2.0 mL的荧光探针分子(1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)水溶液至带有编号的4mL离心试管，分别向各离心试管移取等当量的不同金属阳离子(Al³⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺, c=10.0×10^-3 mol/L)，进行荧光光谱测试。

5、荧光探针受体分子识别Fe³⁺的滴定

在荧光滴定实验中，用移液枪移取2.0 mL的荧光探针分子(1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)水溶液至带有编号的4mL离心试管，分别向各离心试管移取不同当量的三价铁离子(0.00 eq~200.0 eq, c=10.0×10^-3 mol/L)，进行荧光光谱测试。

6、荧光探针受体分子识别Fe³⁺的抗干扰研究

在4 mL离心试管中加入2 mL的荧光受体分子(1.0×10^-5 mol/L)的CH3CN:H2O (V:V=1:49)的水溶液，分别加入100当量其它的金属离子(Al³⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺, c=10.0×10^-3 mol/L)后，再加入100当量Fe³⁺，分别测定其荧光强度，绘制不同金属阳离子在455 nm处的荧光强度柱状图，结果证明，其它金属阳离子不干扰体系对Fe³⁺的检测。

7、荧光探针受体分子识别H2PO4^-的选择性研究

在荧光测试实验中，用移液枪移取2.0 mL的荧光探针分子(0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液至带有编号的4mL离心试管中，分别向各离心试管移取等当量的不同阴离子 (F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO4^-、AcO^-、OH^-、ClO4^-、H2PO4^-, c=5.0×10^-3 mol/L)，进行荧光光谱测试。

8、荧光探针受体分子识别H2PO4^-的滴定

在荧光滴定实验中，用移液枪移取2.0 mL的荧光探针分子(0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液至带有编号的4mL离心试管中，分别向各离心试管移取不同当量的H2PO4^-离子(0.00 eq~10.0 eq, c=5.0×10^-3 mol/L)，进行荧光光谱测试。

9、荧光探针受体分子识别H2PO4^-的抗干扰研究

在4 mL离心试管中加入2 mL的荧光受体分子(0.5×10^-5 mol/L)的乙腈溶液，分别加入10当量其它的阴离子 (F^-、Cl^-、Br^-、I^-、HSO4^-、AcO^-、OH^-、ClO4^-, c=5.0×10^-3 mol/L)后，再加入10当量H2PO4^-，分别进行荧光光谱测试，结果证明，其它阴离子不干扰体系对H2PO4^-的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。