本发明涉及的是一种低分子量肝素的制备方法，属于生化技术领域。
背景技术：
肝素抗凝活性取决于它与丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III(AT)的相互作用。在与肝素结合的过程中，AT发生了一种构象变化，增强了其不可逆转的抑制凝血酶的能力，包括凝血酶和因子Xa。肝素-AT相互识别是研究较为透彻的多糖和蛋白相互作用的实例。肝素和AT的识别和依赖于肝素中特定的肝素五糖结构区域。而这特定的肝素五糖在结构上的主要特征是在五糖中间的氨基葡萄糖残基存在3-O硫酸基修饰。低分子量肝素三位硫酸化修饰的片段减少，分子量降低，所以活性降低，但是安全性增加。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种能提高生物活性和安全性的低分子量肝素的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种低分子量肝素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交联；
b）交联后凝胶加入8—12倍体积46—54mM磷酸钠缓冲液，pH7.2—7.5，溶胀后吸去上清；
c）肝素溶在1—1.5倍体积缓冲液中，0.5—1.5mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌3—10min后，静置15—35min，吸去上清；
d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按1—5mg肝素加入2 mU肝素酶II的比例，在水浴中35—40 ℃搅拌水解2—5h；
e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；
f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；
g）上清浓缩后过用纯净水bio gel P2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。
作为优选：所述的步骤b）中，交联后凝胶加入10倍体积50mM磷酸钠缓冲液，pH7.4，溶胀后吸去上清；
所述的在步骤c）中，肝素溶在1倍体积缓冲液中，1mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌5min后，静置20min，吸去上清；
所述的步骤d）中，肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按3mg肝素加入2 mU肝素酶II的比例，在水浴中37 ℃搅拌水解4h。
本发明采用肝素酶对肝素进行选择性酶切，得到具有新颖结构的低分子量肝素。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
和普通低分子量肝素不同的是每个低分子量肝素的片段中均含有一个活性中心；完全酶解后，和普通低分子量肝素相比，三位硫酸化四糖的含量提高1.5倍，产物抗凝血活性提高了一倍。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种低分子量肝素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交联；
b）交联后凝胶加入8—12倍体积46—54mM磷酸钠缓冲液，pH7.2—7.5，溶胀后吸去上清；
c）肝素溶在1—1.5倍体积缓冲液中，0.5—1.5mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌3—10min后，静置15—35min，吸去上清；
d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按1—5mg肝素加入2 mU肝素酶II的比例，在水浴中35—40 ℃搅拌水解2—5h；
e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；
f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；
g）上清浓缩后过用纯净水bio gel P2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。
作为一种最佳实施例：本发明所述的一种低分子量肝素的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
a）Phe-Leu-Asn-Gln-Asp和sepharose交联；
b）联后凝胶加入10倍体积50mM磷酸钠缓冲液，pH7.4，溶胀后吸去上清；
c）肝素溶在1倍体积缓冲液中，1mg凝胶配比3mg肝素的比例上样，上样后玻璃棒搅拌5min后，静置20min，吸去上清；
d）肝素的活性中心位点吸附在凝胶的五肽上后，按3mg肝素加入2 mU肝素酶II的比例，在水浴中37 ℃搅拌水解4h。
e）肝素游离的部分就被随机部分水解，水解后4000rpm离心，取沉淀；
f）沉淀中加入一倍体积的1M的NaCl溶液后离心，取上清；
g）上清浓缩后过用纯净水bio gel P2柱子，自动部分收集，220nm紫外检测，去掉盐分，收集有紫外吸收部分合并，冻干即得。
本发明的其它实施例可以在上述实施例的基础上，通过数值替换和惯用手段的替换等可以获得无数个具体实施例，且本领域技术人员在了解本发明的基础上，能够方便地实施本发明。