本发明涉及荧光探针领域，尤其涉及一种化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
小分子探针是指针对某种特定目标生物分子或生物离子开发的探测器，小分子探针能与特定的靶分子进行特异性相互作用，并能被特殊的检测技术所探知。与普通的检测技术相比，探针技术具有灵敏度高、专一性强、快速准确等优点，适用于分子影像和实时监测。
g-四链体dna结构是由富含鸟嘌呤(g)的核酸序列所形成的一种特殊二级结构，g-四链体dna作为核糖核酸的重要组成部分，这使得许多生物学的功能都与g-四链体dna密切相关，科学家认为g-四链体dna是潜在的药物靶点。由于g-四链体dna荧光探针具有较好的g-四链体dna选择性，较强的光学性能和良好的生物相容性等优点，使其成为研究体内g-四链体dna存在与分布，结构与功能的重要工具。因此，开发性能优异的g-四链体dna荧光探针对深入研究g-四链体dna的结构与功能有着十分重要的意义。g-四链体dna荧光探针具有在复杂的溶液体系中或者活细胞环境中高选择性、特异性地识别g-四链体dna的优点，在g-四链体dna分析与检测领域具有很好的应用前景。目前g-四链体dna荧光探针已经发现了多种，但是只针对特定的一种g-四链体dna进行识别的荧光探针还发现的很少，而且g-四链体dna荧光探针在实际成像应用中存在一些缺陷，例如与g-四链体dna响应速度较慢、光致毒性大和光稳定性差等缺点，这些缺陷影响其应用价值。因此，开发性能优越，靶向性强的小分子荧光探针具有很强的市场价值。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种化合物及其制备方法和应用，本发明提供的化合物作为检测g-四链体dna的荧光探针，不仅低毒，光稳定性好，而且能够特定的选择一种g-四链体dna进行识别。
本发明提供了一种化合物，具有式(i)所示结构，
其中，所述r1选自c1-6的烷胺基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基或吡噁啉基。
优选的，所述化合物具有式(i-a)结构，
本发明还提供了一种化合物的制备方法，包括：
将式(ii)结构的化合物与式(iii)结构的化合物反应，得到式(i)结构的化合物，
其中，所述r1选自c1-6的烷胺基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基或吡噁啉基。
优选的，所述式(ii)结构的化合物由式(iv)结构的化合物与r1-h反应得到，
其中，x为氯、溴或碘。
优选的，所述式(iv)结构的化合物由式(v)结构的化合物和式(vi)结构的化合物反应得到，
其中，x为氯、溴或碘。
优选的，所述式(v)结构的化合物由式(vii)结构的化合物与碘甲烷反应得到，
优选的，所述式(vi)结构的化合物由式(viii)结构的化合物与1，3-二卤代烷反应得到，
本发明还提供了一种本发明所述的化合物在在制备检测g-四链体dna的荧光探针中的应用。
优选的，所述g-四链体dna为水溶液中的g-四链体dna、凝胶中的g-四链体dna、细胞质中的g-四链体dna或核仁中g-四链体dna。
优选的，所述g-四链体dna为pu27g-四链体dna。
与现有技术相比，本发明提供了一种化合物及其制备方法和应用，本发明提供的化合物作为荧光探针，能够选择性的识别g-四链体dna，其与功能相近的荧光探针比，本发明所述探针具有选择性强，低生物毒性、膜通透性好、显色强、复染兼容性好、光稳定性较强的特点，预示其作为g-四链体dna和核仁荧光探针具有广泛的应用，有望开发为g-四链体dna和核仁相关的生理和病理学研究用简捷、直观的生物检测试剂，实验结果表明，本发明提供的化合物作为荧光探针，其标记后的荧光图像显示在细胞质和核仁区有明显的红光分布，说明该探针能够在活细胞中专一性的成像胞质和核仁中的g-四链体dna。
附图说明
图1为式(i)化合物的氢谱；
图2为式(i)化合物的碳谱；
图3为式(i)化合物的质谱图；
图4为式(i)化合物荧光探针滴定4a4t、ds26、ds12、ckit2、pu27、oxy28、myc22-g14t/g23t、myc-1245、myc-2345、oxy12、htg22、telo21、vegf、hras、pu22、rna的荧光数据的拟合曲线；
图5为探针式(i)化合物滴定4a4t、ckit2、myc22-g14t/g23t、htg22的荧光滴定图；
图6为探针式(i)化合物滴定ds26、ds12、myc-1245、myc-2345的荧光滴定图；
图7为探针式(i)化合物滴定oxy28、oxy12、hras和rna的荧光滴定图；
图8为探针式(i)化合物滴定pu27、telo21、vegf和dt21的荧光滴定图；
图9为式(i)化合物探针滴定pu27的荧光滴定图；
图10为式(i)化合物探针滴定pu27的荧光光谱中pu27的浓度与(f-f0)/f0拟合的曲线；
图11为式(i)化合物探针与染料dapi复染pc3细胞的细胞成像图；
图12为式(i)化合物探针与dt21、ds26、4a4t、pu27、oxy28、telo21六种核酸的凝胶电泳图；
图13为式(i)化合物探针与dt21、ds26、4a4t、pu27、telo21、oxy28、ckit2七种核酸和空白对照在紫外灯下溶液的图。
具体实施方式
本发明提供了一种化合物，具有式(i)所示结构，
其中，所述r1选自c1-6的烷胺基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基或吡噁啉基。
按照本发明，所述化合物具体为式(i-a)结构，
按照本发明，本发明还提供了一种化合物的制备方法，，包括：
将式(ii)结构的化合物与式(iii)结构的化合物反应，得到式(i)结构的化合物，
其中，，所述r1选自c1-6的烷胺基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基或吡噁啉基。
按照本发明，本发明将将式(ii)结构的化合物与式(iii)结构的化合物反应，得到式(i)结构的化合物，其中，本发明对反应的条件并没有特殊要求，本领域技术人员可以根据本领域公知常识选择合适的反应条件，其中，所述反应的温度优选为130～150℃，更优选为135～145℃；所述反应的时间优选为3～4小时；本发明对式(iii)结构化合物的来源没有特殊要求，可以购买也可以自制。
本发明中，所述式(ii)结构的化合物优选由式(iv)结构的化合物与r1-h反应得到，
所述r1-h优选为甲胺、乙基胺、丙基胺、丁基胺、戊基胺、己基胺、吡咯、哌啶、吗啉、哌嗪或吡噁啉，更优选为吡咯。本发明对反应的条件也没有特殊要求，本领域技术人员可以根据公知常识选择合适的反应条件。
本发明中，所述式(iv)结构的化合物优选由式(v)结构的化合物和式(vi)结构的化合物反应得到，
其中，本发明对反应的条件没有特殊要求，本领域技术人员可以根据公知常识选择合适的反应条件。
本发明中，所述式(v)结构的化合物优选由式(vii)结构的化合物与碘甲烷反应得到，
其中，本发明对反应的条件没有特殊要求，本领域技术人员可以根据公知常识选择合适的反应条件。
本发明中，所述式(vi)结构的化合物优选由式(viii)结构的化合物与1，3-二卤代烷反应得到，
其中，所述1，3-二卤代烷优选为1，3-二溴丙烷；本发明对反应的条件没有特殊要求，本领域技术人员可以根据公知常识选择合适的反应条件。
具体的，本发明合成式(i-a)化合物的反应流程如下：
本发明还提供了一种本发明所述的式(i)结构的化合物在制备检测g-四链体dna的荧光探针中的应用；其中，所述g-四链体dna优选为水溶液中的g-四链体dna、凝胶中的g-四链体dna、细胞质中的g-四链体dna或核仁中的g-四链体dna；所述g-四链体dna为pu27g-四链体dna。
本发明提供了一种化合物及其制备方法和应用，本发明提供的化合物作为荧光探针，能够选择性的识别g-四链体dna，其与功能相近的荧光探针比，本发明所述探针具有选择性强，低生物毒性、膜通透性好、显色强、复染兼容性好、光稳定性较强的特点，预示其作为g-四链体dna和核仁荧光探针具有广泛的应用，有望开发为g-四链体dna和核仁相关的生理和病理学研究用简捷、直观的生物检测试剂，实验结果表明，本发明提供的化合物作为荧光探针，其标记后的荧光图像显示在细胞质和核仁区有明显的红光分布，说明该探针能够在活细胞中专一性的成像胞质和核仁中的g-四链体dna。
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：化合物1a的合成
往25ml圆底烧瓶里称取4-氯二甲基喹啉0.2g(1.130mmol)，加入6倍摩尔量的碘甲烷约1.2g，环丁砜5.0ml，将混合物加热到60℃，反应6个小时后，冷却，加入乙酸乙酯后震荡，抽滤，固体用乙酸乙酯洗涤，真空干燥后称重，薄层色谱法初步表明没有副产物，得到1.82g纯品1a，化学结构式如下，产率为88.6％。
利用核磁共振对实施例1中得到的化合物1a进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1hnmr(400mhz，dmso)δ8.67(d，j＝9.0hz，1h)，8.58-8.50(m，2h)，8.33(ddd，j＝8.7，7.1，1.3hz，1h)，8.11(dd，j＝13.4，5.7hz，1h)，4.43(s，3h)，3.07(s，3h)。
利用质谱仪对实施例1中得到的化合物1a进行分析，得到其质谱结果：esi-msm/z：192.6[m-i]+。
实施例2：化合物1b的合成
往25ml圆底烧瓶里称取2-甲基苯并噻唑0.4g(1.56mmol)，1，3-二溴丙烷0.4ml(2mmol)，为粉白色色固体，将混合物加热到100℃，反应12个小时后，冷却，加入乙酸乙酯后震荡，抽滤，固体用乙酸乙酯洗涤，真空干燥后称重，薄层色谱法初步表明没有副产物，化学结构式如下，纯品1b，产率为98.2％。
利用核磁共振对实施例2中得到的化合物1b进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1hnmr(400mhz，dmso)δ8.67(d，j＝9.0hz，1h)，8.57-8.51(m，2h)，8.33(ddd，j＝8.7，7.1，1.3hz，1h)，8.12(t，j＝7.7hz，ih)，4.43(s，3h)，3.07(s，3h)。
利用质谱仪对实施例3中得到的化合物1b进行分析，得到其质谱结果：esi-msm/z：269.9[m-br]+。
实施例3：化合物2a的合成
称取0.200g(1.03mmol)的1a于25ml的圆底烧瓶中，加入1倍摩尔量的1b0.280g、甲醇5.0ml、碳酸氢钠1ml，在40℃下反应5个小时，冷却后抽滤，用乙酸乙酯和冰水配置的混合溶液洗涤固体，真空干燥称重后得0.384g，为红色固体即为化合物2a，其结构式如下，产率90.1％。
利用核磁共振对实施例3中得到的化合物2a进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1hnmr(400mhz，dmso)δ8.83-8.66(m，1h)，8.21(d，j＝8.6hz，1h)，8.07-7.94(m，2h)，7.82-7.69(m，2h)，7.61(t，j＝7.7hz，1h)，7.50-7.33(m，2h)，6.85(s，ih)，4.64(d，j＝22.7hz，2h)，4.09(s，3h)，3.88-3.72(m，2h)，2.85(d，j＝27.9hz，3h)，2.35(d，j＝6.6hz，2h)。
利用质谱仪对实施例3中得到的化合物2a进行分析，得到其质谱结果：esi-msm/z：425.10[m-i]+。
实施例4：化合物3a的合成
往25ml圆底烧瓶里称取2a0.200g(0.469mmol)，吡咯烷0.2ml(2.8mmol).二甲基亚砜0.5ml，在40℃反应48小时，冷却后用乙酸乙酯抽滤，真空干燥称重后得0.170g，为暗红色固体即为化合物3a，其结构式如下，产率为83.9％。
利用核磁共振对实施例8中得到的化合物3c进行分析，得到其核磁共振氢谱结果：1hnmr(400mhz，dmso)δ8.61(d，j＝8.2hz，1h)，8.16(d，j＝8.7hz，1h)，8.05-7.92(m，2h)，7.73(dd，j＝14.3，7.7hz，2h)，7.58(t，j＝7.5hz，1h)，7.39(t，j＝7.6hz，1h)，7.31(s，1h)，6.96(s，1h)，4.61(t，j＝6.5hz，2h)，4.05(s，3h)，2.88(d，j＝13.7hz，3h)，2.33(d，j＝22.6hz，4h)，1.99(dd，j＝12.5，6.2hz，2h)，1.65(s，4h).
利用质谱仪对实施例8中得到的化合物2e进行分析，得到其质谱结果：esi-msm/z：416.26[m-i]+。
实施例5：式(i)化合物的合成
往25ml圆底烧瓶里称取化合物3a0.2g(0.37mmol)，加入0.2g(0.73mmol)4-二苯胺基苯甲醛，正丁醇10.0ml，四甲基哌啶0.1ml。将混合物加热到135℃，反应3个小时后，冷却，加入乙酸乙酯后震荡，抽滤，固体用乙酸乙酯洗涤，真空干燥后称重，薄层色谱法初步表明没有副产物，得到0.259g纯品式(i)化合物，化学结构式如下，产率为87.7％。
利用核磁共振对实施例5中得到的化合物式(i)化合物进行分析，结果见图1～图2，图1为式(i)化合物的氢谱，图2为式(i)化合物的碳谱；
图1的核磁共振氢谱结果：1hnmr(400mhz，dmso)δ8.62-8.53(m，1h)，8.18-8.10(m，1h)，8.07-8.01(m，1h)，8.00-7.93(m，1h)，7.81(d，j＝8.7hz，2h)，7.71(s，2h)，7.60(s，3h)，7.40(t，j＝7.9hz，5h)，7.17(s，2h)，7.12(d，j＝7.6hz，4h)，7.00(d，j＝8.8hz，3h)，4.69-4.56(m，2h)，4.12(s，3h)，2.50-2.47(m，2h)，2.39(s，4h)，2.05-1.95(m，2h)，1.67(s，4h)。
图2的核磁共振碳谱结果：13cnmr(101mhz，dmso)δ159.22(s)，152.69(s)，149.75(s)，147.94(s)，146.84(s)，141.12(s)，140.70(s)，139.57(s)，133.61(s)，130.37(d，j＝16.9hz)，128.94(s)，128.49(s)，125.54(s)，125.27(s)，124.69(d，j＝15.5hz)，124.34(s)，123.99(s)，121.69(s)，119.42(s)，119.07(s)，108.39(s)，53.93(s)，52.49(s)，38.44(s)，23.67(s)。
利用质谱仪对实施例5中得到的化合物式(i)化合物进行分析，结果见图3，图3为式(i)化合物的质谱图，从图中得到其质谱结果：esi-msm/z：671.3[m-i]+。
实施例6：式(i)化合物荧光探针对不同核酸选择性的荧光光谱实验
将5mm的化合物储备液稀释成5um的浓度，再加入不同种类的核酸用荧光分光光度计(狭缝宽度10nm，扫描速度400nm/min，激发波长454nm)测出其各自的荧光强度，结果见图4，图4为式(i)化合物荧光探针滴定4a4t、ds26、ds12、ckit2、pu27、oxy28、myc22-g14t/g23t、myc-1245、myc-2345、oxy12、htg22、telo21、vegf、hras、pu22、rna的荧光数据的拟合曲线，从图中可以看出，荧光探针对pu27g-四链体dna具有较高的荧光强度，而对其他的双链、单链和g-四链体dna荧光强度较弱。随着核酸浓度的增加，荧光强度逐渐增强，且该荧光探针与pu27g-四链体dna相结合荧光强度较强，与其他核酸结合荧光相对弱，说明其对g-四链体有明显的选择性。
选择性实验中所使用的核酸
实施例7：荧光探针式(i)化合物对不同核酸的荧光滴定实验
将5mm的化合物储备液稀释成5mm的浓度，放置于荧光分光光度计中，逐渐增加溶液中不同核酸的浓度，并进行荧光强度测定。测定条件为：狭缝宽度10nm，扫描速度400nm/min，激发波长454nm。结果见图5～图9，图5为探针式(i)化合物滴定4a4t、ckit2、myc22-g14t/g23t、htg22的荧光滴定图，图6为探针式(i)化合物滴ds26、ds12、myc-1245、myc-2345的荧光滴定图，图7为探针式(i)化合物滴定oxy28、oxy12、hras和rna的荧光滴定图；图8为探针式(i)化合物滴定pu27、telo21、vegf和dt21的荧光滴定图；从图5～图8可以看出，式(i)化合物对g-四链体dna：pu27具有荧光选择性。
荧光滴定实验中所使用的核酸
实施例8：荧光探针式(i)化合物对pu27检测限的测定
将5mm的化合物储备液稀释成5mm的浓度，再在荧光分光光度计(狭缝宽度10nm，扫描速度200nm/min，激发波长454nm)扫描，再往其中慢慢加入pu27做到使其饱和，结果见图9～图10，图9为式(i)化合物探针滴定pu27的荧光滴定图；图10为式(i)化合物探针滴定pu27的荧光光谱中pu27的浓度与(f-f0)/f0拟合的曲线。
检测限的计算公式
lod＝k×sb/m
lod(化合物的结合常数)，m是浓度c与(f-f0)/f0的所做直线的斜率，sb为用仪器空白多次测量的标准偏差，k值按照国际纯粹和应用化学联合会建议通常取为3，由图10计算的检测限lod为81nmol/l，其较低的检测限说明该荧光配体有较高的灵敏度，有很好的商业价值。
实施例9：化合物式(i)化合物的细胞成像实验
先将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为5000个/ml，然后在37℃、5％co2环境中培养70h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×pbs洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5ml常温避光放置2min，最后弃去纯甲醇并再用预冷的1×pbs洗3次，加入1ml的5mm的化合物然后放置20min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×pbs洗3次，在上述6孔板中加入1mm的dapi溶液1ml并37℃放置2min，然后再用预冷的1×pbs洗6次，每次浸泡5min。在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况。
结果见图11，图11为式(i)化合物探针与染料dapi复染pc3细胞的细胞成像图，从图11可知，该荧光探针作用于细胞核及细胞质内的g-4dna，同时也证明了该系荧光配体能够在细胞体系对g-4dna进行成像和检测。
实施例10：核酸凝胶电泳实验
电泳缓冲液与溶液的配置：用27gtris，13.5g硼酸和2.0811gedta得到5×tbe电泳缓冲液、10％的过硫酸铵溶液：将29g丙烯酰胺和1gn，n-亚甲基双烯酰胺定容到100ml后得到29％丙烯酰胺加1％n，n-亚甲基双烯酰胺溶液。
制胶：将上述配置的溶液按一定的配比制成胶体溶液，混匀后打进夹板中，然后放入梳子，完成后静置至胶成型。
配样：配置含有loadingbuffer的dna浓度为30μm，加入到well中。
跑胶：将上述溶液加入到胶板跑道中，将其放入电泳槽中，用1×tbe溶液作为电泳液，45伏电压跑胶1h，然后用100伏电压跑胶2.5h。
凝胶成像；将跑完后的胶用5μm的式(i)化合物染色，放置在摇床上20min，最后放入凝胶成像仪中拍照。
结果见图12，图12为式(i)化合物探针与dt21、ds26、4a4t、pu27、telo21、oxy28六种核酸的凝胶电泳图。从图中可以看出，式(i)化合物与pu27g-四链体dna结合可产生较强的荧光现象，而对其他g-四链体dna，双链dna，单链dna，rna荧光较弱，说明其对c-myc中pu27g-四链体具有很好的选择性。
实施例11：溶液体系荧光可视化实验
式(i)化合物的tris-hcl(ph＝7.4)缓冲液浓度为5μm中加入等浓度的dt21、ds26、4a4t、pu27、telo21、oxy28、ckit2七种核酸以及一个空白对照，在紫外灯的照射下拍照。
结果见图13，图13为式(i)化合物探针与dt21、ds26、4a4t、pu27、telo21、oxy28、ckit2七种核酸和空白对照在紫外灯下溶液的图，其中，图中的样品从左到右依次为空白对照、pu27g-四链体dna、telo21g-四链体dna、ckit2g-四链体dna、oxy28g-四链体dna、ds26双链dna、4a4t双链dna和dt21单链dna。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。