本发明涉及的是一种咪康唑中间体的生物合成方法，属于生物催化技术领域。
背景技术：
咪康唑是高效、安全、广谱抗真菌药，对致病性真菌几乎都有作用。其机理是抑制真菌细胞膜的固醇合成，影响细胞膜通透性，抑制真菌生长，导致死亡。在4µg/ml以下的浓度可抑制大部分临床分离的真菌，其中新型隐球菌，念珠菌和粗孢子菌对本品均敏感，皮炎芽生菌和组织胞浆菌对本品高度敏感，但曲霉菌较差。另外，咪康唑对金葡菌和链球菌及革兰阳性球菌和炭疽菌等也有抗菌作用。
(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇是咪康唑化学合成过程中一个重要的中间体。但目前主要以化学合成为主，但该方法需要使用价格昂贵的手性配体(s,s)-tsdpen和金属试剂[ru(p-cymene)cl2]2，产品收率低，手性ee值不高，化学生产成本大且对环境不优化，不适于规模化生产。(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的大规模生物制备的方法目前尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种替代传统的化学合成方法，减少生产成本及对环境的污染，利用生物酶催化法制备高手性ee值(ee＞99)的咪康唑中间体的生物合成方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种咪康唑中间体的生物合成方法，所述的生物合成方法是利用实验室所具有的羰基还原酶酶库中的羰基还原酶对底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮进行催化制备高手性ee值(ee＞99)的咪康唑中间体[(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇]。
作为优选：所述的羰基还原酶为candidamacedoniensisaku4588；羰基还原酶的添加量为20-100u/l；催化合成的条件是：在ph7.6-8.8的缓冲液中，于温度30-40℃、zn2+存在条件下催化底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮反应合成咪康唑中间体[(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇]。
作为优选：所述的缓冲液为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液(pbs)、0.1mol/ltris-hcl缓冲液或者是0.1mol/l三乙醇胺缓冲液(tea)；所述zn2+浓度为1mmol/l；所述底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的浓度为1-5g/l；反应合成的时间为4-10h。
利用实验室所具有的羰基还原酶酶库，对底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮进行催化；通过薄层层析色谱和手性高效液相色谱对产物进行手性值分析，获得具有高手性ee值(ee＞99)的酶种并对该酶进行重组表达；利用该酶催化2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮，小规模制备(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种咪康唑中间体的生物合成方法，所述的生物合成方法是利用实验室所具有的羰基还原酶酶库中的羰基还原酶对底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮进行催化制备高手性ee值(ee＞99)的咪康唑中间体[(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇]。
作为一种实施例，本发明所述的羰基还原酶为candidamacedoniensisaku4588；羰基还原酶的添加量为20-100u/l；催化合成的条件是：在ph7.6-8.8的缓冲液中，于温度30-40℃、zn2+存在条件下催化底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮反应合成咪康唑中间体[(r)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇]。
作为一种优选的实施例，本发明所述的缓冲液为0.1mol/l的磷酸盐缓冲液(pbs)、0.1mol/ltris-hcl缓冲液或者是0.1mol/l三乙醇胺缓冲液(tea)；所述zn2+浓度为1mmol/l；所述底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮的浓度为1-5g/l；反应合成的时间为4-10h。
实施例1：本发明所述的羰基还原酶的表达及纯化是：
lb培养基(g/l)：酵母提取物5.0，蛋白胨10.0，nacl10.0，ph7.0(固体培养基加入20.0琼脂)。培养基的灭菌条件：1×105pa，灭菌30min。
重组菌构建：将来自于candidamacedoniensisaku4588的羰基还原酶纯酶基因cr2(氨基酸序列genebank：ab183149)，基于基因序列通过pcr获得全长dna片段，通过ndei和xhoi双酶切分别处理羰基还原酶基因cr2的dna片段和表达载体pet21c，利用连接酶进行目的基因dna片段与载体片段的粘性末端连接，获得重组质粒pet21c-cr2，进一步转化感受态大肠杆菌e.colibl21，得到重组菌株e.colibl21/pet21c-cr2。
挑取e.colibl21/pet21c-cr2单菌落接种到含80μg/ml氨苄青霉素的4mllb液体培养基中，37℃、200r/min过夜振荡培养，并以2％的接种量转接到含80μg/ml氨苄青霉素的100mllb液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养至od600为0.6-0.8时，向培养基中加入0.1mmol/liptg，17℃、200r/min诱导表达12h。
将诱导表达后的发酵液离心，收集菌体并用生理盐水洗涤3次，重悬于20mmol/ltris-hcl缓冲液(ph7.0)，高压匀浆破碎。4℃条件下12000r/min离心收集上清液并用0.22μm滤膜过滤，即为粗酶液。采用ni离子亲和层析法对重组羰基还原酶进行分离纯化：在4℃条件下，先后用20ml20％乙醇、40ml超纯水冲洗柱子，再用20ml的bindingbuffer(20mmol/ltris-hcl，0.3mol/lnacl，40mmol/l咪唑，ph7.0)平衡柱子，平衡完成后将粗酶液缓慢加入柱中，先后用10mlbindingbuffer、10ml60mmol/l咪唑(20mmol/ltris-hcl，0.3mol/lnacl，60mmol/l咪唑，ph7.0)洗去亲和力较弱的杂蛋白，最后加入elutionbuffer(20mmol/ltris-hcl，0.3mol/lnacl，300mmol/l咪唑，ph7.0)进行洗脱，得到目标蛋白液。