异戊二烯醇的生产方法

专利名称：异戊二烯醇的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种异戊二烯醇的生产方法。
背景技术：
类萜(类异戊二烯)的生物合成始于通过异戊烯二磷酸(IPP；C5)与烯丙二磷酸底物顺序缩合反应合成直链异戊二烯二磷酸-牻牛儿二磷酸(GPP；C10)、法呢二磷酸(FPP；C15)和牻牛儿牻牛儿二磷酸(GGPP；C20)(

图1)。在图1中，方框中的缩写和词代表酶。具体地说，hmgR代表羟甲基戊二酰-CoA还原酶；GGPS代表GGPP合酶；而FPS代表FPP合酶。
在异戊二烯二磷酸中，FPP是最为重要的生物合成中间体。它是很多种类类萜合成的前体，所述类萜例如包括麦角固醇(维生素D2原)在内的类固醇、醌(维生素K；VK)的侧链、倍半萜、角鲨烯(SQ)、法呢基化蛋白的锚定分子和天然橡胶。
GGPP也是体内重要的生物合成中间体，是诸如视黄醇(维生素A；VA)、β-胡萝卜素(维生素A原)、叶绿醌(维生素K1；VK1)、生育酚(维生素E；VE)、牻牛儿牻牛儿基化蛋白的锚定分子、叶绿素的侧链、赤霉素和古生菌(Archaea)的醚型脂质的化合物的生物合成所必需的。
已知法尼醇(FOH；C15)和橙花叔醇(NOH；C15)(它们是FPP的醇衍生物)和牻牛儿牻牛儿醇(GGOH；C20)(它是GGPP的一种醇衍生物)是用作香料成分的精油中的芳香物质。FOH、NOH和GGOH作为用于可用作药用物质的各种化合物(包括上述维生素)的合成原料也是重要的(图1)。
需要建立一种可以大量生产所谓活性型异戊二烯醇纯产物而非含异构体的混合物的系统。
虽然人们一直认为IPP的所有生物合成都通过甲羟戊酸途径(从乙酰-CoA通过甲羟戊酸合成IPP的途径)进行，但是M.Rohmer等在二十世纪八十年代末阐述了一个用细菌合成'P的新途径。这称为非甲羟戊酸途径或DXP(1-脱氧木酮糖5-磷酸)途径，其中IPP从甘油醛-3-磷酸和丙酮酸通过1-脱氧木酮糖5-磷酸合成。
目前，除了从诸如精油的天然产物制备小量FOH和NOH之外，FOH和NOH通过化学合成来生产。化学合成的FOH和NOH一般具有相同的碳骨架，但它们作为双键几何学中的(E)型(反式型)和(Z)型(顺式型)混合物获得。都为(全E)型的(E，E)-FOH或(E)-NOH是在生物体中代谢途径中合成的形式，有工业利用价值。为了获得纯形式的(E，E)-FOH或(E)-NOH，通过柱层析、高精度蒸馏等进行精制是必不可少的。然而，热不稳定性烯丙醇-FOH或其异构体FOH的高精度蒸馏难以进行。此外，通过柱层析精制这些物质不适于工业实施，因为它需要大量的溶剂和柱填充物以及分析和回收连续洗脱流分和除去溶剂的复杂操作；因此，这种方法是复杂的，并且需要高成本。既然如此，需要建立一种通过控制(E)-和(Z)-几何异构体的产生或者通过利用反应产物的重复结构来生物合成(E，E)-FOH(下文简称为“FOH”)的方法。然而，这样一种方法尚未建立。FOH合成的底物在芽殖酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中通过甲羟戊酸途径提供。然而，甚至当使用据信是FOH合成关键酶的HMG-CoA还原酶时，也仅发现应用所述还原酶提高了角鲨烯的合成能力(特开平5-192184号；Donald等，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63，3341-3344)。此外，甚至当培养已经获得了固醇摄入能力的特殊芽殖酵母的角鲨烯合酶基因缺陷型菌株时，也仅发现每升培养肉汤积累1.3mg FOH(Chambon等，(1990)Curr.Genet.18，41-46)；尚不知道(E)-NOH(下文简称为“NOH”)的生物合成方法。
发明的公开本发明的一个目的是提供一种生产异戊二烯醇的方法，所述方法包括培养通过将包含HMG-CoA还原酶基因、IPPΔ异构酶基因或FPP合酶基因或这些基因中任一种的突变体的表达用的重组DNA转移到宿主细胞中而制备的重组体。
本发明人为了解决上述问题进行了广泛而深入地研究，试图通过将参与异戊二烯二磷酸合成的酶的基因导入宿主中而开发一个异戊二烯醇生产系统。作为宿主，使用通过甲羟戊酸途径或DXP途径实现异戊二烯二磷酸合成、并且可以经受各种基因工程技术的单细胞真核生物，特别是从古代起就已广泛用于发酵工业的酵母或原核生物(例如细菌，特别是大肠杆菌(E.coli)。为了构建可以用来在宿主细胞中人工表达参与酵母中异戊二烯二磷酸合成的酶的基因(例如HMG-CoA还原酶基因)的系统，创建了包含组成型或诱导型转录启动子和各种营养缺陷型标记的表达穿梭载体。然后，将目标基因或其突变体插入到这些载体中，然后导入到各种宿主细胞中。本发明人已经成功地从所得重组体的培养物中获得NOH或FOH。因此，已经达到上述目的，因而完成了本发明。当用大肠杆菌作为宿主时，用常规载体将参与异戊二烯二磷酸合成的酶的基因(例如FPP合酶基因或IPPΔ异构酶基因)导入到宿主细胞中。然后，在去磷酸化后，从所得重组体的培养物获得FOH。因而已经达到上述目的，从而完成了本发明。
本发明涉及一种生产异戊二烯醇的方法，所述方法包括构建通过将分别包含以下基因或元件的表达用的重组DNA或供基因组整合用的DNA片段导入宿主中而获得的重组体(i)羟甲基戊二酰-CoA还原酶基因、异戊烯二磷酸Δ异构酶基因或法呢二磷酸合酶基因或这些基因中任一种的突变体，(ii)转录启动子，和(iii)转录终止子；培养所述重组体；从所得培养物中回收异戊二烯醇。异戊二烯醇的具体实例包括C15异戊二烯醇，例如FOH或NOH。HMG辅酶A还原酶基因及其突变体的具体实例包括编码SEQ ID NO2、4或6中所示氨基酸序列的基因或其缺失突变体。例如可以给出包含选自SEQ IDNO1、3、5和7-16中的一个核苷酸序列的HMG-CoA还原酶基因。所述FPP合酶基因或其突变体的具体实例包括编码SEQ ID NO76、78、80、82或84中所示氨基酸序列的基因。例如，可以给出包含选自SEQ ID NO75、77、79、81和83的一个核苷酸序列的FPP合酶基因。所述IPPΔ异构酶基因或其突变体的具体实例包括编码SEQ ID NO86中所示氨基酸序列的基因。例如，可以给出包含SEQ ID NO85中所示核苷酸序列的IPPΔ异构酶基因。作为转录启动子，可以使用选自ADH1启动子、TDH3(GAP)启动子、PGK1启动子、TEF2启动子、GAL1启动子和tac启动子的一种启动子。也可以使用在活性方面与这些启动子功能等同的其它转录启动子。作为转录终止子，可以使用ADH1终止子或CYC1终止子。也可以使用在活性方面与这些终止子功能等同的其它转录终止子。作为宿主，可以使用酵母，例如芽殖酵母，如酿酒酵母。优选的酿酒酵母菌株的具体实例包括A451、YPH499、YPH500、W303-1A和W303-1B或者由它们衍生的菌株。另一方面，可以使用细菌，例如大肠杆菌。优选的大肠杆菌菌株的具体实例包括JM109或由其衍生的菌株。
按照本发明，以仅通过培养未转化宿主细胞所不能达到的浓度(至少0.05mg/L培养基)生产异戊二烯醇例如NOH或FOH是可能的。
此外，本发明涉及一种通过将分别包含以下基因或元件的表达用重组DNA或基因组整合用DNA片段转移到宿主中而获得的重组体(i)羟甲基戊二酰-CoA还原酶基因、异戊烯二磷酸Δ异构酶基因或法呢二磷酸合酶基因或这些基因中任一种的突变体，(ii)转录启动子，和(iii)转录终止子；所述重组体能够生产至少0.05mg/L的FOH或NOH。宿主、启动子和终止子的具体实例与上述具体实例相同。
下面将详细描述本发明。本说明书包括在作为本申请所要求的优先权基础的日本专利申请2000-401701号的说明书和附图中所述的内容。
本发明人已经尝试开发一个通过用代谢工程技术可以用来在体内生产活性型异戊二烯醇(即(全E)-异戊二烯醇)的系统。概括地讲，通过法呢二磷酸合酶(FPS)的催化作用，从作为底物的IPP和DMAPP(3，3-二甲基烯丙基二磷酸)合成FPP。通常，这一反应不朝着FOH合成进行，而是朝着角鲨烯合酶合成角鲨烯、牻牛儿牻牛儿二磷酸合酶合成GGPP、六异戊二烯基二磷酸合酶合成六异戊二烯基二磷酸等的方向进行(图1)。在本发明中，视生物体而定，通过将据信通过两个不同的独立途径(甲羟戊酸途径和DXP途径)参与激活异戊二烯二磷酸合成的HMG-CoA还原酶基因、FPP合酶基因或IPPΔ异构酶基因导入到宿主细胞中，获得了能够不生产通常预期的角鲨烯或主要终产物(固醇类)、而生产常规代谢途径图谱中未指出的异戊二烯醇如NOH和FOH的转化细胞。因此，开发出异戊二烯醇的生物大量生产系统。此外，已经将具有各种缺失模式(图2)的HMG-CoA还原酶基因的缺失突变体，以使所述基因处于转录启动子控制之下的方式导入宿主中；或者将具有氨基酸取代的FPP合酶突变体导入了宿主中。因此，已经开发出上述异戊二烯醇的生物大量生产系统。
1.表达用重组DNA或基因组整合用DNA片段的制备在本发明中，通过将转录启动子DNA和转录终止子DNA连接或插入到待表达的目标基因中，可以获得用于宿主转化的表达用重组DNA。具体地说，待表达的基因可以例如是HMG-CoA还原酶基因(例如HMG1)大肠杆菌FPP合酶基因ispA、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)FPP合酶基因或IPPΔ异构酶基因idi(ORF182)(在下文称为“HMG-CoA还原酶基因等”)。这些基因可以用PCR或商业试剂盒通过克隆技术来分离。
也有可能预先制备包含已经连接了转录启动子和转录终止子的HMG-CoA还原酶基因等的一种基因表达盒，然后将所述盒掺入到载体中。所述启动子和终止子的连接可以以任何顺序进行。然而，将启动子连接在所述HMG-CoA还原酶基因等的上游，而将终止子连接在所述基因的下游。另一方面，在本发明中，可以将HMG-CoA还原酶基因等、转录启动子和转录终止子连续掺入到合适的DNA中，例如载体中。如果适当地考虑转录方向，则可以以任何顺序进行所述掺入。
用于此目的的DNA并无特别的限制，只要它在遗传上可以保留在宿主细胞中。可以使用的DNA的具体实例包括质粒DNA、噬菌体、反转录转座子DNA和人工染色体DNA(YAC酵母人工染色体)。关于通过基因组整合而用于基因表达的重组DNA片段，复制能力并非是该DNA中所必需的。也可以使用通过PCR或化学合成制备的DNA片段。
有用质粒DNA的具体实例包括YCp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，例如pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123；YEp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，例如pYES2或YEp13；YIp型大肠杆菌-酵母穿梭载体，例如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101或pAUR135；大肠杆菌衍生质粒，例如ColE质粒(例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396或pTrc99A)、p15A质粒(例如pACYC177或pACYC184)和pSC101质粒(例如pMW118、pMW119、pMW218或pMW219)；和枯草杆菌(Bacillus subtilis)衍生质粒(例如pUB110、pTP5)。有用的噬菌体DNA的具体实例包括λ噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP)、φX174、M13mp18和M13mp19。有用的反转录转座子DNA的具体实例包括Ty因子。YAC载体的具体实例包括pYACC2。
当将重组DNA导入宿主中时，在许多情况下使用选择标记基因。然而，如果有选择重组体的合适的测定，则标记基因的使用并非是必需的。
作为转录启动子，可以使用组成型启动子或诱导型启动子。“组成型启动子”是指参与主要代谢途径的基因的转录启动子。认为这样一种启动子在任何生长条件下都具有转录活性。“诱导型启动子”是指仅在特定生长条件下有转录活性、而在其它生长条件下其活性受抑制的启动子。
可以使用任何转录启动子，只要它在宿主例如酵母中具有活性。例如，可以用GAL1启动子、GAL10启动子、TDH3(GAP)启动子、ADH1启动子、PGK1启动子或TEF2启动子，在酵母中指导表达。为了在大肠杆菌中指导表达，例如可以使用trp启动子、lac启动子、trc启动子或tac启动子。
如果需要，所述重组DNA还可以包含顺式作用元件，例如增强子、剪接信号、聚腺苷酸添加信号、选择标记等。有用的选择标记的具体实例包括标记基因，例如具有非营养缺陷型表型作为指示的URA3、LEU2、TRP1和HIS3；和抗药性基因，例如Ampr、Tetr、Cmr、Kmr和AUR1-C。
可以使用得自任何基因的转录终止子，只要它在宿主例如酵母中有活性。例如，可以用ADH1终止子或CYC1终止子，在酵母中指导表达。为了在大肠杆菌中指导表达，例如可以使用rrnB终止子。也可能将SD序列(通常为5’-AGGAGG-3’)掺入到细菌(例如大肠杆菌)基因起始密码子的上游，作为供翻译用的核糖体结合位点。
在本发明中制备的作为基因转移用重组DNA的表达载体，可以通过在所使用的质粒名称后指示基因名称来命名和标识，除非另有说明。例如，当将HMG1基因与具有TDH3(GAP)启动子的质粒pRS434GAP连接时，所得的质粒以“pRS434GAP-HMG1”表示。除特定情况外，这种计数系统适用于包含其它质粒、启动子和基因的其它表达载体。
在本发明中，HMG-CoA还原酶基因等可以是其中缺失了其多个区域的一部分(最多2217个核苷酸)的突变体、或者在野生型基因或其缺失突变体的核苷酸序列中缺失、取代或添加一个或数个至十多个核苷酸的突变体。关于氨基酸序列，HMG-CoA还原酶可以是其中在野生型HMG-CoA还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO2)中最多缺失739个氨基酸的缺失突变体，或者它可以是在所述野生型酶或其缺失突变体的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个或若干个(例如1-10个，优选1-3个)氨基酸的突变体。具体地说，HMG-CoA还原酶基因可以是野生型基因或图2B中所示的其缺失突变体。此外，由这样一种基因编码的氨基酸序列可以由于核苷酸取代而在1-10个位点有定点取代，例如，如图2A中所示。FPP合酶基因也可以是具有一个或数个至十多个核苷酸缺失、取代或添加的突变体。具体地说，可以使用分别在野生型FPP合酶基因(SEQ ID NO77)中具有5个核苷酸取代的各种突变型基因(SEQ ID NO79、81和83)。这些突变型基因编码其中野生型FPP合酶(SEQ ID NO78)的第79位氨基酸残基Tyr已经分别被变为Asp(SEQ ID NO80)、G1u(SEQ ID NO82)或Met(SEQ ID NO84)的突变型酶。
通过用低保真性DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)经PCR(聚合酶链式反应)扩增野生型DNA而获得的DNA片段中所发生的核苷酸的取代突变，被称为“PCR错误”。在本发明中，例如，也可以使用其中所编码的多肽具有可归因于用野生型HMG-CoA还原酶基因(SEQID NO1)作为模板时由于PCR错误而产生的那些核苷酸取代的取代突变的HMG-CoA还原酶基因。这种HMG-CoA还原酶基因被称为“HMG1’”。用野生型HMG-CoA还原酶基因(SEQ ID NO1)作为模板时由于PCR错误而产生的核苷酸取代的一个实施方案示于图2A中。HMG1’具有SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列，而由其编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。在图2A中，所述核苷酸突变按照以下顺序表示取代前相关核苷酸(以单字母缩写表示)、当以所述HMG-CoA还原酶基因起始密码子中的第一个核苷酸作为1位时该核苷酸的位置、和取代后的核苷酸(以单字母缩写表示)。在PCR错误型HMG-CoA还原酶的氨基酸序列中所含有的氨基酸突变按以下顺序表示取代前相关氨基酸残基(以单字母缩写表示)、所述HMG-CoA还原酶中该氨基酸的位置、和取代后的氨基酸残基(以单字母缩写表示)。此外，上述PCR错误型核苷酸序列可以用例如定点诱变的技术部分校正。这样一种经校正的HMG-CoA还原酶基因也可以用于本发明。此外，在本发明中也可以使用编码缺失了预定跨膜结构域的缺失突变体的那些HMG-CoA还原酶基因(包括PCR错误型)。例如，图2B显示了作为所述PCR错误型HMG-CoA还原酶基因HMG1’的缺失突变体的HMG1Δ基因的实例。在图2B中，最上面一行代表无缺失的HMG1’基因。用细实线(一)所示的部分为缺失区。以下表1显示了每种缺失突变体缺失了HMG1’基因(SEQ ID NO3)的哪个区。HMG1’的缺失突变体依照缺失模式以“HMG1Δxxy”表示，其中“xx”表示缺失模式，而“y”表示工作编号(任何数字)。在图2B中，显示了“Δ026”作为HMG1Δ02y的一个实例。(同样，也显示了其它缺失模式的实例。)
表1.缺失的实施方案缺失突变体 预测跨膜结 缺失后的序的命名 引物1引物2质粒 构域的缺失 缺失区 列HMG1Δ02y HMG1(558-532)HMG1(799-825)pYHMG02X #2-#3Nucleotide positions 559-798SEQ ID NO7HMG1Δ04y HMG1(1191-1165) HMG1(1267-1293) pYHMG04X #6 Nucleotide positions 1192-1266 SEQ ID NO8HMG1Δ05y HMG1(1380-1354) HMG1(1573-1599) pYHMG05X #7 Nucleotide positions 1381-1572 SEQ ID NO9HMG1Δ06y HMG1(558-532)HMG1(1267-1293) pYHMG06X #2-#6Nucleotide positions 559-1266 SEQ ID NO10HMG1Δ07y HMG1(558-532)HMG1(1573-1599) pYHMG07X #2-#7Nucleotide positions 559-1572 SEQ ID NO11HMG1Δ08y HMG1(27-1) HMG1(1573-1599) pYHMG08X #1-#7Nucleotide positions 27-1572SEQ ID NO12HMG1Δ10y HMG1(27-1) HMG1(1816-1842) pYHMG10X #1-#7(-605 aa) Nucleotide positions 27-1815SEQ ID NO13HMG1Δ11y HMG1(27-1) HMG1(1891-1917) pYHMG11X #1-#7(-631 aa) Nucleotide positions 27-1890SEQ ID NO14HMG1Δ12y HMG1(27-1) HMG1(1990-2016) pYHMG12X #1-#7(-663 aa) Nucleotide positions 27-1989SEQ ID NO15HMG1Δ13y HMG1(27-1) HMG1(2218-2244) pYHMG13X #1-#7(-739 aa) Nucleotide positions 27-2217SEQ ID NO16引物序列HMG1(27-1) 5′TTT CAG TCC CTT GAA TAG CGG CGG CAT 3′ SEQ ID NO38HMG1(558-532)5′GTC TGC TTG GGT TAC ATT TTC TGA AAA 3′ SEQ ID NO39HMG1(799-825)5′CAC AAA ATC AAG ATT GCC CAG TAT GCC 3′ SEQ ID NO40HMG1(1191-1165) 5′AGA AGA TAC GGA TTT CTT TTC TGC TTT 3′ SEQ ID NO41HMG1(1267-1293) 5′AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT 3′ SEQ ID NO42HMG1(1380-1354) 5′TTG CTC TTT AAA GTT TTC AGA GGC ATT 3′ SEQ ID NO43HMG1(1573-1599) 5′CAT ACC AGT TAT ACT GCA GAC CAA TTG 3′ SEQ ID NO44HMG1(1816-1842) 5′GCA TTA TTA AGT AGT GGA AAT ACA AAA 3′ SEQ ID NO45HMG1(1891-1917) 5′CCT TTG TAC GCT TTG GAG AAA AAA TTA 3′ SEQ ID NO46HMG1(1990-2016) 5′TCT GAT CGT TTA CCA TAT AAA AAT TAT 3′ SEQ ID NO47HMG1(2218-2244) 5′AAG GAT GGT ATG ACA AGA GGC CCA GTA 3′ SEQ ID NO48
2.重组体的制备通过将本发明的重组DNA以所述HMG-CoA还原酶基因等(包括各种突变体；这适用于本说明书的其余部分，除非另有说明)可以被表达的方式导入宿主中，可以获得本发明的重组体。本发明中所用的宿主并无特别的限制。可以使用任何宿主，只要它可以生产异戊二烯醇。优选使用大肠杆菌或酵母。
在本发明中，可以将包含启动子、HMG-CoA还原酶基因等和终止子的重组DNA导入真菌(包括单细胞真核生物，例如酵母)；原核生物，例如大肠杆菌；动物细胞；植物细胞等中，获得重组体。
可用于本发明的真菌包括粘菌门(Myxomycota)、藻状菌纲(Phycomycetes)、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和半知菌类(Fungi Imperfectu)。在真菌中，众所周知的某些单细胞真核生物是在工业应用性方面有重要性的酵母。例如，可以列举属于子囊菌门的酵母、属于担子菌门的酵母或属于半知菌类的酵母。酵母的具体实例包括属于子囊菌门的酵母，特别是芽殖酵母如酿酒酵母(称为面包酵母)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastrts)；和裂殖酵母，例如粟酒裂殖酵母(Shilzosaccharomyces pombe)。对于酵母菌株并无特别的限制，只要它可以产生异戊二烯醇。就酿酒酵母而论，有用菌株的具体实例包括以下所示的A451、EUG8、EUG12、EUG27、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1B和AURGG101菌株。作为将重组DNA导入酵母的方法，可以使用诸如电穿孔、原生质球法或乙酸锂法的方法。
A451(ATCC200589；MATa can1 leu2 trp1 ura3 aro7)YPH499(ATCC76625；MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ200leu2-Δ1；Stratagene，La Jolla，CA)YPH500(ATCC76626；MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ200leu2-Δ1；Stratagene)
W303-1A(MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)W303-1B(MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)AURGG101(A451，aur1∷AUR1-C)EUG8(A451，ERG9p∷URA3-GAL1p)EUG12(YPH499，ERG9p∷URA3-GAL1P)EUG27(YPH500，ERG9P∷URA3-GAL1p)作为原核生物，可以列举古生菌和细菌。作为古生菌，可以列举产甲烷的微生物，例如甲烷杆菌属(Metanobacterium)；嗜盐微生物，例如盐杆菌属(Halobacterium)、嗜热嗜酸微生物例如硫化叶菌属(Sulfolobus)。作为细菌，可以列举在工业应用性或科学应用性方面非常有价值的各种革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌、芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草杆菌或短芽孢杆菌(B.brevis)、假单胞菌属(Pseudomonas)如恶臭假单胞菌(P.putida)、土壤杆菌属(Agrobacterium)如根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)、棒杆菌属(Corynebacterium)如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、乳杆菌属(Lactobacillus)如植物乳杆菌(L.plantarum)和放线菌纲(Actinomycetes)如放线菌属(Actinomyces)或链霉菌属(Atreptmyces)。
当用细菌如大肠杆菌作为宿主时，优选本发明的重组DNA不仅能够在该宿主中自主复制，而且由启动子、作为核糖体RNA结合位点的SD序列和本发明的基因组成。也可以适当地插入转录终止子。所述重组DNA也可以含有控制所述启动子的基因。大肠杆菌菌株的具体实例包括但不限于BL21、DH5a、HB101、JM101、MBV1184、TH2、XL1-Blue和Y-1088。作为转录启动子，可以使用任何启动子，只要它可以指导基因在宿主如大肠杆菌中表达。例如，可以使用大肠杆菌或噬菌体来源的启动子，例如trp启动子、lac启动子、PL启动子或PR启动子。也可以使用人工改变的启动子，例如tac启动子。作为将重组DNA导入细菌的方法，可以使用将DNA转移到细菌中的任何方法。例如，可以使用利用钙离子的方法、电穿孔或使用商业试剂盒的方法。
本发明的基因是否转移到宿主细胞中，可以采用诸如PCR或DNA印迹杂交的方法来证实。例如，可以从所得的重组体中制备DNA，设计对所导入的DNA特异性的引物，并进行PCR。随后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，然后用溴化乙锭、SYBR Green溶液等染色，或者用UV检测器检测DNA。因此，通过检测作为单一条带或者峰的扩增产物，可以证实所导入的DNA。另一方面，可以用以荧光染料等标记的引物进行PCR，以检测扩增产物。
3.异戊二烯醇的生产在本发明中，通过培养上述包含转移HMG-CoA还原酶基因等的重组体，并且从所得培养物中回收异戊二烯醇，可以获得异戊二烯醇。此中所用的术语“培养物”是指以下物质中的任一种培养上清液、培养细胞或微生物本身、或者得自培养细胞或微生物的经破碎的产物。本发明的重组体用宿主培养中常用的方法来培养。作为异戊二烯醇，可以列举C15异戊二烯醇，例如法尼醇(FOH)或橙花叔醇(NOH)。这些异戊二烯醇在培养物中独立积累或者作为混合物积累。
作为用于培养得自微生物宿主的重组体的培养基，可以使用或者天然或者合成的培养基，只要它含有可被所述微生物同化的碳源、氮源和无机盐，并且能够有效培养所述重组体。作为碳源，可以使用糖类，例如葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、淀粉；有机酸，例如乙酸、丙酸；和醇类，例如乙醇和丙醇。作为氮源，可以使用氨；无机酸或有机酸的铵盐，例如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵；其它含氮化合物；蛋白胨；肉膏；玉米浆；各种氨基酸等。作为无机物质，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。通常，使所述重组体在有氧条件下于26-36℃经过振荡培养或通气搅拌培养。当宿主是酿酒酵母时，优选所述重组体在30℃下培养2-7天。当宿主是大肠杆菌时，所述重组体在37℃培养12-18小时。用无机酸或有机酸、碱性溶液等，进行pH调节。在培养期间，必要时可以向培养基中加入抗生素，例如氨苄青霉素、氯霉素或金担子菌素A。
当培养掺入了含诱导型转录启动子的表达载体的重组体时，必要时可以向培养基中加入诱导物。例如，当使用GAL1启动子时，可以使用半乳糖作为碳源。当培养用含可被异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子的表达载体转化的微生物(例如大肠杆菌)时，可以向培养基中加入IPTG。
当在上述条件下培养时，本发明的重组体可以高产地生产异戊二烯醇。特别是，当宿主是AURGG101，而载体是pYHMG044时，所述重组体可以每升培养基生产32mg或更多的异戊二烯醇。根据培养条件，它甚至可以生产150mg/L或更多的异戊二烯醇。
在本发明中，有可能通过向上述培养基中加入诸如类萜、油类或表面活性剂而提高异戊二烯醇的生产率。这些添加剂的具体实例包括以下类萜角鲨烯、生育酚、IPP、DMAPP油类豆油、鱼油、杏仁油、橄榄油表面活性剂Tergitol、Triton X-305、Span 85、Adekanol LG109(Asahi Denka)、Adekanol LG294(Asahi Denka)、Adekanol LG295S(AsahiDenka)、Adekanol LG297(Asahi Denka)、Adekanol B-3009A(AsahiDenka)、Adekapluronic L-61(Asahi Denka)。
油的浓度为0.01％或更高，优选1-3％。表面活性剂的浓度为0.005-1％，优选0.05-0.5％。类萜的浓度为0.01％或更高，优选1-3％。
在培养之后，当在所述微生物或细胞内产生目标异戊二烯醇时，通过例如匀浆破坏所述微生物或细胞，回收所述醇。另一方面，可以不破碎细胞，用有机溶剂直接提取所述醇。当在所述微生物或细胞外生产本发明的异戊二烯醇时，使用培养肉汤原液，或者将培养肉汤离心等，以回收所述微生物或细胞。此后，通过例如用有机溶剂提取，从培养物中提取目标异戊二烯醇。必要时，可以用各种类型的层析法，对所述醇进行进一步的分离纯化。
在本发明中，在以下表2中说明了宿主菌株和作为重组DNA的载体的优选组合、以及这些组合和异戊二烯醇产量之间的关系。
表2启动子 基因 宿主 FOH产量(mg/L) NOH产量(mg/L)GAP HMG1 酿酒酵母A451 0.05，0.65-11.2，4.9-11.2 0.05，0.05-0.16，0.16GAP HMG1 酿酒酵母EUG8(来自A451)0.2，0.20-1.8，1.8 -，-，-ADH，GAP，PGK，TEF HMG1 酿酒酵母YPH4990.05，0.05-0.11，0.11 -，-，-GAP HMG1 酿酒酵母EUG12(来自YPH499) 5.9，5.9-18.3，18.30.13，0.13-0.30，0.30PGK，TEFHMG1 酿酒酵母YPH500-，-，--，-，-GAP HMG1 酿酒酵母EUG27(来自YPH500) 3.2，3.2-13.6，13.60.05，0.05-0.22，0.22GAP HMG1 酿酒酵母W303-1A -，-，--，-，-GAP HMG1 酿酒酵母W303-1B -，-，--，-，-GAL HMG1’ 酿酒酵母A451 -，-，-0.05，-，-GAL HMG1’ 酿酒酵母AURGG101(来自A451)0.05，0.29-8.2，8.20.05，0.095-2.7，2.7GAL HMG1’ 酿酒酵母YPH4990.05，0.05-0.057，0.057-，-，-GAL HMG1’ 酿酒酵母YPH500-，-，--，-，-GAL HMG1’ 酿酒酵母W303-1A -，-，-0.05，0.10-0.15，0.15GAL HMG1’ 酿酒酵母W303-1B -，-，-0.05，0.091-0.14，0.14GAL HMG04y酿酒酵母A451 0.05，0.22-0.51，0.51 0.05，0.05-0.058.0.058GAL HMG04y酿酒酵母AURGG101(来自A451)0.05，0.05-158，53-158 0.05，0.05-23，2.4-23GAL HMG04y酿酒酵母YPH499-，-，--，-，-GAL HMG04y酿酒酵母YPH500-，-，--，-，-GAL HMG04y酿酒酵母W303-1A -，-，--，-，-GAL HMG04y酿酒酵母W303-1B -，-，--，-，-GAL HMGxxy酿酒酵母A451 0.05，0.05-0.21，0.21 0.05，0.05-0.12，0.12GAL HMGxy 酿酒酵母AURGG101(来自A451)0.05，0.05-0.13，0.13 0.05，0.05-0.11，0.11GAL HMGxxy酿酒酵母YPH499-，-，--，-，-GAL HMGxxy酿酒酵母YPH500-，-，--，-，-GAL HMGxxy酿酒酵母W303-1A -，-，--，-，-GAL HMGxxy酿酒酵母W303-1B -，-，--，-，-GAP&GAL HMG&HMG04 酿酒酵母AURGG101(来自A451)22，22-66，66 12，12-28，28ispA 大肠杆菌JM109 11，11-93，73-93 -，-，-fps 大肠杆菌JM109 12，-，- -，-，-ispA & idi大肠杆菌JM109 0.15，0.15-0.16，- -，-，-在FOH产量和NOH产量栏中，以从左侧的顺序显示了下限、优选的范围和更优选的范围。
标记“-”是指没有数据。
从表2来看，例如可以达到以下产量。
(1)当将包含连接于组成型启动子下游的HMG1或其突变体(例如HMG1’)或该突变体的缺失突变体(HMGxxy)的DNA导入了酿酒酵母细胞时，所述细胞产生至少0.05mg/L、优选0.05-18.3mg/L的FOH，以及产生至少0.05mg/L、优选0.05-0.3mg/L的NOH。
(2)当将包含连接于诱导型启动子下游的HMG1或其突变体(例如HMG1’)或该突变体的缺失突变体(HMGxxy)的DNA导入了酿酒酵母细胞时，所述细胞产生至少0.05mg/L、优选0.05-158mg/L、更优选53-158mg/L的FOH，以及产生至少0.05mg/L、优选0.05-23mg/L、更优选2.4-23mg/L的NOH。
(3)当将分别包含连接于组成型启动子下游的HMG1和连接于诱导型启动子下游的HMG04y(HMG1’的一种缺失突变体)的两种DNA导入了酿酒酵母细胞时，所述细胞产生至少22mg/L、优选22-66mg/L的FOH，以及产生至少12mg/L、优选12-28mg/L的NOH。
(4)当将包含HMG1或其突变体(例如HMG1’)或该突变体的缺失突变体(HMGxxy)的DNA导入了酿酒酵母A451细胞或A451衍生细胞时，所述细胞产生至少0.05mg/L、优选0.05-158mg/L、更优选53-158mg/L的FOH，以及产生至少0.05mg/L、优选0.05-23mg/L、更优选2.4-23mg/L的NOH。
(5)当将包含HMG1或其突变体(例如HMG1’)或该突变体的缺失突变体(HMGxxy)的DNA导入了酿酒酵母YPH499细胞或YPH499衍生细胞时，所述细胞产生至少0.05mg/L、优选0.05-18.3mg/L、更优选5.9-18.3mg/L的FOH，以及产生至少0.05mg/L、优选0.13-0.30mg/L的NOH。
(6)当将包含HMG1或其突变体(例如HMG1’)或该突变体的缺失突变体(HMGxxy)的DNA导入了酿酒酵母YPH500细胞或YPH500衍生细胞时，所述细胞产生至少3.2mg/L、优选3.2-13.6mg/L的FOH，以及产生至少0.05mg/L、优选0.05-0.22mg/L的NOH。
(7)当将包含HMG1或其突变体(例如HMG1’)的DNA导入了酿酒酵母细胞时，所述细胞产生至少0.05mg/L、优选0.05-18.3mg/L、的FOH，以及产生至少0.05mg/L、优选0.05-2.7mg/L的NOH。
(8)当将包含HMG1xxy(HMG1’的一种缺失突变体)的DNA导入了酿酒酵母细胞时，所述细胞产生至少0.05mg/L、优选0.05-158mg/L、更优选53-158mg/L的FOH，以及产生至少0.05mg/L、优选0.05-23mg/L、更优选2.4-23mg/L的NOH。
(9)将包含大肠杆菌FPP合酶基因ispA缺失突变体的质粒导入大肠杆菌中。当在含有IPP和DMAPP的液体培养基中培养所得细胞，并且然后用磷酸酶处理时，所述细胞产生至少11mg/L、优选11-90mg/L、更优选64-90mg/L的FOH。
(10)当将ispA和idi导入了大肠杆菌中时，甚至在不加入IPP和DMAPP时，由于磷酸酶的处理，所述细胞产生至少0.15mg/L、优选0.15-0.16mg/L的FOH。
附图简述图1是显示涉及甲羟戊酸途径相关酶的代谢途径的图。
图2A是显示HMG1基因的缺失突变体的构建的图。
图2B显示取代突变的模式。
图3是显示质粒pRS414的图。
图4是显示质粒pYES2的图。
图5是显示ADH1启动子和终止子的序列的图。
图6A是显示质粒pRS414PTadh的图。
图6B是显示质粒pRS414TPadh的图。
图7A-1是显示质粒pRS434ADH的图。
图7A-2是显示质粒pRS434GAP的图。
图7B-1是显示质粒pRS434PGK的图。
图7B-2是显示质粒pRS434TEF的图。
图7C-1是显示质粒pRS436ADH的图。
图7C-2是显示质粒pRS436GAP的图。
图7D-1是显示质粒pRS436PGK的图。
图7D-2是显示质粒pRS436TEF的图。
图7E-1是显示质粒pRS444ADH的图。
图7E-2是显示质粒pRS444GAP的图。
图7F-1是显示质粒pRS444PGK的图。
图7F-2是显示质粒pRS444TEF的图。
图7G-1是显示质粒pRS446ADH的图。
图7G-2是显示质粒pRS446GAP的图。
图7H-1是显示质粒pRS446PGK的图。
图7H-2是显示质粒pRS446TEF的图。
图8是显示质粒pALHMG106的物理图谱。
图9是显示DNA印迹法结果的照片。
图10是显示PCR作图结果的照片。
图11是显示RNA印迹法结果的照片。
图12A是一幅图，显示粗制酶溶液中每种异戊二烯二磷酸合酶的比活。
图12B是一幅图，显示粗制酶溶液中每种异戊二烯二磷酸合酶的比活。
图13是一幅图，显示当将pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1转移到A451菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图14是一幅图，显示当将pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1转移到A451菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图15是一幅图，显示当将pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1转移到A451菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图16是一幅图，显示当将pRS414PTadh-HMG1、pRS414TPadh-HMG1、pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1、pRS434TEF-HMG1或pRS444TEF-HMG1转移到YPH499菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图17是一幅图，显示当将pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1转移到EUG8菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图18是一幅图，显示当将pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1转移到EUG12菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图19是一幅图，显示当将pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1转移到EUG27菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图20A是一幅图，显示当将pYES-HMG1或pYHMG044转移到A451菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图20B是一幅图，显示当将pYES-HMG1或pYHMG044转移到AURGG101菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图21是一幅图，显示当将pYES-HMG1转移到W303-1A或W303-1B菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图22是一幅图，显示当将pYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112或pYHMG122转移到A451菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图23是一幅图，显示当将pYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112或pYHMG122转移到AURGG101菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图24是一幅图，显示当将pYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112或pYHMG122转移到AURGG101菌株中时的异戊二烯醇的产量(放大了图23中的图)。
图25是一幅图，显示当将pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1与pYHMG044一起导入到AURGG101菌株中时的异戊二烯醇的产量。
图26是一幅图，显示当在含有IPP和DMAPP的液体培养基中培养转移有突变型ispA基因的大肠杆菌时的异戊二烯醇的产量。
图27是一幅图，显示当在无IPP和DMAPP的液体培养基中培养转移有突变型ispA基因的大肠杆菌时的异戊二烯醇的产量。
图28是一幅图，显示当在小型发酵罐中培养重组体15-2克隆(pYHMG044/AURGG101)时的异戊二烯醇的产量和细胞计数。
实施本发明的最佳方式下面将参考以下实施例更具体地描述本发明。然而，本发明的技术范围并不限于这些实施例。
表达载体的构建用从Stratagene(La Jolla，CA)购买的大肠杆菌SURE2超感受态细胞作为宿主，构建载体。为了从酿酒酵母制备基因组DNA以及测试所得载体的导入，使用YPH499菌株(Stratagene)。
(1)大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体质粒pRS404和pRS414(图3)购自Stratagene。质粒pAUR123购自Takara，而质粒pYES2(图4)购自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
(2)基因组DNADr.GenTLETM是一种用于酵母的基因组DNA制备试剂盒，购自Takara。依照所述试剂盒所附的方案，从酿酒酵母YPH499制备基因组DNA。
(3)将ADH1p-ADH1t片段插入到pRS414中用NaeI和PvuII消化质粒pRS414(图3)，获得无f1 ori和LacZ部分的4.1kbp片段。通过琼脂糖凝胶电泳纯化该片段。质粒pAUR123用BamHI消化，用Klenow酶制成平端。然后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化含有ADH1转录启动子(ADH1p)和ADH1转录终止子(ADH1t)的1.0kbp片段(图5；SEQ ID NO7)。得自pRS414的所述4.1kbp片段仍保留用于大肠杆菌和酵母的复制起点、用于大肠杆菌的转化标记Ampr和用于酵母的营养缺陷型标记TRP1。另一方面，得自pAUR123的所述1.0 kbp片段含有ADH1p、ADH1t和它们所邻接的克隆位点。用DNA连接试剂盒(Takara)将这两种片段相互连接，转化到SURE2细胞中。
从所得的重组体制备质粒DNA。用SalI和ScaI对所述DNA作图表明，ADH1p-ADH1t片段已经以相反的方向插入到pRS414中，从而产生两种质粒-pRS414PTadh和pRS414TPadh(图6)。
(4)将CYC1t片段插入到pRS载体中通过PCR制备CYC1t(CYC1转录终止子)片段。使用以下寡聚DNA-XhoI-Tcyc1FW和ApaI-Tcyc1RV作为PCR引物。使用pYES2作为模板。
XhoI-Tcyc1FW5′TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG-3′(SEQ ID NO18)ApaI-Tcyc1RV5′-CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG-3′(SEQ ID NO19)简而言之，制备含有0.1μg pYES2、每种引物DNA各50pmol、含MgSO4的1×Pfu缓冲液(Promega，Madison，WI)、10nmol dNTP、1.5单位Pfu DNA聚合酶(Promega)和1μl Perfect Match聚合酶增强剂(Stratagene)的50μl反应溶液。反应条件如下首先于95℃变性2分钟；30个循环于95℃变性45秒、于60℃退火30秒和于72℃延伸1分钟；以及于72℃最后延伸5分钟。在反应完成后，将溶液贮存于4℃。扩增的DNA用XhoI和ApaI消化，通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得的260bp DNA片段，获得CYC1t-XA。
将CYC1t-XA插入到pRS404和pRS406的XhoI-ApaI位点中，从而分别获得pRS404Tcyc和pRS406Tcyc。
(5)转录启动子的制备用pAUR123或酵母基因组DNA作为模板，通过PCR制备包含转录启动子的DNA片段。所用的DNA引物如下SacI-Padh1FW5′-GAT CGA GCT CCT CCC TAA CAT GTA GGT GGC GG-3′(SEQ ID NO20)SacII-Padh1RV5′-CCC GCC GCG GAG TTG ATT GTA TGC TTG GTA TAG C-3’(SEQ ID NO21)SacI-Ptdh3FW5′-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA-3′(SEQ ID NO22)SacII-Ptdh3RV5′-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC-3′(SEQ ID NO23)SacI-Ppgk1FW5′-TAG GGA GCT CCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG-3′(SEQ ID NO24)SacII-Ppgk1RV5′-AIA ACC GCG GTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG-3′(SEQ ID NO25)SacI-Ptef2FW5′-CCG CGA GCT CTT ACC CAT AAG GTT GTT TGT GAC G-3(SEQ ID NO26)SacII-Ptef2RV5′-CTT TCC GCG GGT TTA GTT AAT TAT AGT TCG TTG ACC-3′(SEQ ID NO27)为了扩增ADH1转录启动子(ADH1p)，用SacI-Padh1FW和SacII-Padh1RV作为PCR引物，并且用pAUR123作为模板。为了扩增TDH3(GAP)转录启动子(TDH3p(GAPp))，用SacI-Ptdh3FW和SacII-Ptdh3RV作为PCR引物；为了扩增PGK1转录启动子(PGK1p)，用SacI-Ppgk1FW和SacII-Ppgk1RV作为PCR引物；而为了扩增TEF2转录启动子(TEF2p)，用SacI-Ptef2FW和SacII-Ptef2RV作为PCR引物。对于这些启动子，用酵母基因组DNA作为模板。作为反应溶液，制备含有0.1μgpAUR123或0.46μg酵母基因组DNA、每种引物DNA各100pmol、1×ExTaq缓冲液(Takara)、20nmol dNTP、0.5单位ExTaq DNA聚合酶(Takara)和1μl Perfect Match聚合酶增强剂的100μl溶液。反应条件如下首先于95℃变性2分钟；30个循环于95℃变性45秒、于60℃退火1分钟和于72℃延伸2分钟；以及于72℃最后延伸4分钟。在反应完成后，将溶液贮存于4℃。所扩增的4种类型的DNA用Sacl和SacII消化，通过琼脂糖凝胶电泳分别纯化所得的620bp、680bp、710bp和400bp DNA片段，从而分别获得ADH1p、TDH3p、PGK1p和TEF2p。
(6)2μDNA复制起点部位的制备pYES2是一种YEp载体，用SspI和NheI消化。通过琼脂糖凝胶电泳纯化含有2μDNA复制起点(2μori)的所得1.5kbp片段，然后制成平端。该DNA片段被命名为2μOriSN。
(7)YEp型表达载体的制备将2μOriSN插入到用BAP(细菌碱性磷酸酶Takara)预处理的pRS404Tcyc和pRS406Tcyc的NaeI位点。将所得的质粒转化到大肠杆菌SURE2中，然后制备质粒DNA。所述质粒DNA用DraIII和EcoRI、HpaI或PstI；和PvuII消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳，以便检查2μori的插入和方向。其中以与pYES2中的相同方向插入了2μori的所得pRS404Tcyc和pRS406Tcyc被分别命名为pRS434Tcyc2μOri和pRS436Tcyc2μOri。其中以与pYES2中的相反方向插入了2μori的所得pRS404Tcyc和pRS406Tcyc被分别命名为pRS444Tcyc2μOri和pRS446Tcyc2μOri。
将含有转录启动子的片段，即ADH1p、TDH3p(GAPp)、PGK1p或TEF2p，插入到上述4种质粒pRS434Tcyc2μOri、pRS436Tcyc2μOri、pRS444Tcyc2μOri和pRS446Tcyc2μOri的SacI-SacII位点中，以克隆所述DNA。结果，获得以下质粒(i)pRS434ADH、pRS434GAP、pRS434PGK和pRS434TEF，得自pRS434Tcyc2μOri；(ii)pRS436ADH、pRS436GAP、pRS436PGK和pRS436TEF，得自pRS436Tcyc2μOri；(iii)pRS444ADH、pRS444GAP、pRS444PGK和pRS444TEF，得自pRS444Tcyc2μOri；(iv)pRS446ADH、pRS446GAP、pRS446PGK和pRS446TEF，得自pRS446Tcyc2μOri(图7A-7H)。
在本发明中制备的表达载体总结于以下表3中。
表3

*在标记和基因表达转录单位之后出现的+和-标志，分别表明下游方向和上游方向。在ori之后出现的+标志，表明ori以与pRS中(对于YCp载体)或pYES(对于YEp载体)中相同的方向插入；-标志表明ori以与pRS中(对于YCp载体)或pYES(对于YEp载体)中相反的方向插入。
(8)将YEp型表达载体导入到酵母中为了检查所制备的YEp型表达载体的DNA复制区是否起作用，用Frozen-EZ Yeast Transformation II(Zymo Research，Orange，CA)，将约40ng的每种YEp型表达载体导入YPH499菌株中。(所述程序依照试剂盒所附的方案。)然后，检查在SD-W(DOB+CMS(-Trp)；BIO101，Vista，CA)琼脂平板上于30℃生长的菌落。结果示于以下表4中。
表4

表4所示的结果表明，在本发明中制备的每种YEp型载体作为载体都正常发挥作用。
基因的克隆(1)通过PCR克隆HMG-CoA还原酶基因(HMG1’基因)如下所述，进行酿酒酵母HMG1’基因的克隆。
根据录入GenBank的酿酒酵母来源的HMG1基因的信息(登记号M22002)(M.E.Basson等，Mol.Cell.Biol.8，3797-3808(1988)SEQ IDNO1)，设计一对引物，所述引物对于对应于该基因所编码蛋白质的N末端区和C末端区的那些核苷酸序列是特异性的。使用这些引物，用酵母cDNA文库(Clontech；No.CL7220-1，得自酿酒酵母DBY746)作为模板，进行PCR。
N末端引物(引物1)5’-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3’(SEQ ID NO28)C末端引物(引物2)5’-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3’(SEQ ID NO29)在如下所述的反应溶液中在下述条件下进行PCR于94℃变性45秒、于55℃退火1分钟和于72℃延伸2分钟的30个循环。
10×ExTaq缓冲液(Takara)5μl2.5mM dNTP混合物 4μl5U/μl ExTaq(Takara) 1μl10pmol引物110pmol引物20.5ng cDNA得到总共50μl的溶液在所述PCR后进行的琼脂糖凝胶电泳证实了预期位置的片段(3.2kbp)。将这一3.2 kbp DNA片段克隆到能够进行TA克隆的pT7Blue T载体(Novagen，Madison，WI)中，从而获得pT7HMG1。测定如此克隆的HMG-CoA还原酶基因的核苷酸序列。结果，获得SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列。如此测定的核苷酸序列与GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)中录入的相应核苷酸序列有部分不同(图2A)。包含PCR错误并且编码突变型HMG-CoA还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO4)的这种基因被命名为HMG1’。
(2)HMG1’中PCR错误的校正将HMG1’片段亚克隆到包含编码突变型HMG-CoA还原酶的HMG1’的质粒pT7HMG1中。然后，在野生型HMG-CoA还原酶基因的编码区中发生的因PCR错误所致的氨基酸取代，通过定点诱变来校正，从而制备pALHMG106。这一制备的细节如下所述。
用质粒pT7HMG1作为克隆化HMG1’。作为用于引入定点突变的载体，使用pALTER-1(Promega)。
依照Promega出版的“Protocols and Applications Guide，3rdedition，1996 Promega，ISBN 1-882274-57-1”中所述的程序，进行定点诱变。作为用于引入突变的寡聚物，化学合成以下3种寡聚物。
HMG1(190-216)5′-CCAAATAAAGACTCCAACACTCTATTT-3′(SEQ ID NO30)HMG1(1807-1833)5′-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3′(SEQ ID NO31)HMG1(2713-2739)5′-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3′(SEQ ID NO32)首先，用SmaI、ApaLI和SslI消化pT7HMG1，通过琼脂糖凝胶电泳制备3.2 kbp HMG1’片段。将该片段插入到pALTER-1的SmaI-SacI位点中，以制备pALHMG1。用碱使该质粒变性后，让用于引入突变的上述寡聚物-作为修复寡聚物的Amp修复寡聚物(Promega)和作为敲除寡聚物的Tet敲除寡聚物(Promega)退火到所述质粒上。将所得的质粒导入大肠杆菌ES1301(Promega)中。选择保留其中引入定点突变的质粒的转化体，用125μg/ml氨苄青霉素来培养，以制备质粒DNA。用具有以下所示序列的引物检查所得质粒DNA的核苷酸序列。结果，校正了对应于HMG1(190-260)、HMG1(1807-1833)和HMG1(2713-2739)的所有序列，使得它们具有这些寡核苷酸的序列(SEQ ID NO5)。由校正的核苷酸序列编码的氨基酸序列(SEQ ID NO6)与野生型HMG1所编码所氨基酸序列(SEQ ID NO2)一致；所述校正的序列仅保留沉默突变。虽然这种校正了PCR错误的HMG1具有部分不同的核苷酸序列，但由于它编码氨基酸序列与野生型酶氨基酸序列相同的多肽，所以该基因也被命名为HMG1，在此使用时在该基因与野生型基因HMG1之间无区别。
HMG1(558-532)5′-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3′(SEQ ID NO33)HMG1(1573-1599)5′-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3′(SEQ ID NO34)HMG1(2458-2484)5′-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3′(SEQ ID NO35)携带如此校正的HMG1序列的质粒被命名为pALHMG106(图8)。
(3)牻牛儿牻牛儿二磷酸合酶基因BTS1的克隆如下所述克隆酿酒酵母BTS1基因(也称为GGPP合酶基因)。
根据录入GenBank的酿酒酵母来源的GGPP合酶基因的信息(登记号U31632)(Y.Jiang等，J.Biol.Chem.270(37)，21793-21799(1995))，设计如下所述的匹配所述酶的N末端区和C末端区的一对引物。使用这些引物，用酵母cDNA文库(CL7220-1)作为模板，进行PCR。
N末端引物5′-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3′(SEQ ID NO36)C末端引物5′-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3′(SEQ ID NO37)在具有类似于以上(1)中所述反应溶液的组成的反应溶液中，在下述条件下进行PCR于94℃变性45秒、于55℃退火1分钟和于72℃延伸2分钟，进行30个循环。
在所述PCR后进行的琼脂糖凝胶电泳证实了具有正确迁移率的片段(相当于约1.0kbp)。将这一BTS1基因克隆到能够进行TA克隆的pT7BlueT载体中，然后测定这一BTS1基因完整区的序列。结果表明，该基因的核苷酸序列与GenBank中录入的所述核苷酸序列完全相同。因此，证实该基因是酿酒酵母来源的GGPP合酶基因。
pT7BlueT载体用BamHI和SalI消化，以切下BTS1基因，然后将其导入到pYES2(Invitrogen)的BamHI-XhoI位点。获得的重组质粒被命名为pYESGGPS。
(4)大肠杆菌来源的FPP合酶基因ispA的克隆采用以下程序，从大肠杆菌JM109(Takara)制备大肠杆菌基因组DNA。将JM109细胞在1.5ml 2xYT培养基中培养，通过离心收获。向这些细胞中加入567μl TE(pH 8.0)、3μl 20mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)和30μl 10％SDS。将所得混合物于37℃静置1小时，然后向其中加入100μl 5M NaCl并进行混合。向其中加入80μl CTAB/NaCl溶液(10％CTAB，0.7M NaCl)，将所得混合物于65℃加热10分钟。然后，该混合物通过700μl氯仿/异戊醇(24∶1)抽提进行处理，用600μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)再次进行抽提，以获得水层，然后将水层离心。沉淀用70％乙醇洗涤，干燥，然后溶于100μl TE(pH 8.0)中，从而获得大肠杆菌基因组DNA溶液。于OD260测量和定量测定DNA。然后，向所述溶液中加入TE，使DNA浓度为1μg/μl。
使用如此获得的大肠杆菌基因组DNA作为模板，使用以下合成寡聚DNA引物，通过PCR克隆大肠杆菌来源的FPP合酶基因ispA。
ISPA15′-TGA GGC ATG CAA TTT CCG CAG CAA CTC G-3′(SEQ ID NO68)ISPA25′-TC AGA ATT CAT CAG GGG CCT ATT AAT AC-3′(SEQ ID NO69)在含有1×ExTaq缓冲液、0.5mM dNTP、100pmol ISPA1、100pmol ISPA2、0.2μg大肠杆菌基因组DNA和5单位ExTaq的100μl反应溶液中，在以下条件下进行PCR于94℃变性1分钟、于55℃退火1分钟和于72℃延伸1.5分钟，进行30个循环。PCR产物用EcoRI和SphI消化。然后，通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得的1.0kbp片段，将其插入pALTER-Ex2(Promega)的EcoRI-SphI位点，然后将其导入到大肠杆菌JM109中，以便克隆所述基因。用EcoRI、SphI、NdeI、SmaI和BamHI进行的限制性酶切图谱分析表明，ispA基因(SEQ ID NO7)已经正确地导入了所获得的3种质粒即pALispA4、pALispA16和pALispA18中。
(5)突变型FPP合酶基因的制备使用质粒pALispA16，依照Promega出版的“Protocols andApplications Guide，3rdedition，1996，Promega，ISBN 1-882274-57-1”中所述的程序，通过取代，修饰编码大肠杆菌ispA所编码多肽中79位的氨基酸残基Tyr的密码子。通过化学合成，制备以下用于引入突变的寡聚物(也称为“突变寡聚物”)。
ISPA-D5′-ATC ATG AAT TAA TGAGTCAGC GTG GAT GCA TTC AAC GGCGGC AGC-3′(SEQ ID NO70)ISPA-E5′-ATC ATG AAT TAA TGATTCAGC GTG GAT GCA TIC AAC GGCGGC AGC-3′(SEQ ID NO71)ISPA-M5′-ATC ATG AAT TAA TGACATAGC GTG GAT GCA TTC AAC GGCGGC AGC-3′(SEQ ID NO72)
设计上述突变寡聚物ISPA-M，使得16位-18位的核苷酸(以下划线标注的3个核苷酸)编码Met，所述核苷酸对应于野生型基因中第79位氨基酸残基Tyr的密码子。同样，设计突变寡聚物ISPA-D和ISPA-E，使得相应的密码子分别编码Asp和Glu。在这些突变寡聚物中，设计26位-31位的核苷酸(以下划线标注的6个核苷酸)，使得通过所述取代突变，新形成EcoT22I(NsiI)位点。因此，如此布置，使得通过限制性酶切图谱分析，可以容易地将这些突变型基因与野生型基因区别开来。所述突变寡聚物预先用T4多核苷酸激酶(Promega)处理，以将其5’端磷酸化，在使用之前用Nick Column(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)通过凝胶过滤纯化。为了引入突变，也使用作为修复寡聚物的Cm修复寡聚物(Promega)和作为敲除寡聚物的Tet敲除寡聚物(Promega)。使Cm修复寡聚物、Tet敲除寡聚物和所述突变寡聚物退火到碱变性的pALispA16上，然后将其转化到大肠杆菌ES1301 mutS(Promega)。从在20μg/ml氯霉素(Cm)存在下生长的大肠杆菌菌落制备质粒DNA，将其转化到大肠杆菌JM109中。从在含20μg/ml Cm的琼脂平板上生长的大肠杆菌菌落制备质粒DNA。用pALispA4作为模板并且使用ISPA-D、ISPA-E和ISPA-M作为突变寡聚物制备的含取代突变型ispA基因(命名为ispAm基因)的质粒，被分别命名为p4D、p4E和p4M。用pALispA16作为模板同样制备的那些质粒被分别命名为p16D、p16E和p16M。用pALispA18作为模板同样制备的那些质粒被分别命名为p18D、p18E和p18M。
(6)IPPΔ异构酶基因idi的克隆大肠杆菌IPPΔ异构酶基因先前称为ORF182(依照NCBI BLAST搜索；GenBank登记号AE000372)，但是Hahn等((1999)J.Bacteriol.，1814499-4504)将该基因命名为idi。作为其中克隆了idi(SEQ ID NO85，编码SEQ ID NO86中所示的氨基酸序列)的质粒，在本发明中使用Hemmi等，(1998)J.Biochem.，1231088-1096中所述的p3-47-11和p3-47-13。
(7)嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶基因的克隆在特开平5-219961号中描述的质粒pFE15用NotI和SmaI消化。纯化含有一个转录单位的所得2.9kbp嗜热脂肪芽孢杆菌FPP合酶基因(在下文称为“fps”)(SEQ ID NO75；编码SEQ ID NO76中所示的氨基酸序列)片段，将其插入到pACYC177(Nippon Gene)的ScaI位点，获得质粒pFE15NS2.9-1。
将基因插入到表达载体中(1)亚克隆到pRS表达载体中将HMG1基因引入到在本发明中制备的各个pRS载体(图6和图7)中，所述载体都是含有组成型转录启动子的大肠杆菌-酿酒酵母YEp穿梭载体。
含有PCR错误校正型HMG-CoA还原酶基因的pALHMG106(图8)用SmaI和SalI消化。通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得的3.2kbp HMG1片段，将其插入到pRS434GAP、pRS444GAP、pRS434TEF、pRS444TEF、pRS434PGK和pRS444PGK的SmaI-SalI位点。通过用XhoI、SpeI、NaeI和SphI进行限制性酶切图谱分析，以及通过证实所插入的3.2kbp HMG1片段的边界区域的核苷酸序列，检查其中已经亚克隆所述基因的那些质粒的物理图谱。然后，选择确实如计划构建的那些质粒，并且将其命名为pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1和pRS444PGK-HMG1。
(2)pRS414PTadh-HMG1和pRS414TPadh-HMG1的制备含有组成型转录启动子ADH1p的载体pRS414PTadh和pRS414TPadh(图6)用SmaI和SalI消化，然后进行如以上(1)中所述相同的操作。结果，构建了分别含有插入其中的HMG1基因的质粒pRS414PTadh-HMG1和pRS414TPadh-HMG1。
(3)HMG1’表达质粒pYES-HMG1的制备在实施例(2)的(1)中制备的pT7HMG1用BamHI、SalI和ScaI消化，以切下由于PCR错误所致的编码突变型HMG-CoA还原酶的HMG1’基因。然后，将该基因插入到pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA)的BamHI-XhoI位点。所得的重组载体被命名为pYES-HMG1。测定该载体内核苷酸序列的结果是，证明该序列与SEQ ID NO3中所示的核苷酸序列相同。上述质粒pYES2是一种用于在酵母中表达的穿梭载体，它具有作为复制起点的酵母2μm DNA ori和可由半乳糖诱导的GAL1转录启动子(图4)。
(4)缺失突变型HMG1’表达质粒pYHMGxxy的制备为了制备用于表达缺失突变型HMG-CoA还原酶基因的载体，其中所述缺失突变型HMG-CoA还原酶基因缺失了据信是HMG-CoA还原酶催化结构域的结构域的上游区的编码核苷酸序列；使用上述(3)中构建的pYES-HMG1作为模板，通过PCR制备缺乏HMG1’编码区的一部分与所述载体部分的片段。所得的片段用Klenow酶平端化，然后通过自身连接再次环化，然后转化到大肠杆菌JM109中。然后，从所述转化体制备质粒DNA。用作引物的合成DNA的序列及其组合示于表1中。
对于所获得的每种质粒DNA，用373A DNA测序仪(Perkin Elmer，Foster City，CA)证实在HMG1上游和下游氨基酸的读框中没有移码，并且在接点周围没有由于PCR错误所致的氨基酸取代。结果，获得了以下质粒，所述质粒在接点周围没有由于PCR错误所致的氨基酸取代，并且其中可以连续制备缺失，而读框没有任何移码。HMG1基因的缺失突变体依照缺失模式表示为例如“Δ02y”(其中y表示可以是任何数字的工作编号)，而包含Δ02y的pYES2载体表示为例如pYHMG026。(这适用于其它缺失突变体。)HMG1Δ02ySEQ ID NO7HMG1Δ04ySEQ ID NO8HMG1Δ05ySEQ ID NO9HMG1Δ06ySEQ ID NO10HMG1Δ07ySEQ ID NO11HMG1Δ08ySEQ ID NO12HMG1Δ10ySEQ ID NO13HMG1Δ11ySEQ ID NO14HMG1Δ12ySEQ ID NO15HMG1Δ13ySEQ ID NO16载体YHMG026、pYHMG027、pYHMG044、pYHMG045、pYHMG062、pYHMG063、pYHMG065、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG083、pYHMG085、pYHMG094、pYHMG100、pYHMG106、pYHMG107、pYHMG108、pYHMG109、pYHMG112、pYHMG122、pYHMG123、pYHMG125和pYHMG133。AURGG101的制备用实施例(2)的(3)中描述的pYESGGPS作为模板，使用以下引物PYES2(1-27)和PYES2(861-835)，通过PCR制备具有GAL1转录启动子-BTS1-CYC1转录终止子(GAL1p-BTS1-CYC1t)一级结构的1.9kbpSalI片段。
PYES2(1-27)5′-GGC CGC AAA TTA AAG CCT TCG AGC GTC-3′(SEQ ID NO73)PYES2(861-835)5′-ACG GAT TAG AAG CCG CCG AGC GGG TGA-3′(SEQ IDNO74)将该片段插入到pAUR101(Takara)的SalI位点，获得pAURGG115。通过DNA测序证实，pAURGG115中的BTS1基因没有PCR错误。
pAURGG115用Eco065I线性化，并且通过乙酸锂法导入到A451菌株中。然后，选择在含有1μg/ml金担子菌素的YPD琼脂平板(1％酵母膏、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)上于30℃生长的菌落作为转化体。将所得的转化体再次在金担子菌素选择平板上培养，以选择单菌落。
结果，从A451菌株获得作为重组体的两个克隆-AURGG101和AURGG102。在本发明中，用AURGG101作为A451衍生的宿主克隆之一。
正如DNA印迹杂交(图9)和PCR作图(图10)所揭示的，BTS1在AURGG102中整合到基因组中，而在AURGG101中未整合到基因组中。在AURGG101中，发现仅AUR1被AUR1-C(一种标记基因)所取代。由于AUR1不直接参与异戊二烯醇或异戊二烯二磷酸的合成，所以有可能使用AURGG101作为A451衍生的宿主克隆的一个例子。
以下在实施例6中提供关于DNA印迹杂交、RNA印迹杂交和PCR作图的细节。
EUG菌株的制备从酵母基因组数据库获得角鲨烯合酶基因ERG9周围的基因图谱。根据该图谱，设计用于扩增供取代ERG9转录启动子(ERG9p)用的DNA片段的PCR引物DNA(图2)。另一方面，通过用NaeI和NheI消化pYES2、用Klenow酶平端化并且通过自身连接缺失了2μori，获得pYES2Δ；用pYES2Δ作为模板，通过PCR扩增，制备包含转化体选择标记基因URA3和转录启动子GAL1p的1.8kbp DNA片段。
所述PCR中所用的引物如下。
E-MCSf5′-GCC GTTGAC AGA GGG TCC GAG CTC GGT ACC AAG-3′(SEQID NO49)E-URA3r5′CAT ACTGAC CCA TTG TCA ATG GGT AAT AAC TGA T-3′(SEQID NO50)在上述引物中，加入Eam1105I识别位点(下划线部分)，使得可以使用(i)包含酿酒酵母基因组中可读框YHR189W的下游部分的0.7kbpDNA片段和(ii)包含ERG9上游部分的0.9kbp DNA片段，来进行T/A连接。用以下引物YHR189Wf和YHR189Wr，并且用YPH499基因组DNA作为模板，通过PCR制备YHR189W片段。用以下引物ERG9f和ERG9r，并且用YPH499基因组DNA作为模板，通过PCR制备ERG9片段。YPH499基因组DNA用Dr.GenTLETM来制备。
YHR189Wf5′-TGT CCG GTA AAT GGA GAC-3′(SEQ ID NO51)YHR189Wr5′-TGT TCT CGC TGC TCG TIT-3′(SEQ ID NO52)ERG9f5′-ATG GGA AAG CTA TTA CAA T-3′(SEQ ID NO53)ERG9r5′-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3′(SEQ ID NO54)所述1.8kbp DNA片段用Eam1105I消化，然后与所述0.7kbpDNA片段连接。用所得的片段作为模板，使用上述引物YHR189Wf和E-MCSf进行第二次PCR。扩增的2.5kbp DNA片段用Eam1105I消化，然后与所述0.9kbp片段连接。用所得的片段作为模板，使用下述引物YHR189W-3f和ERG9-2r进行第三次PCR。结果，扩增了一种3.4kbp DNA片段。将其用作供转化用的DNA片段。
YHR189W-3f5′-CAA TGT AGG GCT ATA TAT G-3′(SEQ ID NO55)ERG9-2r5′-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3′(SEQ ID NO56)用从Zymo Research(Orange，CA)购买的Frozen EZ YeastTransformation II Kit，将载体导入酵母菌株中。所得的重组体在称为SGR-U培养基的琼脂培养基上于30℃培养，所述培养基通过加入CSM(-URA)(购自BIO 101，Vista，CA)和硫酸腺嘌呤(终浓度为40mg/L)至SGR培养基(SD培养基的一种变体，其中葡萄糖组分被半乳糖和棉子糖取代)而获得。将在所述培养基上生长的菌落再次涂布到相同的培养基上，培养，然后进行单菌落分离。
所得的重组体被命名为EUG(ERG9p∷URA3-GAL1p)菌株。其中，来源于A451菌株的克隆被命名为EUG1至EUG10；来源于YPH499菌株的克隆被命名为EUG11至EUG20；而来源于YPH500菌株的克隆被命名为EUG21至EUG30。
所述菌株在SD培养基上培养，以选择由于葡萄糖阻抑所致的ERG9表达受抑制而表现出生长表现的那些克隆。结果，从A451获得EUG8，从YPH499获得EUG12，而从YPH500获得EUG27。
用Dr.GenTLETM，分别从EUG8、EUG12和EUG27制备基因组DNA。用基因组DNA作为模板的PCR结果证实，含有URA3和GAL1p的1.8kbp PCR片段整合到每个菌株基因组中ERG9编码区的上游。
基因和酶活性分析在该实施例中，通过测定异戊二烯二磷酸合酶的酶活性，以及采用各种技术包括RNA印迹杂交、DNA印迹杂交和PCR作图，分析本发明中制备的各种重组酵母中基因的表达(关于其制备，参见实施例7和8，实施例7和8描述了异戊二烯醇的生产)。在所制备的重组体中，在该实施例中使用以下所列的宿主菌株和重组体。依照CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，第13.7.1-13.7.2页中所述的乙酸锂法，或者通过用Frozen EZ Yeast Transformation II试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)的方法，依照试剂盒所附的方案，将各种载体导入宿主中。将pYES-HMG1导入A451中，获得克隆1-2；将pYHMG044导入A451中，获得克隆3-2；将pYES-HMG1导入AURGG101中，获得克隆13-2；而将pYHMG044导入AURGG101中，获得克隆15-2。
No.1宿主菌株A451No.2 GAL1p-BTS1(YIp)AURGG101(A451，aur1∷AUR1-C)No.3 GAL1p-BTS1(YIp)AURGG102(A451，aur1∷BTS1-AUR1-C)No.4 GAL1p-HMG1(YEp)1-2(pYES-HMG1/A451)No.5 GAL1p-HMG1Δ(YEp)3-2(pYHMG044/A451)No.6 GAL1p-HMG1(YEp)13-2(pYES-HMG1/AURGG101)No.7 GAL1p-HMG1Δ(YEp)15-2(pYHMG044/AURGG101)将克隆1号-7号分别在26℃预培养。1ml的预培养物用生理盐水洗涤，加入至100ml培养肉汤中，在300ml锥形瓶中于26℃以120次/min往复式振荡培养。用SD培养基或SG培养基(其中SD培养基的葡萄糖组分被半乳糖取代)进行培养。在SD-U[加入CSM(-URA)的SD培养基]或SG-U[加入CSM(-URA)的SG培养基]中培养保留URA3标记的重组体。在1μg/L金担子菌素存在下培养AURGG克隆。
于OD600测定细胞生长。当OD600值达到大约3-4(23-52小时)时，停止培养。将培养物在冰中冷却，然后如下所述制备DNA、RNA和粗制酶溶液。
(1)DNA印迹分析用酵母DNA制备试剂盒Dr.GenTLETM，依照试剂盒所附的方案，制备酵母DNA。
将从酵母中如此制备的DNA用NdeI和StuI消化，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(3μg/泳道)。作为分子量标记，使用1kb分子量梯和λ/HindIII(都得自Promega，Madison，WI)各0.5μg。电泳后，用碱使DNA变性，中和，然后依照常规方法，用20×SSC通过毛细管转印，转移到Hybond N尼龙膜(Amersham，Buckinghamshire，England)上。用UV交联剂(Stratagene)，在最适交联条件下对所得的膜进行UV照射，从而将DNA固定在膜上。
(2)RNA印迹分析依照Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，第13.12.2-13.12.3页中所述的方法并加以部分修改，制备RNA。所述修改是一旦制备了RNA样品，则将其用DNA酶I进一步处理。
在通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA后，依照常规方法，用20×SSC通过毛细管转印，将RNA转移到Hybond N尼龙膜上。每个泳道用5微克总RNA进行电泳。作为分子量标记，使用20ngDIG-RNA Marker I。用UV交联剂(Stratagene)，在最适交联条件下对所得的膜进行UV照射，从而将RNA固定在膜上。
(3)PCR作图为了检查得自AURGG115(在实施例4中制备的YIp载体)的片段如何整合到基因组中，用0.3-0.6μg以上制备的酵母DNA作为模板，使用合成寡核苷酸引物AUR-FWc和AUR-RVc或者AUR-SAL1和AUR-SAL2的组合，进行PCR。PCR条件如下于94℃变性30秒、于55℃退火1分钟和于72℃延伸3分钟，进行30个循环。
AUR-FWc5′-TCT CGA AAA AGG GTT TGC CAT-3′(SEQ ID NO57)AUR-RVc5′-TCA CTA GGT GTA AAG AGG GCT-3′(SEQ ID NO58)AUR-SAL15′-TGT TGA AGC TTG CAT GCC TGC-3′(SEQ ID NO59)AUR-SAL25′-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA-3′(SEQ ID NO60)(4)DIG标记探针DNA的制备作为杂交探针，制备探针I、II、III和V(表5)。
表5.杂交探针探针编号 基因 模板 引物1 引物2IERG20pT7ERG20 SCFPS1 SCFPS2II BTS1 pYES2-GGPS6 BTS 1 BTS1(1-21) (1008-982)III HMG1 pYHMG1HMG1 HMG1(1267-1293)(2766-2740)VAUR1 pAUR123 AUR-RV AUR-FW探针I使用以下合成寡核苷酸SCEPS1和SCEPS2作为引物，从酿酒酵母cDNA文库(Clontech，Palo Alto，CA)获得PCR片段，将其克隆到pT7blue T载体中。从而制备pT7ERG20。
SCFPS15′-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3′(SEQ ID NO61)SCFPS25′-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3′(SEQ ID NO62)用pT7ERG20作为模板，使用SCEPS1和SCEPS2作为引物，用PCR DIG Probe Synthesis Kit(PCR DIG探针合成试剂盒)(RocheDiagnostics，Mannheim Germany)合成DIG(洋地黄毒苷)标记的探针DNA。实验条件依照试剂盒所附的生产商的方案。
PCR条件如下于94℃变性30秒、于58℃退火1分钟和于72℃延伸3分钟，进行30个循环。对所得的DIG标记探针DNA进行琼脂糖凝胶电泳，以检查合成情况。
探针II以探针I所用的相同方式，用以下合成寡核苷酸作为引物，用pYESGGPS(参见实施例2的(3))作为模板，合成DIG标记探针DNA。
BTS1(1-21)5′-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG-3′(SEQ ID NO63)BTS1(1008-988)5′-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC-3′(SEQ ID NO64)探针III以探针I所用的相同方式，用以下合成寡核苷酸作为引物，用pYES-HMG1(参见实施例3的(3))作为模板，合成DIG标记探针DNA。
HMG1(1267-1293)5′-AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT-3′(SEQ IDNO42)HMG1(2766-2740)5′-TCC TAA TGC CAA GAA AAC AGC TGT CAC-3′(SEQ ID NO65)探针V以探针I所用的相同方式，用以下合成寡核苷酸作为引物，用pAUR123(Takara)作为模板，合成DIG标记探针DNA。
AUR-FW5′-ATG GCA AAC CCT TTT TCG AGA-3′(SEQ ID NO66)AUR-RV5′-AGC CCT CTT TAC ACC TAG TGA-3′(SEQ ID NO67)(5)杂交和探针的检测用DIG Easy Hyb(Roche)，以20ng/ml的探针浓度，于42℃进行DNA印迹杂交达24小时。用DIG Easy Hyb，以100ng/ml的探针浓度，于50℃进行RNA印迹杂交达24小时。在每次杂交之前，在杂交所用的相同温度下，在DIG Easy Hyb溶液中预杂交24小时。在杂交后，所述膜用2×SSC、0.1％SDS于65℃洗涤3次，每次10分钟，然后用0.2×SSC、0.1％SDS于65℃洗涤2次，每次15-20分钟。此后，使用DIG Luminescent Detection Kit(DIG发光检测试剂盒)(Roche)，让膜中的DIG标记探针产生化学发光，然后将所述印迹对X胶片曝光，以便显现。
(6)酶活性的测定通过离心从每种培养肉汤收获细胞，用与RNA制备中相同的方式，用玻璃珠于4℃破碎细胞。然后，将细胞悬浮于无菌水中。用冷冻微量离心机将悬浮液以12,000r.p.m.离心10分钟，回收所得的上清液作为粗制酶级分。用BSA作为标准蛋白质，通过Bio-Rad ProteinAssay(蛋白质测定)(Bio-Rad，Hercules，CA)测定粗制酶级分中的蛋白质浓度。在200μl下述反应混合物中，让10μg粗制酶级分于37℃反应40分钟。
0.125mM[14C]IPP(185 GBq/mol)0.125mM牻牛儿二磷酸(Sigma Chemical，St.Louis，MO)100mM Tris HCl(pH 7.0)10mM NaF，5mM MgCl25mM 2-巯基乙醇0.05％Triton X-1000.005％BSA反应后，延伸的异戊二烯二磷酸用水饱和的丁醇提取。用液体闪烁计数器对一等份异戊二烯二磷酸测定放射性。剩余的样品用马铃薯酸性磷酸酶去磷酸化，点样到薄层层析板[板LKC18(Whatman，Clifton，NJ)上，然后让所述板展开[展开剂H2O/丙酮＝1∶19]。放射自显影图用Bio Image Analyzer(图象分析仪)BAS2000(Fuji Film)显现，依照Koyama等的方法(Koyama T.，Fujii，H.和Ogura，K.，1985，Meth.Enzymol.110153-155)测定相对放射性。
(7)结果与观察(7-1)DNA印迹杂交和PCR作图DNA印迹杂交的结果示于图9。AUR1附近的PCR作图结果示于图10。在图9和图10中，第1泳道至第7泳道对应于(6)中所用的克隆编号(1号至7号)。“N”代表用NdeI消化的DNA；而“S”代表用StuI消化的DNA。各个泳道中所用的DNA从以下菌株制备。
第1泳道A451；第2泳道AURGG101；第3泳道AURGG102；第4泳道pYES-HMG1/A451；第5泳道pYHMG044/A451；第6泳道pYES-HMG1/AURGG101；第7泳道pYHMG044/AURGG101发现ERG20(FPP合酶基因)以相同方式包含在所测试的所有克隆中，并且在每个克隆的基因组中ERG20附近没有变化(图9)。
当用BTS1(GGPP合酶基因)和AUR1作为探针时，发现BTS1在AURGG102中整合到AUR1区中，但在AURGG101中出现的条带与在宿主菌株A451中出现的条带相同。在AuRGG101中，仅AUR1基因被pAUR101来源的AUR1-C基因取代；发现GAL1-BTS1片段并未整合到该克隆的基因组中。通过PCR检测到由于基因组整合所致的AUR1基因座重复。正如所预期的，在AURGG101中检测不到条带，而仅在AURGG102中检测到条带(图10)。
在图9中，当用HMG1作为探针时，在NdeI消化的DNA(第4-7泳道)中出现质粒来源的条带。在StuI消化的DNA中，预期来源于质粒的8.2kbp条带(与来源于基因组的8.3kbp重叠)应该出现在克隆1-2(4号)中。然而，在克隆13-2(6号)和克隆15-2(7号)中观察到由于基因组中HMG1附近与所导入的质粒之间的重组而引起的条带移位(shift)。
根据DNA印迹杂交和PCR作图的结果，可以总结出此时所用克隆的基因型，如以下表6中所示。在该表中，“AUR”是指加入了金担子菌素的培养基。“培养基1”是指预培养用的培养基，而“培养基2”是指后续培养用的培养基。
表6整合的质粒中的克隆号命名基因 基因 培养基1 培养基21 A451- -SDSG2 AURGG101- -SD-AURSG-AUR3 AURGG102BTS1 -SD-AURSG-AUR4 1-2 - HMG1 SD-U SG-U5 3-1 - HMG1Δ044SD-U SG-U6 13-2- HMG1 SD-U-AUR SG-U-AUR7 15-2- HMG1Δ044SD-U-AUR SG-U-AUR
(7-2)RNA印迹杂交RNA印迹杂交的结果示于图11。用表5中所示的探针I、II和III作为探针。
在图11中，第1泳道至第7泳道中所用的克隆与图9中所用的克隆相同。标志“-”指示在SD培养基中的转录物，而标志“+”是指SG培养基中的转录物。
当通过SG培养基应用GAL1p转录诱导时，ERG20转录物在克隆13-2(6号)和15-2(7号)中显示出降低的倾向。
当用SG培养基诱导处于GAL1转录启动子控制下的基因转录时，BTS1转录物的诱导仅在其中GAL1p-BTS1片段整合到基因组中的克隆即AURGG102(3号)中增加。
然而，当与HMG1转录物相比时，观察到BTS1的转录诱导程度较低。当用SG培养基诱导转录时，HMG1转录物在其中通过质粒转移了GAL1p-HMG1片段的克隆4号至7号中显著增加。
(7-3)异戊二烯二磷酸合酶的活性用牻牛儿二磷酸(GPP)和[14C]标记的IPP作为烯丙基二磷酸底物，测定粗制酶级分中异戊二烯二磷酸合酶的活性。
将用GPP和[14C]IPP作为底物合成的异戊二烯二磷酸去磷酸化，并通过TLC分析。然后，检查板上每个点的放射性。结果，FPP合酶活性高，检测到HexPP(六异戊二烯基二磷酸)合酶活性仅次于FPP合酶活性，且远高于GGPP合酶活性。然后，根据放射自显影图计算反应产物的相对量，然后计算每种总蛋白的比活。结果示于图12中。在图12A中，上图显示FPP合酶(FPS)活性，下图显示GGPP合酶(GGPS)活性。在图12B中，上图显示HexPP合酶(HexPS)活性，而下图显示PTase(总异戊二烯二磷酸合酶)活性。灰色条柱表示用SD培养基的结果，白色条柱显示用SG培养基的结果。总异戊二烯二磷酸合酶活性中的大部分是FPP合酶活性。观察到用SG培养基引起的该活性的增加。特别是，总异戊二烯二磷酸合酶活性在产生大量FOH的克隆13-2(6号)和克隆15-2(7号)(参见实施例9)中显著增加。总的来讲，当用GPP作为烯丙基底物时，GGPP合酶活性约为FPP合酶活性的1/20000，约为HexPP合酶活性的1/300。HexPP合酶活性在SG培养基中降低。
重组体的培养和异戊二烯醇的生产(1)当将具有组成型启动子的HMG1基因导入A451时(这样一种重组体表示为“组成型启动子；HMG1；A451；这种表示方式适用于说明书的其余部分)异戊二烯醇的生产。
对于FOH高产重组体的工业应用，应用组成型启动子是有利的，因为它允许使用便宜的常规培养基。然后，用在初步实验中被鉴定为具有生产FOH潜力的酿酒酵母A451(ATCC200589)作为宿主，让HMG1基因在组成型启动子控制下表达。
将HMG1基因(PCR错误校正型基因)导入分别含有组成型启动子GAPp(＝TDH3p)的载体pRS434GAP或pRS444GAP，从而分别制备pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1。将这些质粒导入A451中，获得重组体，所述重组体被命名为pRS434GAP-HMG1/A451和pRS444GAP-HMG1/A451。
从导入了HMG-CoA还原酶基因的每种酵母重组体中，随机选择10个菌落。将这些菌落接种到作为标记基因TRP1的SD选择培养基的SD-W培养基[通过加入CSM(-TRP)至SD中而获得的]中，进行预培养。然后，将250μl预培养物(当预培养具有组成型启动子的酵母重组体时，不仅在该实验中加入此量，而且在以后描述的其它实验中也加入此量)加入到2.5ml YM培养基中，于26℃以130r.p.m旋转振荡培养4天。
在培养完成后，加入2.5ml甲醇至培养肉汤中，并进行混合。然后，向其中加入约5ml戊烷，并且剧烈搅拌。将所得的混合物静置。将戊烷层转移到新的玻璃试管中，然后在气流中(in a draft)蒸发戊烷，从而浓缩溶质组分。然后，对所得的溶液进行气相色谱/质谱(GC/MS)，以鉴定异戊二烯醇，并且用十一烷醇作为内标对其进行定量测定。此时，为了检查细胞生长的程度，用水将50μl培养肉汤稀释30倍，然后测定600nm的吸光度。
用HP6890/5973 GC/MS系统(Hewlett-Packard，Wilmington，DE)进行GC/MS。所用的柱子是HP-5MS(0.25mm×30m；膜厚度为0.25μm)。分析条件如下所述。对于本说明书中的所有GC/MS分析，使用相同的条件。
入口温度250℃检测器温度260℃[MS区温度]MS Quad150℃MS源230℃质量扫描范围35-200[注射参数]自动注射模式样品体积2μl甲醇洗涤3次；己烷洗涤2次分流比1/20载气氦气1.0ml/min溶剂延迟2min[炉加热条件]115℃90秒以70℃/min加热至250℃，保持2分钟以70℃/min加热至300℃，保持7分钟在时间0后内标0.01μl 1-十一烷醇的乙醇溶液可靠性标准(E)-橙花叔醇(Eisai)(全E)-法尼醇(Sigma)(全E)-牻牛儿牻牛儿醇(Eisai)角鲨烯(Tokyo Kasei Kogyo)异戊二烯醇产量测定的结果示于图13-15中。图14显示从图13中所示的pRS434的3号克隆选择10个菌落的结果。图15显示了图13中所示数据的总结。在图14的10号菌落(pRS434)中，鉴定出4.9mg/L的FOH产量。在图15中，“434”和“444”表示分别使用pRS434GAP和pRS444GAP载体时的结果。最右边的条柱表示在基因转移之前培养宿主(A451)的结果。
这些结果表明，当用A451作为宿主时，在pRS434GAP-HMG/A451中NOH和FOH的产率都提高。仅仅通过激活HMG1基因的转录，平均可以产生3.8mg/L的FOH，最高为11.2mg/L(图13)。在pRS444GAP-HMG1/A451中，NOH的产量最高为0.16mg/L；发现该克隆主要在FOH生产方面有效。
认为A451在角鲨烯合酶活性和甲羟戊酸途径活性之间的平衡方面不同于常规所用的重组DNA宿主菌株(例如YPH499)，并且当存在多拷贝HMG1基因或者激活该基因的转录时，中间代谢物-法呢二磷酸(FPP)积累；结果，产生FOH(FPP的一种去磷酸化产物)。另一方面，认为由于在A451基因型中观察到的CAN1或ARO7的突变，赋予A451生产FOH的能力。这意味着，可以预测，在角鲨烯合酶活性和甲羟戊酸途径活性之间具有与A451相似的平衡的任何菌株、或者在CAN1和/或ARO7中有突变的任何菌株在导入HMG1后将生产FOH。关于FOH的生产，观察到应用pRS434GAP载体比应用pRS444GAP载体表现出更高的产率的倾向。
(2)组成型启动子；HMG1；YPH499以下所列的质粒是通过将HMG1基因(PCR错误校正型基因)插入到包含组成型启动子ADH1p、GAPp(＝TDH3p)、PGK1p或TEF2p的载体pRS414PTadh、pRS414TPadh、pRS434GAP、pRS444GAP、pRS434PGK、pRS444PGK、pRS434TEF或pRS444TEF而获得的，将这些质粒导入YPH499中。
pRS414PTadh-HMG1pRS414TPadh-HMG1pRS434GAP-HMG1pRS444GAP-HMG1pRS434PGK-HMG1pRS444PGK-HMG1pRS434TEF-HMG1pRS444TEF-HMG1所得的重组体在补充40μg/ml硫酸腺嘌呤的YM培养基中培养(当用YPH499作为宿主时，对于其它重组体使用相同的培养基)。培养条件与以上(1)中所述条件相同。在培养完成后，对得自培养肉汤的戊烷提取物级分进行GC/MS分析。测定异戊二烯醇(NOH和FOH)的产量。
结果示于图16中。在图16中，“414PT”、“414TP”、“434”和“444”代表当分别使用pRS414PTadh、pRS414TPadh、pRS434xxx和pRS444xxx(其中XXX表示启动子中所用的基因名称的字母部分)载体时的结果。最右边的条柱代表在基因转移之前培养宿主(YPH499)的结果。如图16中所示，在每个重组体中FOH的产量都得到改善，并且在导入pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1或pRS444PGK-HMG1的YPH499克隆中观察到NOH产率的提高。
(3)组成型启动子；HMG1；EUG选择来源于A451、YPH499或YPH500、表现出Glc生长抑制并且在基因组中完整整合了目标DNA的EUG克隆(即EUG8、EUG12和EUG27)。然后，将通过将HMG1基因(PCR错误校正型基因)插入到包含组成型启动子GAPp(＝TDH3p)的载体pRS434GAP或pRS444GAP中而获得的质粒pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1导入到EUG8(NOH产量0.021mg/L；FOH产量0.20mg/L)、EUG12(NOH产量0.13mg/L；FOH产量5.9mg/L)和EUG27(NOH产量0.038mg/L；FOH产量3.2mg/L)中。测定所得重组体中的异戊二烯醇产量。
结果示于图17(EUG8)、图18(EUG12)和图19(EUG27)中。
EUG克隆当在含有葡萄糖(Glc)作为碳源的YM培养基中培养时生产FOH。诱导HMG1基因改善了FOH的产率。A451衍生的EUG8在生产分布型方面不同于YPH499衍生的EUG12和YPH500衍生的EUG27。认为来源于YPH菌株的克隆更适合于生产。
这些结果表明，通过导入HMG1提高A451衍生克隆、YPH499衍生克隆和YPH500衍生克隆的异戊二烯醇产率是可能的。
(4)诱导型启动子；HMG1；A451或AURGG101将通过插入HMG1’(HMG1的PCR错误突变体)到包含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2中而获得的质粒pYES2-HMG，导入到在实施例4中制备的A451和AURGG101(A451，aurl∷AUR1-C)。
预培养每种所得的重组体。然后，将25μl预培养物(当预培养具有诱导型启动子的酵母重组体时，不仅在该实验中加入此量，而且在以后所述的其它实验中也加入此量)加入到2.5ml SG培养基中，于26℃以130r.p.m.旋转振荡培养4天。在加入到SG培养基之前，细胞用生理盐水洗涤，使得不会将葡萄糖组分带入SG培养基中。在SG培养基中培养完成后，测定异戊二烯醇(NOH和FOH)的产量。
结果，pYES2-HMG1/AURGG101克隆平均生产1.43mg/L的NOH和4.31mg/L的FOH。因此，甚至在转移了包含HMG1’(一种突变型MMG1)的pYES-HMG1的那些重组体中，也获得异戊二烯醇高产克隆(图20)。图20A显示了使用A451时的结果。图20B显示了使用AURGG101时的结果。pYES是一种用于基因转移的载体。
当用从A451衍生的AURGG101作为宿主，而用GAL1p作为启动子时，获得了尤其高产FOH的克隆。
(5)诱导型启动子；HMG1；W303-1A或W303-1B将通过插入HMG1到包含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2中而获得的质粒pYES2-HMG，导入到W303-1A和W303-1B中。所得的重组体在SG培养基中培养。此后，测定异戊二烯醇(NOH和FOH)的产量(图21)。
当导入HMG1时(每幅图左侧的条柱)，两种产物的产量都增加。W303克隆的特征为其在NOH生产中的效用。
通过高表达缺失突变型HMG-CoA还原酶基因而生产异戊二烯醇在实施例7中，用全长HMG-CoA还原酶基因或其突变体开发了异戊二烯醇生产重组酵母。在该实施例中，用HMG-CoA还原酶基因的缺失突变体，开发了异戊二烯醇生产重组酵母，并且进行异戊二烯醇生产。
(1)诱导型启动子；HMG1Δ；A451将通过插入HMG1’基因的缺失突变体到包含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2中而获得的下述质粒(实施例3的(4)中所述的)，分别导入到A451中。
pYHMG026pYHMG044pYHMG056
pYHMG062pYHMG076pYHMG081pYHMG100pYHMG112pYHMG122在SG培养基中的培养完成后，测定异戊二烯醇(NOH和FOH)的产量(图22)。
当带有诱导型启动子的缺失突变型HMG1基因表达时，获得FOH高产克隆。对于FOH生产，HMG1Δ044和HMG1Δ122都有效(在HMG1/A451克隆中FOH产量平均为0.0mg/L)。
(2)诱导型启动子；HMG1Δ；AURGG101将通过插入HMG1’基因的缺失突变体到包含诱导型启动子GAL1p的载体pYES2中而获得的下述质粒(实施例3的(4)中所述的)，分别导入到AURGG101中。
pYHMG026pYHMG044pYHMG056pYHMG062pYHMG076pYHMG081pYHMG100pYHMG112pYHMG122pYHMG133在SG培养基中的培养完成后，测定异戊二烯醇(NOH和FOH)的产量(图22和23)。在图23中，最右边的条柱代表在基因转移前宿主AURGG101的产量。图24显示了图23的放大图。
具体地说，当带有诱导型启动子的HMG1Δ044表达时，获得异戊二烯醇高产克隆(克隆15-2)。在该重组体中NOH产量和FOH产量分别为平均12mg/L和31.7mg/L(图23)。最高产量分别为23mg/L和53mg/L。在整合了HMG1Δ而非整合HMG1Δ044的那些重组体中，获得了产生约0.05-0.06mg/L的NOH和FOH的克隆(图24)。整合了HMG1Δ062的重组体最高产生0.11mg/L的NOH和0.13mg/L的FOH。(3)组成型启动子；HMG1，诱导型启动子；HMG1Δ；AURGG101将在实施例7的(2)中制备的pRS434GAP-HMG1或pRS444GAP-HMG1导入到本实施例的以上(2)中制备的克隆15-2中。在SG培养基中的培养完成后，测定异戊二烯醇(NOH和FOH)的产量(图25)。
结果，获得了最高生产66mg/L FOH的克隆，改进了克隆15-2的53mg/L的FOH产量。
用大肠杆菌生产异戊二烯醇(1)将实施例2的(4)、(5)和(7)中获得的质粒分别导入到大肠杆菌JM109中。向300ml烧瓶中含有2×YT和1mM IPTG的50ml培养基中加入0.5ml预培养物。必要时向其中加入抗生素(氨苄青霉素和氯霉素)，加入5mM(约0.12％(w/v))IPP和5mM DMAPP，将细胞于37℃振荡培养16小时。
在完成于37℃培养16小时之后，加入马铃薯酸性磷酸酶到培养上清液中，通过超声处理破碎细胞沉淀，然后用戊烷作为有机溶剂提取异戊二烯醇。然后，如实施例7(1)中所述，通过GC/MS鉴定并定量测定异戊二烯醇。
结果，在IPP和DMAPP存在下的FOH产量在导入野生型ispA时为86.4mg/L(图29中的pALispA)，而在导入野生型fps时为12.0mg/L(图26中的pFE15N2.9-1)。甚至在导入突变型ispA时，保留p18M或p18E的JM109也分别产生11.1mg/L和16.3mg/L的FOH；保留p4D的JM109产生72.7mg/L的FOH；在保留p16D的JM109中，FOH产达到93.3mg/L(图26)。
(2)为了确定在不加入IPP和DMAPP时是否可以进行异戊二烯醇生产，将实施例2的(4)和(6)中获得的质粒pALispA4和p3-47-11或质粒pALispA4和p3-47-13导入大肠杆菌JM109中。向300ml烧瓶中含有2×YT和1mM IPTG的50ml培养基中加入0.5ml预培养物。必要时向其中加入抗生素(氨苄青霉素和氯霉素)。然后将细胞于37℃振荡培养16小时。结果表明，保留pALispA4和p3-47-11的JM109的FOH生产能力为0.15mg/L，而保留pALispA4和p3-47-13的JM109的FOH生产能力为0.16mg/L(图27)。
因此，发现保留含有idi的质粒p3-47-11或p3-47-13以及含有ispA的质粒pALispA4的大肠杆菌，即掺入idi和ispA的大肠杆菌，甚至在不加入IPP和DMAPP时也具有生产0.15-0.16mg/L FOH的能力。
FOH的大量生产1.培养条件将一铂接种环实施例8(2)中所述的重组酵母克隆15-2(保留pYHMG044的AURGG101)从斜面接种到CSM-URA培养基(BIO 101Inc.)和DOB培养基(BIO 101 Inc.)(200ml，在带有挡板的500ml锥形瓶中)中，于30℃以130r.p.m.振荡培养2天。然后，为了完全去除培养肉汤中所含有的葡萄糖，将离心(1500g，5min，4℃)和用无菌生理盐水洗涤重复3次。随后，将50ml所述培养物接种到发酵罐(1％)中，在下述条件下培养。
发酵罐培养基5％半乳糖含氨基酸的YNB(Difco)1％豆油(Nacalai Tesque)
0.1％AdekanolLG109(Asahi Denka)操作条件培养装置MSJ-U 10 L Cultivation Apparatus(B.E.Marubishi)培养基体积5L培养温度26℃通气速率1vvm搅拌300rpmpH用4N氢氧化钠溶液和2N盐酸溶液按比例控制，具有以下参数比例带(Proportional Band)1.00非敏感带 0.15控制期 16秒满冲程 1秒最小冲程 0秒2.细胞计数用生理盐水将100微升培养肉汤稀释1-20倍。然后，用血红蛋白计(Hayashi Rikagaku)对细胞计数。对0.06mm2(相当于9个最小方格)中的细胞数计数，然后计算4个计数的平均值。然后，用以下公式，计算每升培养肉汤的细胞计数。
细胞计数(1×109/L肉汤)＝0.444×(0.06mm2中的细胞计数)×稀释率3.FOH的定量测定按照实施例8中所述的相同方式，鉴定和定量测定FOH。
4.结果结果示于图28中。从图28来看，证明通过将HMG1Δ044(突变型HMG-CoA还原酶基因HMG1’的缺失突变体)导入到A451衍生的AURGG101中而获得的重组酵母，每升培养肉汤平均可以生产146mg/L FOH，最高生产158mg/L。
此中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用全文结合到本文中。
工业应用性按照本发明，提供了一种生产异戊二烯醇的方法。按照本发明，可以大量获得生物活性的异戊二烯醇。从这些异戊二烯醇，可以合成具有各种生理活性的类异戊二烯/类萜。在本发明中提供的活性异戊二烯醇也可以用作发现具有新的生理活性的物质的材料。
序列表的独立文本SEQ ID NO18-74合成DNA
序列表<110>丰田自动车株式会社(TOYOTA JIDOSHA KABUSHIKI KAISHA)<120>异戊二烯醇的生产方法<130>PH-1412PCT<140><141><150>JP2000-401701<151>2000-12-28<160>86<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3165<212>DNA<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220><221>CDS<222>(1)..(3162)<400>1atg ccg ccg cta ttc aag gga ctg aaa cag atg gca aag cca att gcc48Met Pro Pro Leu Phe Lys Gly Leu Lys Gln Met Ala Lys Pro Ile Ala1 5 10 15tat gtt tca aga ttt tcg gcg aaa cga cca att cat ata ata ctt ttt96Tyr Val Ser Arg Phe Ser Ala Lys Arg Pro Ile His Ile Ile Leu Phe20 25 30tct cta atc ata tcc gca ttc gct tat cta tcc gtc att cag tat tac 144Ser Leu Ile Ile Ser Ala Phe Ala Tyr Leu Ser Val Ile Gln Tyr Tyr35 40 45ttc aat ggt tgg caa cta gat tca aat agt gtt ttt gaa act gct cca 192Phe Asn Gly Trp Gln Leu Asp Ser Asn Ser Val Phe Glu Thr Ala Pro50 55 60aat aaa gac tcc aac act cta ttt caa gaa tgt tcc cat tac tac aga 240Asn Lys Asp Ser Asn Thr Leu Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Tyr Arg65 70 75 80gat tcc tct cta gat ggt tgg gta tca atc acc gcg cat gaa gct agt 288Asp Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Ser Ile Thr Ala His Glu Ala Ser85 90 95gag tta cca gcc cca cac cat tac tat cta tta aac ctg aac ttc aat 336Glu Leu Pro Ala Pro His His Tyr Tyr Leu Leu Asn Leu Asn Phe Asn100 105 110agt cct aat gaa act gac tcc att cca gaa cta gct aac acg gtt ttt 384Ser Pro Asn Glu Thr Asp Ser Ile Pro Glu Leu Ala Asn Thr Val Phe115 120 125gag aaa gat aat aca aaa tat att ctg caa gaa gat ctc agt gtt tcc 432Glu Lys Asp Asn Thr Lys Tyr Ile Leu Gln Glu Asp Leu Ser Val Ser130 135 140aaa gaa att tct tct act gat gga acg aaa tgg agg tta aga agt gac 480Lys Glu Ile Ser Ser Thr Asp Gly Thr Lys Trp Arg Leu Arg Ser Asp145 150 155 160aga aaa agt ctt ttc gac gta aag acg tta gca tat tct ctc tac gat 528Arg Lys Ser Leu Phe Asp Val Lys Thr Leu Ala Tyr Ser Leu Tyr Asp165 170 175gta ttt tca gaa aat gta acc caa gca gac ccg ttt gac gtc ctt att 576Val Phe Ser Glu Asn Val Thr Gln Ala Asp Pro Phe Asp Val Leu Ile180 185 190atg gtt act gcc tac cta atg atg ttc tac acc ata ttc ggc ctc ttc 624Met Val Thr Ala Tyr Leu Met Met Phe Tyr Thr Ile Phe Gly Leu Phe195 200 205aat gac atg agg aag acc ggg tca aat ttt tgg ttg agc gcc tct aca 672Asn Asp Met Arg Lys Thr Gly Ser Asn Phe Trp Leu Ser Ala Ser Thr210 215 220gtg gtc aat tct gca tca tca ctt ttc tta gca ttg tat gtc acc caa 720Val Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Phe Leu Ala Leu Tyr Val Thr Gln225 230 235 240tgt att cta ggc aaa gaa gtt tcc gca tta act ctt ttt gaa ggt ttg 768Cys Ile Leu Gly Lys Glu Val Ser Ala Leu Thr Leu Phe Glu Gly Leu245 250 255cct ttc att gta gtt gtt gtt ggt ttc aag cac aaa atc aag att gcc 816Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Phe Lys His Lys Ile Lys Ile Ala260 265 270cag tat gcc ctg gag aaa ttt gaa aga gtc ggt tta tct aaa agg att 864Gln Tyr Ala Leu Glu Lys Phe Glu Arg Val Gly Leu Ser Lys Arg Ile275 280 285act acc gat gaa atc gtt ttt gaa tcc gtg agc gaa gag ggt ggt cgt 912Thr Thr Asp Glu Ile Val Phe Glu Ser Val Ser Glu Glu Gly Gly Arg290 295 300ttg att caa gac cat ttg ctt tgt att ttt gcc ttt atc gga tgc tct 960Leu Ile Gln Asp His Leu Leu Cys Ile Phe Ala Phe Ile Gly Cys Ser305 310 315 320atg tat gct cac caa ttg aag act ttg aca aac ttc tgc ata tta tca 1008Met Tyr Ala His Gln Leu Lys Thr Leu Thr Asn Phe Cys Ile Leu Ser
325 330 335gca ttt atc cta att ttt gaa ttg att tta act cct aca ttt tat tct1056Ala Phe Ile Leu Ile Phe Glu Leu Ile Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Ser340 345 350gct atc tta gcg ctt aga ctg gaa atg aat gtt atc cac aga tct act1104Ala Ile Leu Ala Leu Arg Leu Glu Met Asn Val Ile His Arg Ser Thr355 360 365att atc aag caa aca tta gaa gaa gac ggt gtt gtt cca tct aca gca1152Ile Ile Lys Gln Thr Leu Glu Glu Asp Gly Val Val Pro Ser Thr Ala370 375 380aga atc att tct aaa gca gaa aag aaa tcc gta tct tct ttc tta aat1200Arg Ile Ile Ser Lys Ala Glu Lys Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Asn385 390 395 400ctc agt gtg gtt gtc att atc atg aaa ctc tct gtc ata ctg ttg ttt1248Leu Ser Val Val Val Ile lle Met Lys Leu Ser Val Ile Leu Leu Phe405 410 415gtc ttc atc aac ttt tat aac ttt ggt gca aat tgg gtc aat gat gcc1296Val Phe Ile Asn Phe Tyr Asn Phe Gly Ala Asn Trp Val Asn Asp Ala420 425 430ttc aat tca ttg tac ttc gat aag gaa cgt gtt tct cta cca gat ttt1344Phe Asn Ser Leu Tyr Phe Asp Lys Glu Arg Val Ser Leu Pro Asp Phe435 440 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权利要求
1.一种生产异戊二烯醇的方法，所述方法包括构建通过将分别包含以下基因或元件的表达用重组DNA或基因组整合用DNA片段转移到宿主中而获得的重组体(i)羟甲基戊二酰-CoA还原酶基因、异戊烯二磷酸Δ异构酶基因或法呢二磷酸合酶基因或所述基因中任一种的突变体，(ii)转录启动子，和(iii)转录终止子；培养所述重组体；并且从所得培养物中回收异戊二烯醇。
2.依照权利要求1的方法，其中所述异戊二烯醇是C15异戊二烯醇。
3.依照权利要求2的方法，其中所述C15异戊二烯醇是法尼醇或橙花叔醇。
4.依照权利要求3的方法，其中在所得的培养物中法尼醇或橙花叔醇的浓度至少为0.05mg/L。
5.依照权利要求1-4中任一项的方法，其中所述羟甲基戊二酰-CoA还原酶基因或其突变体包含选自SEQ ID NO1、3、5和7-16的一种核苷酸序列。
6.依照权利要求1-4中任一项的方法，其中所述法呢二磷酸合基因或其突变体包含选自SEQ ID NO75、77、79、81和83的一种核苷酸序列。
7.依照权利要求1-4中任一项的方法，其中所述异戊烯二磷酸Δ异构酶基因或其突变体包含SEQ ID NO85中所示的核苷酸序列。
8.依照权利要求1-7中任一项的方法，其中转录启动子是选自ADH1启动子、TDH3(GAP)启动子、PGK1启动子、TEF2启动子、GAL1启动子和tac启动子的一种启动子。
9.依照权利要求1-7中任一项的方法，其中所述转录终止子是ADH1终止子或CYC1终止子。
10.依照权利要求1-9中任一项的方法，其中所述宿主是酵母或大肠杆菌。
11.依照权利要求10的方法，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
12.依照权利要求11的方法，其中所述酿酒酵母是A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株或者由所述菌株中任一种衍生的菌株。
13.一种重组体，所述重组体是通过将分别包含以下基因或元件的表达用重组DNA或基因组整合用DNA片段转移到宿主中而获得的(i)羟甲基戊二酰-CoA还原酶基因、异戊烯二磷酸Δ异构酶基因或法呢二磷酸合酶基因或所述基因中任一种的突变体，(ii)转录启动子，和(iii)转录终止子；所述重组体能够生产至少0.05mg/L的法尼醇或橙花叔醇。
14.依照权利要求13的重组体，其中所述羟甲基戊二酰-CoA还原酶基因或其突变体包含选自SEQ ID NO1、3、5和7-16的一种核苷酸序列。
15.依照权利要求13的重组体，其中所述法呢二磷酸合酶基因或其突变体包含选自SEQ ID NO75、77、79、81和83的一种核苷酸序列。
16.依照权利要求13的重组体，其中所述异戊烯二磷酸Δ异构酶基因或其突变体包含SEQ ID NO85中所示的核苷酸序列。
17.依照权利要求13-16中任一项的重组体，其中转录启动子是选自ADH1启动子、TDH3(GAP)启动子、PGK1启动子、TEF2启动子、GAL1启动子和tac启动子的一种启动子。
18.依照权利要求13-16中任一项的重组体，其中所述转录终止子是ADH1终止子或CYC1终止子。
19.依照权利要求13-18中任一项的重组体，其中所述宿主是酵母或大肠杆菌。
20.依照权利要求19的重组体，其中所述酵母是酿酒酵母。
21.依照权利要求20的重组体，其中所述酿酒酵母是A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株或者由所述菌株中任一种衍生的菌株。
全文摘要
本发明提供一种异戊二烯醇的生产方法，其特征在于通过将含有羟甲基戊二酰－CoA还原酶基因、异戊烯二磷酸Δ异构酶基因或法呢二磷酸合酶基因或所述基因的突变型基因以及转录启动子和转录终止子的表达用重组DNA或基因组整合用DNA片段导入宿主中，构建重组体；培养所述重组体；然后从所得的培养物中收集异戊二烯醇。
文档编号C12N9/90GK1492931SQ0182285
公开日2004年4月28日 申请日期2001年12月20日 优先权日2000年12月28日
发明者大音德, 小畑充生, 生 申请人:丰田自动车株式会社