本发明涉及的是一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽制备方法。
背景技术：
非酒精性脂肪肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，nafld）是以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要特征的病理综合征，目前治疗的方法主要采取减肥治疗、降脂治疗和血管紧张素转换酶抑制剂等保守治疗，但保守治疗目前尚缺乏特效方法，效果欠佳。近年来，我国的研究学者对从海洋动物中提取生物活性物质对肝损伤进行保护作用作了大量的研究。
青蛤是我们四大养殖贝类之一，从中提取的多肽具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种得率高，对nafld的修复作用明显，可开发为功能食品的对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽制备方法，所述的制备方法包括：选取原料青蛤内脏进行酶解获得青蛤多肽，将获得的青蛤多肽作用于nafld体外细胞模型进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽产品。
作为优选：所述的选取原料青蛤内脏进行酶解获得青蛤多肽是：
a）从原料青蛤中取内脏并清洗后捣碎制成浆料，
b）酶解：选用蛋白酶对青蛤内脏浆料进行酶解，制成酶解液；
c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10kd、5kd、3kd的超滤膜进行超滤，收集>10kd、10-5kd、5-3kd和<3kd分子量的酶解液；
d）将酶解液用葡聚糖凝胶sephadexg25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，在建立nafld体外细胞模型的基础上，采用细胞指数级富集的配体系统进化技术针对nafld细胞进行筛选，获得能特异性识别nafld细胞表面膜蛋白结构的、有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱(rt-hplc)纯化；
e）经过反相高效液相色谱(rt-hplc)纯化及氨基酸序列检测，获得对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽。
作为优选：所述的步骤b）中，蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解温度为42℃、ph值为2、料液比为1:8—12g/ml、时间为6—10h、加酶量为1500—1600u/g；
所述的步骤d）中，所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是：ph8.5tris-hc1缓冲液，0～0.03mol/nacl梯度洗脱，收集有活性的各峰，冻干后，凝胶柱脱盐；
所述的nafld体外细胞模型是应用cell-selex技术对nafld细胞展开筛选，经过24轮正负细胞筛选后成功富集到针对nafld细胞的ssdna文库，经过测序分析找到了4条核酸适配体与nafld细胞有结合，而与hepg2细胞不结合，选用结合能力强的1条核酸适配体进行实验，并命名为nfd-1；在4度和37度条件下，核酸适配体nfd-1均能与nafld细胞特异性结合；
所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱，即rt-hplc，用rt-hplc进行纯化，色谱条件是:
1)样品前处理:将样品用0.06%tfa的水溶解到0.6ml，离心12000-14000rpm，离心10分钟后取上清；
2)系统:agilent1260hplc；
3)柱子:zorbaxsb-c184.6x2505um；
4)进样体积:80-100ul；
5)缓冲液、平衡缓冲液:0.06%tfa洗脱缓冲液:0.05%tfa的乙腈；
6)梯度:0%–0%b洗脱4分钟，0%–8%b洗脱25分钟，8%-100%b洗脱1分钟，100%-100%b洗脱5分钟；
7)流速:1.0ml/min；8）检测:280nm/214nm。
本发明具有酶解反应条件温和、反应时间短、效率高，反应过程易控制，该法提取的青蛤多肽得率高，对nafld的修复作用明显等特点，可开发为功能食品。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：一种对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽制备方法，所述的制备方法包括：选取原料青蛤内脏进行酶解获得青蛤多肽，将获得的青蛤多肽作用于nafld体外细胞模型进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽产品。
作为一种优选的实施例，本发明所述的选取原料青蛤内脏进行酶解获得青蛤多肽是：
a）从原料青蛤中取内脏并清洗后捣碎制成浆料，
b）酶解：选用蛋白酶对青蛤内脏浆料进行酶解，制成酶解液；
c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10kd、5kd、3kd的超滤膜进行超滤，收集>10kd、10-5kd、5-3kd和<3kd分子量的酶解液；
d）将酶解液用葡聚糖凝胶sephadexg25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，在建立nafld体外细胞模型的基础上，采用细胞指数级富集的配体系统进化技术针对nafld细胞进行筛选，获得能特异性识别nafld细胞表面膜蛋白结构的、有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱(rt-hplc)纯化；
e）经过反相高效液相色谱(rt-hplc)纯化及氨基酸序列检测，获得对非酒精性脂肪肝模型具有修复作用的青蛤多肽。
作为一种进一步优选的实施例，本发明所述的如下步骤是：
所述的步骤b）中，蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解温度为42℃、ph值为2、料液比为1:8—12g/ml、时间为6—10h、加酶量为1500—1600u/g；
所述的步骤d）中，所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是：ph8.5tris-hc1缓冲液，0～0.03mol/nacl梯度洗脱，收集有活性的各峰，冻干后，凝胶柱脱盐；
所述的nafld体外细胞模型是应用cell-selex技术对nafld细胞展开筛选，经过24轮正负细胞筛选后成功富集到针对nafld细胞的ssdna文库，经过测序分析找到了4条核酸适配体与nafld细胞有结合，而与hepg2细胞不结合，选用结合能力强的1条核酸适配体进行实验，并命名为nfd-1；在4度和37度条件下，核酸适配体nfd-1均能与nafld细胞特异性结合；
所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱，即rt-hplc，用rt-hplc进行纯化，色谱条件是:
1)样品前处理:将样品用0.06%tfa的水溶解到0.6ml，离心12000-14000rpm，离心10分钟后取上清；
2)系统:agilent1260hplc；
3)柱子:zorbaxsb-c184.6x2505um；
4)进样体积:80-100ul；
5)缓冲液、平衡缓冲液:0.06%tfa洗脱缓冲液:0.05%tfa的乙腈；
6)梯度:0%–0%b洗脱4分钟，0%–8%b洗脱25分钟，8%-100%b洗脱1分钟，100%-100%b洗脱5分钟；
7)流速:1.0ml/min；8）检测:280nm/214nm。
本发明通过青蛤内脏进行酶解获得多肽，作用于nafld体外细胞模型进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得青蛤多肽序列，以期为开发青蛤功能食品提供实验依据。