本发明涉及一种杂交瘤细胞株，特别是涉及分泌抗牛单核细胞趋化蛋白1(mcp-1)单抗的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及应用。
背景技术：
单核细胞趋化蛋白1(monocytechemoattractantprotein-1，mcp-1)是趋化因子cc亚家族的一员。mcp-1主要趋化单核细胞，使各种炎性细胞尤其是单核细胞向病变部位聚集，从而在机体防御、慢性炎症及抗肿瘤等方面起重要作用。血液中的单核细胞在特异的趋化因子作用下，发生迁移并聚集在不同病变组织中发挥重要的生物学效应，如吞噬和杀伤病原微生物，递呈抗原及分泌多种生物活性物质等。研究显示mcp-1表达水平的改变与感染性疾病、免疫功能异常、炎症性疾病与肿瘤的发展等有一定相关性。
mcp-1的免疫学检测是在特异性抗mcp-1单克隆抗体(mab)的基础上建立的用于对样本中的mcp-1进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单克隆抗体标记物和检测技术，可建立多种检测方法，如酶免疫分析法(enzymeimmunoassay，eia)，酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，简称elisa)，流式细胞术(flowcytometry，简称fcm)分析法等。mcp-1的fcm具有高度敏感性和应用广泛性。作为细胞免疫状态的重要指标之一，mcp-1的fcm检测方法被广泛地用于研究基础和临床医学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种病原微生物感染的诊断等。
但是，现有技术中制备的抗牛mcp-1(bomcp-1)抗体，在应用于上述检测方法时往往遇到很大问题，特别是当用于检测天然牛mcp-1时效果不佳。因此，获得一种可用于牛临床检测的，效价高、特异性好、与天然牛mcp-1有抗原亲和力的牛mcp-1单抗，对牛机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研究具有重要的意义。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌牛mcp-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株以及该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在牛免疫检测领域的应用。
所述杂交瘤细胞株分泌的抗牛mcp-1的单克隆抗体效价高，其能与天然牛mcp-1的高亲和力地特异结合，其作为诊断试剂检测牛mcp-1，具有相当的灵敏度和特异性。
本发明第一方面提供了一种分泌牛mcp-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株4g9或其传代细胞株，所述杂交瘤细胞株4g9保藏号为cctccno:c2017281。
本发明第二方面提供了一种牛mcp-1单克隆抗体4g9，其由上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
本发明第三方面提供了一种牛mcp-1的western-blot检测试剂盒，所述western-blot检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖lps刺激剂，其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的上述牛mcp-1单克隆抗体4g9(hrp-4g9)。
本发明第四方面提供了一种牛mcp-1的直接免疫荧光dfa检测试剂盒，所述直接免疫荧光dfa检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖lps刺激剂，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的上述牛mcp-1单克隆抗体4g9(fitc-4g9)。
本发明第五方面提供了一种牛mcp-1的fcm检测试剂盒，所述fcm检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖lps刺激剂，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的上述牛mcp-1单克隆抗体4g9(fitc-4g9)。
本发明第六方面提供了上述分泌牛mcp-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述牛mcp-1单克隆抗体mab4g9在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。
本发明第七方面提供了所述western-blot检测试剂盒、直接免疫荧光dfa检测试剂盒或fcm检测试剂盒在用于非诊断目的检测牛mcp-1中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛mcp-1的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、进出口检验检疫、流行病学研究。
本发明的技术效果：
本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原结合亲和力强的优势，可用于检测天然牛mcp-1。
基于此建立的western-blot检测试剂盒，可以有效检测大肠杆菌表达系统表达的牛mcp-1蛋白和牛外周血单核细胞(pbmc)分泌的天然牛mcp-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。
基于此建立的直接免疫荧光(dfa)检测试剂盒，可以有效检测真核质粒表达分泌的牛mcp-1和牛外周血单核细胞分泌的牛mcp-1，具有较好的灵敏度和特异性。
同时，基于此建立的牛mcp-1的fcm检测试剂盒，在检测牛外周血单个核细胞样品时，可以检测出较高水平的分泌牛mcp-1的单核细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为本发明western-blot方法的重组牛mcp-1蛋白检测结果图：a.重组his-bomcp-1蛋白检测结果，b.重组gst-bomcp-1蛋白检测结果。
图2为本发明直接免疫荧光(dfa)方法的牛外周血单核细胞样品检测结果图：a.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，b.lps刺激牛外周血单核细胞结果。
图3为本发明fcm试剂盒的牛外周血单核细胞样品检测结果图：a.未刺激牛外周血单核细胞检测结果，b.lps刺激牛外周血单核细胞结果。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明。
本发明目的是提供一种分泌牛mcp-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测领域的应用。
本发明一方面提供了一种分泌牛mcp-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，所述杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株4g9或其传代细胞株。所述杂交瘤细胞株4g9保藏号为cctccno:c2017281；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2017年12月7日。
本发明第二方面提供了一种本发明所述的杂交瘤细胞株4g9或其传代细胞株分泌产生的牛mcp-1单克隆抗体4g9。
本发明第三方面提供了一种牛mcp-1的western-blot检测试剂盒，所述western-blot检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖lps刺激剂，其中，所述检测抗体为辣根过氧化物酶标记的上述牛mcp-1单克隆抗体4g9(hrp-4g9)。
优选地，所述western-blot检测试剂盒还包括下列试剂的一种或几种：
1)封闭液；
2)底物液；以及
3)洗涤液。
本发明的western-blot检测试剂盒可用于检测重组牛mcp-1蛋白。
利用本发明的western-blot检测试剂盒检测重组牛mcp-1蛋白的方法包括下列步骤：
1.sds-page电泳，
将纯化蛋白rhis-bomcp-1、rgst-bomcp-1分别加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，进行sds-page电泳；
2.转印，
电泳结束后，将凝胶置于转印buffer中浸泡5min，同时将nc膜和滤纸同样浸泡，按照从上到下为2张滤纸-nc膜-凝胶-2张滤纸的顺序，铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在bio-radsemi-drytransfercell系统中以0.8ma/cm2转印2h；
3.检测，
①用含5％脱脂奶的pbs封闭，室温摇晃封闭过夜；
②用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；
③加入用pbs1:1000稀释的检测抗体(hrp-4g9)，室温震荡作用2h；
④用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；
⑤显色，自来水终止反应，扫描仪拍照反应结果。
结果显示本发明的western-blot试剂盒可以有效检测大肠杆菌表达系统表达的牛mcp-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。
本发明的牛mcp-1的western-blot检测试剂盒可以用于检测牛外周血单核细胞样品。
利用本发明的牛mcp-1的western-blot试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的方法包括下列步骤：
1.制备牛外周血单核细胞，
①无菌采取5ml待测牛血加入含肝素钠的采血管中，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌pbs1:1稀释后，再按1:1的比例将稀释牛血缓慢加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rmp离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取外周血单核细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌pbs，将细胞混匀后，于4℃2000rmp离心10min，重复两次，得到沉淀细胞；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μl细胞悬液加入10μl酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/ml。
2.细胞孵育，
在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μl培养液至每个对照孔，500μl10μg/ml的lps至每个阳性孔。每孔加入500μl稀释的细胞悬液，置于37℃，5％co2培养箱培养24-48小时，收集细胞作为检测样品；
3.sds-page电泳,
使用western裂解液裂解细胞，12000rpm离心10min，取上清。将细胞裂解上清加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，进行sds-page电泳；
4.转印,
电泳结束后，将凝胶置于转印buffer中浸泡5min，同时将nc膜和滤纸同样浸泡，按照从上到下的顺序，2张滤纸-nc膜-凝胶-2张滤纸铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在bio-radsemi-drytransfercell系统中以0.8ma/cm2转印2h；
5.检测,
①用含5％脱脂奶的pbs封闭，室温摇晃封闭过夜；
②用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；
③加入用pbs1:1000稀释的检测抗体(hrp-4g9)，室温震荡作用2h；
④用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；
⑤显色，自来水终止反应，扫描仪拍照反应结果。
结果显示本发明的western-blot检测试剂盒可以有效检测牛外周血单核细胞分泌的天然牛mcp-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。
本发明第四方面提供了一种牛mcp-1的直接免疫荧光(dfa)检测试剂盒，所述直接免疫荧光(dfa)检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖lps刺激剂，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的上述牛mcp-1单克隆抗体4g9(fitc-4g9)。
优选地，所述直接免疫荧光方法还包括下列试剂：
1)固定液；以及
2)洗涤液。
本发明的直接免疫荧光(dfa)检测方法可用于分析重组牛mcp-1蛋白。
利用本发明的直接免疫荧光(dfa)检测方法检测重组牛mcp-1蛋白的检测方法包括下列步骤：
1.转染,
①转染前24h，消化接种hek293t细胞于24孔板中，2×105个细胞/孔；
②加入
③分别加入重组质粒pvax1-gfp-bomcp-1和空载体质粒pvax1各1μl，以及p3000tm2μl至含opti-mem的1.5ml指形管中至总体积50μl；
④分别加入含
2.细胞因子检测,
①吸去hek293t(pvax1-gfp-bomcp-1)和hek293t(pvax1)细胞的培养上清，使用500μlpbs洗两次，加入500μl-20℃预冷的冰甲醇于-20℃固定10min；
②用500μlpbs洗三次，加入1:1000稀释的fitc-4g9，置37℃水浴锅孵育2h；
③用500μlpbs漂洗三次，使用荧光倒置显微镜进行观察。
结果显示直接免疫荧光(dfa)方法可以有效检测真核表达系统中的牛mcp-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。
本发明的直接免疫荧光(dfa)检测方法可用于分析牛外周血单核细胞样品。
利用本发明的直接免疫荧光(dfa)检测方法检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：
1.制备牛外周血单核细胞,
①无菌采取5ml待测牛血加入含肝素钠的采血管中，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌pbs1:1稀释后，再按1:1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rmp离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取外周血单核细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌pbs，将细胞混匀后，于4℃2000rmp离心10min，重复两次，得到沉淀细胞；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μl细胞悬液加入10μl酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/ml。
2.细胞孵育，
在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μl培养液至每个对照孔，500μl10μg/ml的lps至每个阳性孔。每孔加入500μl稀释的细胞悬液，置于37℃，5％co2培养箱培养24-48小时，收集细胞；3.细胞因子检测,
①吸去细胞的培养上清，使用500μlpbs洗2次，加入500μl-20℃预冷的冰甲醇于-20℃固定10min；
②用500μlpbs洗3次，加入1:1000稀释的fitc-4g9，置37℃水浴锅孵育2h；
③用500μlpbs洗3次，使用荧光倒置显微镜进行观察。
结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔(b)有明显绿色荧光，而对照样品孔(a)没有绿色荧光，这表明该试剂盒可以有效检测出lps刺激牛外周血中分泌牛mcp-1的细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
本发明第五方面提供了牛mcp-1的fcm检测试剂盒，所述fcm检测试剂盒包括检测抗体、细菌脂多糖lps刺激剂，其中，所述检测抗体为异硫氰酸荧光素标记的上述牛mcp-1单克隆抗体4g9。
优选地，所述fcm检测试剂盒还可以包括下列试剂的一种或多种：
1)阻断剂布雷菲德菌素(brefeldin，bfa)；
2)固定剂、破膜剂；以及
3)洗涤液。
上述试剂均为fcm检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即可根据需要有选择的加入，也可由操作者自行配置或单独购买。为方便造作者，最优的选择是试剂盒中同时包括阻断剂bfa、固定剂、破膜剂和洗涤液。
所述洗涤液可为fcm检测试剂盒中常用的洗涤液，如含1％bsa的磷酸盐缓冲溶液等。可以根据需要选择浓缩或未浓缩的洗涤液。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他fcm检测所需通用试剂，如细胞培养液、磷酸盐缓冲溶液等。
通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
本发明进一步基于上述牛mcp-1的fcm检测试剂盒，建立了具有较好特异性和灵敏度的牛mcp-1的fcm检测方法，用于检测分泌牛mcp-1的单核细胞，从而进行机体免疫状态评价及疾病诊断方面的研究。
本发明的fcm检测试剂盒可用于分析牛外周血单核细胞样品。
利用本发明的fcm检测试剂盒检测牛外周血单核细胞样品的检测方法包括下列步骤：
1)制备牛外周血单核细胞悬液；
2)细胞孵育：
①在96孔细胞培养板中加入下列试剂：50μl培养液至每个对照孔，50μl10μg/ml的lps至每个阳性孔。每孔加入50μl牛外周血单核细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱培养4-6小时；
②加入细胞因子分泌阻断剂bfa，在放入37℃、5％co2培养箱培养16小时。
3)细胞因子检测；
①次日收集培养细胞，使用含1％bsa的pbs洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清；
②加固定剂，室温静置作用15min；用含1％bsa的pbs洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；
③使用工作浓度的破膜剂稀释fitc标记特异性针对牛mcp-1单抗4g9至0.5μg/ml，室温静置作用15min，使用含1％bsa的pbs洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；
④使用200μlpbs重悬细胞，进行facs检测分泌牛mcp-1的细胞比例。
上述方法通过密度梯度离心分离牛外周血单核细胞，以经lps刺激的牛外周血单核细胞为阳性样品，以未经刺激的牛外周血单核细胞为对照样品，以fitc-4g9为检测抗体，facs结果显示，该方法可有效检测出分泌牛mcp-1的细胞比例。
本发明第六方面涉及本发明所述分泌牛mcp-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株或所述的牛mcp-1单克隆抗体mab4g9在制备牛机体免疫状态的检测试剂或诊断试剂中的应用。
本发明第七方面提供了本发明所述western-blot检测试剂盒、直接免疫荧光dfa检测试剂盒或fcm检测试剂盒在用于非诊断目的检测牛mcp-1中的应用，所述非诊断目的检测包括重组表达牛mcp-1的检测、对离体组织进行检测、表位鉴定研究、进出口检验检疫、流行病学研究。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰及改变。
除非另外说明，本发明中所公开的试验方法、检测方法、制备方法均采用本领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning:alaboratarymanual,secondedition,2001；ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology,academicpress,sandiego；wolffe,chromatinstructureangfunction,thirdedition,academicpress,sandiego,1998；methodsinenzymology,vol.304,chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe,ed.),academicpress,sandiego,1999；和methodsinmolecularbiology,vol.119,chromatinprotocols(p.b.becker,ed.)humanapress,totowa,1999等。
实施例1：杂交瘤细胞株的获得
保藏号为cctccno:c2017281的杂交瘤细胞株4g9的获得。
1.动物免疫
具体免疫程序如下：首次免疫，腹部皮下多点注射100μg经弗氏完全佐剂充分乳化的牛mcp-1纯化蛋白，2周后腹部皮下多点注射100μg经弗氏不完全佐剂充分乳化的纯化蛋白进行二次免疫，间隔2周后腹腔注射100μg不加佐剂的纯化蛋白进行第三次免疫，7天后采血测定血清抗体效价，选取效价较高的小鼠进行腹腔加强免疫100μg不加佐剂的纯化蛋白。
2.细胞融合
具体步骤如下：尾静脉注射加强免疫3天后，采集少量血液，分离血清，-20℃冻存，作为筛选时的阳性克隆对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞sp2/0在聚乙二醇peg(mw4000)作用下融合，用icr小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用hat培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、5％co2培养箱中培养。5天后加入新鲜hat培养基，10天后改用ht培养基进行培养，定期观察，换液和检测。
3.间接elisa检测方法的建立
采用间接elisa方法筛选阳性克隆细胞。方阵试验确定检测抗原的包被浓度。
检测抗原用包被缓冲液横向梯度稀释，每孔100μl包被elisa板，4℃过夜；pbst洗涤3次，每孔加入200μl封闭液，4℃过夜；免疫鼠血清纵向倍比稀释，每孔100μl，正常小鼠血清同样倍比稀释作为阴性对照，37℃孵育2h；用pbst洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育1h；pbst洗涤后，加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(tmb)显色，酶联检测仪测定od450的值，判定检测抗原的最佳包被浓度。
根据方阵试验确定的检测抗原的包被浓度，将稀释后的检测抗原100μl/孔加入酶标板中，4℃过夜，pbst洗涤3次，5min/次，用含10％小牛血清的pbst洗液4℃封闭过夜，洗涤，-20℃保存，用于筛选阳性克隆细胞。
4.筛选阳性克隆
采用建立好的间接elisa方法检测杂交瘤细胞分泌抗体的情况。具体方法如下：将杂交瘤细胞上清加入预先以步骤3中确定的最佳包被浓度包被好的elisa板中，100μl/孔，以sp2/0细胞上清作为阴性对照，免疫鼠多抗血清作为阳性对照，37℃水浴2h；pbst洗涤3次；加入工作浓度的辣根过氧化物酶hrp标记的羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃水浴1.5h；洗涤后，加tmb显色10-15min，显色终止后酶标仪测定od450读数。被测孔od450读数大于阴性对照2倍以上判定为阳性。将筛选的阳性克隆命名为4g9。
5.阳性杂交瘤细胞的克隆化
采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆4g9进行2-3次的亚克隆并进行保藏。
实施例2：牛mcp-1单克隆抗体制备
1.腹水制备
采用体内诱生腹水法，按常规方法进行。10-12周龄健康balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3-0.5ml/只，7-10天后，分别腹腔接种经pbs稀释的培养至对数期生长的杂交瘤细胞4g9，5×105个细胞/只；七天后，收集腹水，离心去除沉淀，收集上清，间接elisa法测定抗体效价，分装，-70℃保存。
2.抗体纯化
将制备的mab4g9腹水使用proteina亲和层析方法进行纯化。
实施例3：单克隆抗体特性检测
1.单抗亚类的鉴定
按单克隆抗体亚类试剂盒说明书进行，采用抗原介导的elisa法。在已包被的酶标板内分别加入细胞培养上清100μl/孔，37℃1h，pbst洗涤3次，每次5min；分别加入1:1000稀释的羊抗鼠iga、igg1、igg2a、igg2b、igg3、igm亚类抗体50μl/孔，37℃0.5h，每株单抗加每种亚类两孔，pbst洗涤3次每次5min；加入1:5000稀释的兔抗羊酶标二抗50μl/孔，37℃15min，pbst洗涤3次；加tmb显色液100μl/孔，37℃避光显色10-15min，2mh2so450μl/孔终止反应，以肉眼观察颜色明显高于其他孔者所加亚类抗体为单抗亚类。
结果显示，单抗mab4g9亚类为iga。
2.单抗腹水效价的测定
使用包被缓冲液将检测抗原稀释至一定浓度，每孔100μl包被elisa板，4℃过夜；pbst洗涤3次，每孔加入200μl封闭液，4℃过夜；将单抗腹水倍比稀释，每孔100μl，同样倍数稀释sp2/0腹水作为阴性对照，37℃孵育2h；用pbst洗涤3次，加入工作浓度的酶标二抗，每孔100μl，37℃孵育1.5h；pbst洗涤后，tmb显色，酶联检测仪测定od450的值，以p/n≥2.1为判定标准，测定单抗腹水效价。
结果显示，单抗mab4g9的效价为1:1024000。单抗mab4g9的效价很高，表示利用其制备诊断试剂能产生高的灵敏性。
3.单抗特异性的鉴定
采用间接elisa方法鉴定单抗的特异性。将相同浓度的rgst-bomcp-1、rhis-boil-2、rgst-boil-2、rhis-boil-4、rgst-boil-4、rhis-boip-10、rgst-boip-10包被过夜；次日，pbst洗涤3遍，每遍5min，尽量将液体拍干，2％牛血清白蛋白bsa的磷酸缓冲盐溶液pbs封闭2h；pbst洗涤3遍，每遍5min，尽量将液体拍干，加入各株杂交瘤细胞上清，100μl/孔，37℃孵育2h；pbst洗涤6遍，每遍5min，将洗涤液尽量拍干，加入用1％bsa的pbs稀释至工作浓度的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃孵育1h；pbst洗涤6次，每次5min，将洗涤液尽量拍干，加入tmb显色液，100μl/孔，37℃避光孵育5min；加入2mol/lh2so4终止反应，50μl/孔，测定od450值。
在间接elisa试验中，单抗mab4g9只与rgst-bomcp-1反应，而不与原核表达的上述其它重组细胞因子反应，说明本发明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体mab4g9与bomcp-1抗原蛋白具有良好的反应性、特异性和亲和力。
4.流式细胞术鉴定单抗与天然抗原的反应性
无菌采取健康奶牛尾静脉血5ml加入含肝素钠的采血管中，将抗凝剂上下颠倒混匀数次；在无菌超净操作台内将抗凝血与灭菌pbs1:1稀释，再按1:1的比例将稀释牛血沿着管壁缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，室温2000rpm离心25min；管内液体分成四层，在血浆和淋巴细胞分离液之间有一层可见的外周血单个核细胞云雾状层为淋巴细胞。用灭菌滴管吸取淋巴细胞层至一干净的离心管中，加入1640培养基，将细胞混匀后，室温2000rpm离心10min，重复两次，弃去上清；弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬细胞，细胞计数后，将细胞加入24孔板中，并分为2组，一组加入细菌脂多糖lps刺激剂，终浓度为10μg/ml，另一组不加lps刺激，置于37℃5％co2培养箱培养24h。刺激培养4-6h后，加入bfa阻断；次日，2000rpm10min离心，收集细胞；使用含1％bsa的pbs洗涤细胞，2000rpm10min，离心，弃上清；加固定剂，室温静置作用15min；用含1％bsa的pbs洗涤细胞；2000rpm10min离心，弃上清；用破膜剂稀释单抗腹水，分别加入lps刺激组与未刺激组，2μl/样。室温作用20min；用含1％bsa的pbs洗涤细胞；2000rpm10min离心，弃上清；加入用含1％bsa的pbs稀释至工作浓度的fitc标记羊抗鼠igg，室温避光作用20min，用含1％bsa的pbs洗涤2次，2000rpm10min离心，弃上清；使用200μl含1％bsa的pbs重悬细胞，进行facs检测。
流式细胞术检测结果显示，lps刺激组和未刺激组之间存在一定的差异，表明mab4g9单抗可以识别牛天然mcp-1，显示其作为诊断试剂的应用潜能。
实施例4：western-blot试剂盒的组装
western-blot试剂盒的组装步骤如下：
1.制备辣根过氧化物酶标记的牛mcp-1单克隆抗体(命名为hrp-4g9)：
称取辣根过氧化物酶(hrp)2mg于5ml离心管，以0.5ml去离子水溶解，此时溶液显红棕色立即避光保存；加入0.5ml新鲜配置的0.06mol/l高碘酸钠，此时溶液变青色，4℃避光作用30min；加入160mmol/l乙二醇0.5ml室温作用30min；加入纯化单克隆抗体4g92mg混匀，将混合液装入透析袋在2l0.05mol/l碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜；将透析液转入离心管中，加入0.2ml新鲜配置的5mg/ml硼氢化钠混匀，于4℃作用2h；加入等体积饱和硫酸铵4℃作用30min，以4000rpm/min离心20min弃上清，用pbs溶解沉淀4℃透析过夜，加等体积甘油，加入0.1％proclin300，0.45μm滤膜过滤，按110μl/支分装，2-8℃保存。
2.将辣根过氧化物酶标记的牛mcp-1单克隆抗体mab4g9(hrp-4g9)以及细菌脂多糖lps刺激剂，包装组装成试剂盒。
进一步的，试剂盒中依次需要组装入：封闭液、洗涤液、底物液的一种或多种。
实施例5：牛重组mcp-1蛋白的western-blot检测
1.sds-page电泳
将纯化蛋白rhis-bomcp-1、rgst-bomcp-1分别加入蛋白上样buffer，100℃煮沸10min，进行sds-page电泳。
2.转印
电泳结束后，将凝胶置于转印buffer中浸泡5min，同时将nc膜和滤纸同样浸泡，按照从上到下为2张滤纸-nc膜-凝胶-2张滤纸的顺序，铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在bio-radsemi-drytransfercell系统中以0.8ma/cm2转印2h。
3.检测
①用含5％脱脂奶的pbs封闭，室温摇晃封闭过夜；
②用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；
③加入用pbs1:1000稀释的hrp-4g9，室温震荡作用2h；
④用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；显色，自来水终止反应，扫描仪拍照反应结果。
结果见图1，a显示重组his-bomcp-1蛋白检测结果，b显示出重组gst-bomcp-1蛋白检测结果。结果显示western-blot方法可以有效检测大肠杆菌表达系统表达的牛mcp-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。
实施例6：牛外周血单个核细胞样品的western-blot检测
1.制备牛外周血单核细胞
①无菌采取5ml待测牛血加入含肝素钠的采血管中，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌pbs1:1稀释后，再按1:1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rmp离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取外周血单核细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌pbs，将细胞混匀后，于4℃2000rmp离心10min，重复两次，得到沉淀细胞；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μl细胞悬液加入10μl酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/ml。
2.细胞孵育
在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μl培养液至每个对照孔，500μl10μg/ml的lps至每个阳性孔。每孔加入500μl稀释的细胞悬液，置于37℃，5％co2培养箱培养24-48小时，收集细胞作为检测样品；
3.sds-page电泳
将细胞裂解液加入蛋白上样buffer，100℃煮沸10min，进行sds-page电泳。
4.转印
电泳结束后，将凝胶置于转印buffer中浸泡5min，同时将nc膜和滤纸同样浸泡，按照从上到下为2张滤纸-nc膜-凝胶-2张滤纸的顺序，铺好后转至半干转印仪中，注意排去气泡。在bio-radsemi-drytransfercell系统中以0.8ma/cm2转印2h。
5.检测
①用含5％脱脂奶的pbs封闭，室温摇晃封闭过夜；
②用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；
③加入用pbs1:1000稀释的hrp-4g9，室温震荡作用2h；
④用pbst清洗膜，洗涤4次，每次10min，将膜上的残留洗涤液尽量甩干；显色，自来水终止反应，扫描仪拍照反应结果。
结果显示western-blot检测试剂盒可以有效检测牛外周血单核细胞分泌的天然牛mcp-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。
实施例7：直接免疫荧光(dfa)检测试剂盒的组装
dfa试剂盒的组装步骤如下：
1.制备异硫氰酸荧光素标记的牛mcp-1单克隆抗体(命名为fitc-4g9)：
将纯化mab4g9单抗采用标准异硫氰酸荧光素标记法进行标记。将待交联单抗mab4g9(浓度≥1mg/ml)对交联反应液4℃透析三次，至ph为9.0；将新鲜配制的fitc(浓度为1mg/ml)溶于dmso中；按p：f(蛋白质：fitc)＝1mg：150μg的比例将fitc缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h；加入5mol/l的nh4cl至终浓度50mmol/l，4℃终止反应2h；将交联物在pbs中透析四次以上，至透析液清亮；进行交联物蛋白浓度、f/p比例的鉴定；fitc交联的蛋白应置于ph7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％nan3、1％bsa，4℃避光保存。
2.将异硫氰酸荧光素标记mcp-1单克隆抗体4g9(fitc-4g9)以及细菌脂多糖lps刺激剂，分别包装组装成试剂盒。
进一步的，试剂盒中依据需要组装入：固定剂以及洗涤液中的一种或多种。
实施例8：牛重组mcp-1蛋白的直接免疫荧光(dfa)检测
1.转染
①转染前24h，消化接种hek293t细胞于24孔板中，2×105个细胞/孔；
②加入
③分别加入重组质粒pvax1-gfp-bomcp-1和空载体质粒pvax1各1μl，以及p3000tm2μl至含opti-mem的1.5ml指形管中至总体积50μl；
④分别加入含
2.细胞因子检测
①吸去hek293t(pvax1-gfp-bomcp-1)和hek293t(pvax1)细胞的培养上清，使用500μlpbs洗两次，加入500μl-20℃预冷的冰甲醇于-20℃固定10min；
②用500μlpbs洗三次，加入1:1000稀释的mab4g9，置37℃水浴锅孵育2h；
③用500μlpbs漂洗三次，加入fitc标记的羊抗鼠igg，用pbs稀释至1:500的工作浓度，置37℃水浴1h；
④用500μlpbs洗3次，使用荧光倒置显微镜进行观察。
结果显示直接免疫荧光(dfa)方法可以有效检测真核表达系统中的牛mcp-1蛋白，具有较好的灵敏度和特异性。
实施例9：牛外周血单核细胞样品的直接免疫荧光(dfa)检测
1.制备牛外周血单核细胞
①无菌采取5ml待测牛血加入含肝素钠的采血管中，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌pbs1:1稀释后，再按1:1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rmp离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取外周血单核细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌pbs，将细胞混匀后，于4℃2000rmp离心10min，重复两次，得到沉淀细胞；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μl细胞悬液加入10μl酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/ml。
2.细胞孵育
在24孔细胞培养板中加入下列试剂：500μl培养液至每个对照孔，500μl10μg/ml的lps至每个阳性孔。每孔加入500μl稀释的细胞悬液，置于37℃，5％co2培养箱培养24-48小时，收集细胞；
3.细胞因子检测
①吸去细胞的培养上清，使用500μlpbs洗两次，加入500μl-20℃预冷的冰甲醇于-20℃固定10min；
②用500μlpbs洗三次，加入1:1000稀释的mab4g9，置37℃水浴锅孵育2h；
③用500μlpbs漂洗三次，加入fitc标记的羊抗鼠igg，用pbs稀释至1:500的工作浓度，置37℃水浴1h；
④用500μlpbs洗3次，使用荧光倒置显微镜进行观察。
结果见图2，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔(b)有明显绿色荧光，而对照样品孔(a)没有绿色荧光，这表明该试剂盒可以有效检测出lps刺激牛外周血中分泌牛mcp-1的细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
实施例10：fcm检测试剂盒的组装
fcm检测试剂盒的组装步骤如下：
1.制备异硫氰酸荧光素标记的牛mcp-1单克隆抗体(命名fitc-4g9)：
将纯化mab4g9单抗采用标准异硫氰酸荧光素标记法进行标记。将待交联单抗mab4g9(浓度>1mg/ml)对交联反应液4℃透析三次，至ph为9.0；将新鲜配置的fitc(浓度为1mg/ml)溶于dmso中；按p:f(蛋白质：fitc)＝1mg：150μg的比例将fitc缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8小时；加入5mol/l的nh4cl至终浓度50mmol/l，4℃终止反应2h；将交联物在pbs中透析四次以上，至透析液清亮；进行交联物蛋白浓度、f/p比例的鉴定；fitc交联的蛋白应置于ph7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％nan3、1％bsa，4℃避光保存。
2.将异硫氰酸荧光素标记牛mcp-1单克隆抗体、细菌脂多糖lps刺激剂，分别包装组装成试剂盒。
进一步的，试剂盒中依次需要组装入：阻断剂布雷非德菌素brefeldin、固定剂、破膜剂以及洗涤液中的一种或多种。
实施例11：牛外周血单核细胞样品的fcm检测
1.制备牛外周血单核细胞
①无菌采取5ml待测牛血加入含肝素钠的采血管中，在采集血液后颠倒混匀得到抗凝血；
②将抗凝血与灭菌pbs1:1稀释后，再按1:1的比例将稀释牛血缓缓加入含牛淋巴细胞分离液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2000rmp离心20-30min；
③可见外周血单核细胞存在于云雾状层中，用灭菌滴管吸取外周血单核细胞层至一干净的离心管中，加入灭菌pbs，将细胞混匀后，于4℃2000rmp离心10min，重复两次，得到沉淀细胞；
④弃去上清培养液，加入完全1640培养基重悬沉淀细胞，取10μl细胞悬液加入10μl酚蓝混匀后加入血球计数板，在显微镜下计数，并使用完全1640培养基将细胞悬液稀释至1×107个细胞/ml。
2.细胞孵育
①在96孔细胞培养板中加入下列试剂：50μl培养液至每个对照孔，50μl10μg/ml的lps至每个阳性孔。每孔加入50μl细胞悬液，将96孔细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱培养4-6小时；
②加入细胞因子分泌阻断剂bfa，在放入37℃、5％co2培养箱培养16小时。
3.细胞因子检测：
①次日收集培养细胞，使用含1％bsa的pbs洗涤细胞，于4℃2000rpm离心10min，弃上清；
②加固定剂，室温静置作用15min；用含1％bsa的pbs洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；
③使用破膜剂稀释fitc标记特异性针对牛mcp-1单抗mab4g9至0.5μg/ml，室温静置作用15min，使用含1％bsa的pbs洗涤细胞；于4℃2000rpm离心10min，弃上清，重复两次；
④使用200μlpbs重悬细胞，进行facs检测分泌牛mcp-1的细胞比例。
结果见图3，结果显示在检测牛外周血单核细胞样品时，阳性样品孔b中分泌牛mcp-1细胞比例(0.345％)高于对照样品孔(0.131％)，这表明该试剂盒有效检测出lps刺激牛外周血中分泌牛mcp-1的细胞，具有较好的灵敏度和特异性。
以上所述仅是本发明的优选实例而已，并未对本发明做任何形式的限制，虽然本发明已以优选实施例揭发如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭露的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。