本发明属于生物技术领域，特别涉及一种嗜碱链霉菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用。
背景技术：
木聚糖是以木吡喃糖为单位的由β-1,4键连接的半纤维素，富含于阔叶树和大多数一年生植物体内。而半纤维素在自然界中含量占生物量的30％，仅次于纤维素。
木聚糖酶是将木聚糖催化水解成低聚木糖或木寡糖的酶系总称，包括多种木聚糖内切酶和外切酶，广泛分布于细菌、真菌、酵母、放线菌、反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中，其中细菌来源的中性或碱性木聚糖酶具有较高的耐碱性和热稳定性。木聚糖酶具有广泛的应用，在造纸工业中，可应用于纸浆漂白、废纸脱墨；在饲料行业中，木聚糖酶可降低小麦型日粮水溶性木聚糖导致的食糜黏性增高，从而提高消化酶对底物的作用效率，同时木聚糖酶可作用于不溶性非淀粉多糖，破碎植物细胞壁，并释放出营养物质；在酿酒和食品行业中应用也非常广泛，如木聚糖酶添加到面粉中，可以改善面团的持水性、稳定性和对过度发酵的耐受性，提高入炉急涨性能，增大烘烤后面包的体积，改善面包心质地，降低面包的老化速率，延长货架寿命。
根据催化域氨基酸序列及结构的相似性，木聚糖酶多被划分为糖苷水解酶10家族或第11家族。另外，第5家族、第7家族、第8家族或第43家族的木聚糖酶也有报道。大部分木聚糖酶属于f/10和g/11两大家族。g/11木聚糖酶多为单结构域，相对分子质量较小，催化产物中寡聚糖较多，而单糖较少，酶的最适作用温度为50～60℃，酶的空间结构呈“右手半握状”。f/10木聚糖酶则含有较多结构域，不仅具有催化结构域，而且还有纤维素结合结构域(cellulosebindingdomain:cbd)，相对分子质量较大，催化产物中单糖较多，最适作用温度为60～80℃，酶的空间结构呈“碗状”。与g/11家族相比，f/10家族木聚糖酶在耐高温、耐酸和耐碱等方面更具优越性。在密码子偏好性方面，f/10木聚糖酶基因的密码子以“a”碱基为主，而g/11家族以“g/c”碱基为主。目前，工业上直接利用木聚糖酶还存在一些问题：稳定性差、底物特异性低、使用寿命短和成本高等。作为一种微生物制剂，木聚糖酶对温度、湿度和酸碱度都有一定的要求。为了适应不同饲料加工工艺及应用的需要，常需筛选耐高温的菌种，或采用基因工程及蛋白质工程手段改造木聚糖酶的属性，以满足各种因素对木聚糖酶的要求。现阶段生产的木聚糖酶均为真菌来源的木聚糖酶，这些酶的最适作用ph值普遍小于5.5。此外，木聚糖酶特异性低，直接利用效果较差，因此还应深入研究底物种类及质量浓度与木聚糖酶用量的关系，探讨不同酶制剂间的配伍效果，提高木聚糖酶的底物特异性。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种嗜碱链霉菌streptomycessp.wmn-3。该嗜碱链霉菌可产生一种碱性木聚糖酶。
本发明的另一目的在于提供上述嗜碱链霉菌streptomycessp.wmn-3产生的碱性木聚糖酶。该酶具有ph适应范围广，耐热、碱、金属离子和表面活性剂等适用于造纸等工业的优良酶学特性。
本发明的再一目的在于提供上述嗜碱链霉菌及其产生的碱性木聚糖酶的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种嗜碱链霉菌，是从红树林土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株streptomycessp.wmn-3。所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2017年9月7日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctccno：m2017477。
菌落形态特征：在琼脂平板上的菌落直径一般为1～1.5μm，呈米白色，不规则圆形，突起，全缘。
所述的琼脂平板，其配方为琼脂20g/l，葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母提取物5g/l，kh2po41g/l，mgcl20.2g/l，nacl50g/l，na2co310g/l，ph9.0；
该菌株的选择培养基配方：木聚糖5.0～8.0g/l，kno31.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl10～15g/l，kh2po41.5g/l，固体培养基加琼脂15～20g/l，ph8.0～9.0；培养温度为30～37℃。
所述嗜碱链霉菌streptomycessp.wmn-3产生的碱性木聚糖酶，按下述方法制得：
(1)粗酶液的提取
将streptomycessp.wmn-3菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，将48h培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液，用于离子交换层析；
(2)碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)阴离子交换层析
离子交换层析的介质为deaesepharosefastflow；缓冲液体系采用ph值为8.0的tris-hcl缓冲液，平衡液为ph8.0tris-hcl缓冲液，洗脱液为含naclph8.0tris-hcl缓冲液；取100ml介质小心灌入层析柱(规格为φ2.6cm×30cm)中，使得凝胶均匀且无气泡；用300ml的平衡液进行平衡，直至a280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现之后收集穿透峰，透析、浓缩；
(b)阳离子交换层析
层析介质为spsepharosefastflow；缓冲液体系采用ph值为6.0的pbs缓冲液；把阴离子交换层析所得酶活峰透析浓缩，加入到预先用ph值为6.0的pbs缓冲液平衡好的层析柱上，以60ml·h-1的流速用含nacl的ph6.0的pbs缓冲液洗脱，收集具有酶活性的洗脱峰，通过透析浓缩，得到碱性木聚糖酶，并置于4℃保存备用。
所述碱性木聚糖酶的蛋白分子量约为39kd，比活力达131.2iu/ml；最适ph为7～9左右，在ph6～11范围内，酶活性均可保持在80％以上；最适反应温度为50～60℃左右；具有耐co2+、mn2+、zn2+、ca2+、li+、fe3+、ag+、al3+、mg2+等金属离子的良好特性，但cu2+对碱性木聚糖酶的酶活性有一定的抑制作用；sds和螯合剂edta对碱性木聚糖酶的酶活性影响甚微。
所述嗜碱链霉菌streptomycessp.wmn-3及其产生的碱性木聚糖酶在造纸等工业中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明筛选得到的streptomycessp.wmn-3属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下(ph9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
(2)本发明嗜碱链霉菌streptomycessp.wmn-3产生的碱性木聚糖酶的比活力达131.2iu/ml；最适ph为7～9左右，在ph6～11范围内，酶活性均可保持在80％以上；最适反应温度为50～60℃左右；在50℃以下酶活性稳定。具有耐co2+、mn2+、zn2+、ca2+、li+、fe3+、ag+、al3+、mg2+等金属离子的良好特性，但cu2+对碱性木聚糖酶的酶活性有一定的抑制作用；sds和螯合剂edta对碱性木聚糖酶的酶活性影响甚微。
附图说明
图1是streptomycessp.wmn-3菌在1％刚果红平板上生长所产生的透明圈的结果图。
所述的1％刚果红平板的配方是：刚果红10g/l，木聚糖8.0g/l，kno31.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl15g/l，kh2po41.5g/l，固体培养基加琼脂15～20g/l，ph9.0。
图2是木聚糖标准曲线图。
图3是分离纯化的sds-page电泳结果图；其中：泳道m为marker，来自fermentas公司；泳道1为纯化的目的蛋白。
图4是碱性木聚糖酶wmn-3的最适反应ph的结果图。
图5是碱性木聚糖酶wmn-3的最适反应温度(℃)的结果图。
图6是碱性木聚糖酶wmn-3的ph稳定性的结果图。
图7是碱性木聚糖酶wmn-3的温度稳定性的结果图。
图8是streptomycessp.wmn-3菌基因组dna电泳图；其中：泳道m为takara公司的dl15000marker；泳道1为基因组dna。
图9是碱性木聚糖酶wmn-3基因保守序列pcr结果的电泳图；其中：泳道m为takara公司的dl5000marker；泳道1为wmn-3基因保守dna序列。
图10是碱性木聚糖酶wmn-3基因的保守dna序列的上游pcr结果的电泳图；
其中：泳道m为takara公司的dl5000marker；泳道1为wmn-3基因的保守dna序列的上游pcr结果。
图11是碱性木聚糖酶wmn-3基因的保守dna序列的下游pcr结果的电泳图；
其中：泳道m为takara公司的dl5000marker；泳道1为wmn-3基因的保守dna序列的下游pcr结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1菌株的分离培养
1、富集培养
从红树林的土壤中筛选得到产碱性木聚糖酶菌株。称取1g土样，加入到100ml的无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液，分别取1ml菌悬液接入到事先灭好菌的5ml富集培养基中，37℃、200rpm富集培养48h。
富集培养基：木聚糖8.0g/l，蛋白胨10g/l，nacl15g/l，kh2po41.5g/l，na2hpo4·12h2o9.0g/l，mgso4·7h2o2.0g/l，ph9.0。
2、平板初筛
将富集培养后的菌液10倍逐级稀释，分别取稀释倍数为10-3、10-5、10-7的菌悬液0.5ml涂布于含有木聚糖的碱性选择培养基平板，37℃培养48h，将透明圈较大的单菌落挑入碱性斜面培养基，如此反复多次，直至确定为纯菌为止，使用斜面培养基保藏原始菌种。
选择培养基：木聚糖8.0g/l，kno31.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl15g/l，kh2po41.5g/l，固体培养基加琼脂15～20g/l，ph9.0；培养温度为37℃。
斜面培养基：葡萄糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母提取物5g/l，kh2po41g/l，mgcl20.2g/l，nacl50g/l，na2co310g/l，ph9.0。
3、产碱性木聚糖酶菌株的筛选结果
本发明从选取的土样中，经过含木聚糖的刚果红平板筛选，发现了一个能够产生明显透明圈的菌株(如图1)。3％麦麸发酵培养基(麦麸3.0g/l，蛋白胨10g/l，nacl15g/l，kh2po41.5g/l，na2hpo4·12h2o9.0g/l，mgso4·7h2o2.0g/l，ph9.0)37℃、200rpm发酵培养7天后，测量粗酶液酶活，发现其活性高达131.2iu/ml。表明其具有较高的产酶能力。利用pcr扩增该菌株的16srdna序列，到genbank上进行比对，比对结果显示，该菌株的16srdna序列与其它多株链霉菌的16srdna序列有99％的相似性，初步判断为链霉菌(streptomycessp.)，将其命名为streptomycessp.wmn-3。
该嗜碱链霉菌，名称为streptomycessp.wmn-3，所述菌株保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏日期：2017年9月7日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：cctccno：m2017477。
与当前工业用酶菌株相比，streptomycessp.wmn-3菌属于耐碱的极端微生物，可在高碱性条件下(ph9.0)培养，具有可有效抑制杂菌污染，有利于大规模的发酵生产的特点。
所述的streptomycessp.wmn-3菌株的16srdna序列如seqidno：1所示，其长度为1540bp。
实施例2嗜碱链霉菌streptomycessp.wmn-3产生的碱性木聚糖酶的分离纯化
(一)材料
1、菌种
嗜碱链霉菌，是从红树林的土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株streptomycessp.wmn-3(cctccno：m2017477)。
2、培养基
选择培养基：木聚糖8.0g/l，kno31.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nacl15g/l，kh2po41.5g/l，固体培养基加琼脂15～20g/l，ph9.0；培养温度为37℃。
3、主要试剂
离子交换层析介质deaesepharosefastflow，sp-sepharosefastflow阳离子交换层析介质均购自ge公司。acrylamide(丙烯酰胺)、n,n-甲叉双丙烯酰胺由serva进口分装。dna聚合酶、dna分子量标记为宝生物公司产品；蛋白分子量标记为fermentas(mbi)公司产品；乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(egta)、盐酸胍、甘氨酸、tritonx-100等其余试剂均为国产分析纯。pcr引物合成由上海生工完成，dna序列测定由invitrogen公司完成；基因提取试剂盒为oemga公司产品。
4、仪器
thermalcyclerpcr仪为appliedbiosystemsbylifetechnologies公司、dna及蛋白电泳系统为bio-rad公司产品；thermomixercomfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为eppendorf公司产品；低温高速离心机为sigma公司产品；dolphin-doc凝胶成像系统为美国wealtec公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为wagen公司产品。
(二)实验方法
1、粗酶液的提取
将streptomycessp.wmn-3菌种接到液体选择培养基中，于37℃、200rpm培养48h，将48h培养液以14000rpm的转速冷冻离心20min，取上清液；利用3000道尔顿超滤浓缩膜将上清液超滤浓缩，即得粗酶液，用于离子交换层析；
2、酶活测定方法
取1mlph＝9的tris-hcl缓冲液制备1％的木聚糖溶液，加入100μl经适当稀释的上述酶液，在40℃下振荡反应15min，终止反应后，迅速加1mldns(3,5-二硝基水杨酸)溶液沸水浴10min，然后加2ml去离子水，于540nm测定还原糖，并扣除空白试验测定值。将上述条件下每分钟由底物产生1μmol木聚糖所需的酶量定义为一个酶活力国际单位，用iu/ml表示。
3、木聚糖标准曲线
准确称取无水木聚糖1g定容至100ml，然后分别取1％标准木聚糖液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5ml定容至100ml，再分别取上述不同浓度溶液各1.1ml于试管中(另设一管取1.1ml蒸馏水作对照)，各加1mldns，煮沸显色10min，冷却后测540nm处的吸光度(测3次取平均值)。以吸光度为纵坐标，对应标准木聚糖溶液含糖量为横坐标，绘制标准曲线(如图2)。
4、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳
按常规方法sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为ph8.3tris-gly缓冲液，考马斯亮蓝染色。
5、碱性木聚糖酶的分离纯化
(a)阴离子交换层析
离子交换层析的介质为deaesepharosefastflow；缓冲液体系采用ph值为8.0的tris-hcl缓冲液，平衡液为ph8.0tris-hcl缓冲液，洗脱液为含naclph8.0tris-hcl缓冲液；取100mldeaesepharosefastflow(ge)小心灌入规格为φ2.6cm×30cm的层析柱(ge)中，使得凝胶均匀且无气泡；用300ml的平衡液进行平衡，直至a280稳定后上样(粗酶液)，待穿透峰出现之后收集穿透峰，透析、浓缩。
(b)阳离子交换层析
层析介质为spsepharosefastflow；缓冲液体系采用ph值为6.0的pbs缓冲液；把阴离子交换层析所得酶活峰透析浓缩，加入到预先用ph值为6.0的pbs缓冲液平衡好的层析柱上，以60ml·h-1的流速用含nacl的ph6.0的pbs缓冲液洗脱，收集具有酶活性的洗脱峰，通过透析浓缩，得到碱性木聚糖酶纯酶液，并置于4℃保存备用。
(三)实验结果
用sds-page电泳法测定，结果如图3所示，泳道1可见一道明显目的蛋白条带，基本达到分离纯化要求。电泳后用geldoc2000(bio-rad)进行凝胶扫描。运用扫描系统自带软件quantityone进行分子量测定，测得碱性木聚糖酶的蛋白分子量约为39kd。
实施例3碱性木聚糖酶的酶学性质研究
(一)实验方法
1、最适反应ph及ph稳定性
取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液，分别加入不同ph值的1％木聚糖溶液，按常规方法测定酶活力。同时，分别将纯酶液置于不同的预定ph条件下保存30min，再按常规方法于ph9.0条件下测定其酶活力。
2、最适反应温度和温度稳定性研究
取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液分别置于不同温度条件下反应20min，测定其酶活力。同时，将纯酶液分别置于不同的温度条件下(20℃～70℃)保温10min，然后于40℃反应20min测定其酶活力。
3、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
取适量实施例2获得的碱性木聚糖酶的纯酶液分别置于终浓度为10mm的各种金属离子以及0.2％、0.5％edta，0.01％、0.05％sds(十二烷基磺酸钠)中，30℃保存10min后按照常规方法测定其酶活力。
(二)实验结果
1、最适反应ph
取适量纯酶液，分别加入不同ph值的1％木聚糖溶液，按常规方法测定酶活力，结果如图4所示。由图4可见，wmn-3酶的最适ph为8左右，为一典型的碱性木聚糖酶。
2、最适反应温度
将纯酶液分别置于不同温度条件下反应20min，测定其酶活力，结果如图5。由图5可见，wmn-3酶的最适反应温度为55℃。
3、ph稳定性
为研究wmn-3蛋白的ph稳定性，分别将纯酶液置于不同的预定ph条件下保存30min，再按常规方法于ph9.0条件下测定其酶活力。结果(如图6)表明，该酶在ph5～9的范围内，酶活性可保持60％以上。可见该碱性木聚糖酶酶在弱酸和弱碱性条件下均具较强的稳定性。
4、温度稳定性研究
将纯酶液分别置于不同的温度条件下(20℃～70℃)保温30min，然后于40℃反应20min测定其酶活力。结果(如图7)表明，该酶65℃以下具有较好稳定性，表明wmn-3酶蛋白为优良的耐热性碱性木聚糖酶，在生产应用方面显示了良好的应用前景。
5、金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
把纯化得到的wmn-3酶蛋白分别置于终浓度为10mm的各种金属离子，质量百分比0.2％、0.5％edta，0.01％、0.05％sds中，30℃保存10min后按照常规方法测定其酶活力，结果如表1所示。结果表明，wmn-3酶蛋白在10mmco2+、mn2+、zn2+、ca2+、li+、fe3+、ag+、al3+、mg2+等金属离子中的酶活均保持在90％以上，具有耐多种金属离子的良好特性，但cu2+对酶活有一定的抑制作用。sds和螯合剂edta对wmn-3酶活性影响甚微。可见，wmn-3酶具有耐多种金属离子和表面活性剂的优良特性，符合造纸等工业用酶的基本要求。
表1金属离子、表面活性剂和金属螯合物对酶活力的影响
实施例4
(一)材料
1、菌种
嗜碱链霉菌，是从红树林的土壤中筛选得到的产碱性木聚糖酶菌株streptomycessp.wmn-3(cctccno：m2017477)。e.colitop10f′购自invitrogen公司；
2、载体。大肠杆菌克隆载体pmd18-t购自大连宝生物公司，大肠杆菌表达载体pet-28a(+)(novagen，kanr)购自novagen公司。
3、培养基
(1)选择培养基：木聚糖8.0g/l，kno31.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，nac115g/l，kh2po41.5g/l，固体培养基加琼脂15～20g/l，ph9.0；
(2)lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl10g/l，固体培养基加琼脂15～20g/l，ph9.0，121℃高压灭菌20min。
4、主要试剂
dna聚合酶、dna分子量标记为宝生物公司产品；lysozyme(dnasernasenon-detected，>70,000u/mg)、一步法快速制备感受态细胞试剂盒(sscs)为上海生工生物工程公司产品。pcr引物合成由上海生工完成，dna序列测定由invitrogen公司完成；基因提取试剂盒、pcr产物片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为oemga公司产品。
5、仪器
thermalcyclerpcr仪为appliedbiosystemsbylifetechnologies公司、dna电泳系统为bio-rad公司产品；分光光度计及微量分光光度计为pharmaciabiotech公司产品；thermomixercomfort温控振荡仪、移液枪、台式离心机为eppendorf公司产品；低温高速离心机为sigma公司产品；dolphin-doc凝胶成像系统为美国wealtec公司产品；恒温摇床及恒温水浴锅为wagen公司产品。
(二)实验方法和结果
1、基因组dna的提取
在37℃、200r/min摇瓶培养streptomycessp.wmn-3菌，48h后离心收集菌体，然后利用thee.z.n.abacterialdnakit试剂盒提取基因组总dna。其基本步骤如下：
(a)培养基接种streptomycessp.wmn-3菌，放入温控摇床中，于37℃，200rpm摇瓶培养36h后取出分装备用。
(b)将3mlstreptomycessp.wmn-3菌液在室温条件下8000rpm离心10min；
(c)弃去上清液，保留沉淀，然后加入180μltebuffer重悬菌体，再加入20μl50mg/ml溶菌酶溶液30℃条件下水浴10min；
(d)水浴完成后在室温条件下8000rpm离心5min，去掉上清，加入200μlbtlbuffer，短暂涡旋；
(e)加入25～40mg玻璃珠，高速涡旋5min；
(f)加入25μl蛋白酶k溶液，短暂涡旋，然后55℃水浴60min；
(g)加入5μlrnasea溶液，反复颠倒，然后室温放置5min；
(h)室温条件下12000rpm离心5min，吸取上清到另外一个干净的离心管中，避免吸到沉淀；
(i)加入220μlbdlbuffer，短暂涡旋，然后65℃水浴10min；
(j)加入220μl无水乙醇，高速涡旋20s，然后将混合液转移到套有2.0ml收集管的akibaiincolumn中，12000rpm离心1min；
(k)弃去收集管中的液体，加入500μl的hbbuffer，然后10000rpm离心1min；
(l)弃去收集管中的液体，加入700μl的dnawashbuffer，然后10000rpm离心1min；
(m)重复加入700μl的dnawashbuffer，然后10000rpm离心1min；
(n)弃去收集管中的液体，再用12000rpm离心2min以除尽剩余的washbuffer；
(h)将akibaiincolumn放入一个洁净的ep管中，然后在akibaiincolumn膜的中央处加入50～100μl的elutionbuffer，室温放置2min，10000rpm离心1min将dna抽提下来。
采用1％琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检测。结果如图8所示，能看到一条较为明显的条带，所用dnaladdermarker最大条带为15,000bp，基因组条带在marker最大条带之上，说明其大小超过15,000bp，符合基因组大小要求。
2、touchdownpcr克隆木聚糖酶基因保守序列
(1)使用primerpremier5.0软件设计上下游引物。根据已知的10家族木聚糖酶保守序列设计上游简并引物wmn-3jbup(5'-ctctggaagccnayncmrtsna-3')和下游简并引物wmn-3jbdown(5'-gactgggaygtngtnaayga-3')，送去合成。
(2)使用takara的pcramplificationkit试剂盒，以基因组dna为模板，按照如下反应体系配制pcr反应液：
然后按照以下条件进行touchdownpcr反应：
采用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr产物进行检测。结果如图9所示。在泳道1中，有一条大小约为250bp的条带，符合已知的10家族木聚糖酶基因保守序列大小，所以对该条带进行回收。
3、touchdownpcr产物回收
pcr产物回收使用的是omega公司生产的gelextractionkit(100)d2500-01，主要步骤如下：
(1)在紫外灯下切出含有目的dna的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，此时应注意尽量切除不含目的dna部分的凝胶，减小凝胶体积，提高dna回收率，之后放入ep管中。(注意切胶时不要将dna长时间暴露于紫外灯下，以防止dna损伤)
(2)切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤(3)的胶块融化时间，提高dna的回收率。称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μl进行计算，向胶块中加入等量的胶块融化液bindingbuffer。
(3)50℃溶解7～15min，保证溶胶要完全，否则会影响后续回收。
(4)将溶胶放入层析柱中(不超过700μl)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(5)加入300μl的bindingbuffer，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(6)加入700μl的spw，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。
(7)重复步骤(6)。
(8)将空柱13,000rpm离心2min，以去掉残存的乙醇，否则会严重影响后续dna的回收。
(9)弃掉收集管，换成干净的ep管，往吸附柱正中间的吸附膜小心加入15μlelutionbuffer，室温静置3min，13,000rpm离心2min，不立即用的话保存于-20℃冰箱中。
4、感受态细胞制备
感受态细胞的制备使用takara公司的competentcellprepatationkit试剂盒制备，步骤如下：
(1)用接种针挑取大肠杆菌在含氨苄青霉素(amp，终浓度为100μg/ml)的lb固体培养基上分级划线，以能够出现单菌落为宜，37℃过夜培养。
(2)挑取菌落置于含20ml液体lb培养基的三角烧瓶中，37℃、220rpm培养。
(3)测定od值，当od600值达到0.35～0.5时，放置冰中停止培养，若od值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率。
(4)取1ml上述菌液于1.5mlep管中，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(5)在每个ep管中加入100μl冰中预冷的solutiona，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡，4,000rpm、4℃离心5min，弃上清(尽量除去上清)。
(6)在每个ep管中加入100μl冰中预冷的solutionb，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。感受态细胞制备完成，若不立即使用，置于-80℃保存。
5、touchdownpcr产物的连接、转化和测序
(1)从-80℃冰箱中取100μl感受态细胞悬液，冰中使其解冻。
(2)将4.5μl回收的pcr产物、1.5μlpmd18-t(simplevector)和4μlsolutioni转化酶(takara公司生产)加入100μl感受态细胞中混匀，16℃水浴连接3h。
(3)加入连接后的重组dna溶液轻轻摇匀，冰上放置30min。
(4)42℃水浴中放置90s，之后迅速置于冰上冷却15min。
(5)向管中加入1mllb液体培养基(不含氨苄青霉素)，混匀后37℃、250rpm振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，以表达质粒编码的抗生素抗性基因(ampr)。
(6)取1ml上述菌液6,000rpm离心5min，去除约1ml上清，剩下的混匀。取100μl涂布于含氨苄青霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h。
(5)用接种环挑选长出的单菌落放于1mllb培养基(加入1μl氨苄青霉素，终浓度为100μg/ml)中，37℃、250rpm摇菌直至菌液变浑浊(4～10h)，每组选取1个送去测序。
测序得到streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因保守序列的测序结果，其序列如下：
(a)核苷酸序列如seqidno：2所示(243bp)。
(b)ncbi核苷酸序列比对结果
将该核苷酸序列在ncbi数据库上进行比对(blast)，发现该保守序列与同为10家族的木聚糖酶(streptomycesdavawensisstrainjcm4913)具有83％的较高相似性，可推断克隆的保守序列所在的基因属于10家族木聚糖酶基因。
6、tail-pcr克隆木聚糖酶基因保守序列的上下游基因
(1)tail-pcr是为了得到streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因保守序列上游和下游的基因，使用primerpremier5.0软件设计特异性引物和随机引物。根据touchdownpcr产物测序所得到的保守序列，分别设计2组20bp左右的上下游特异性引物，每组上游特异性引物(upstreamprimer，简称usp)和下游特异性引物(downstreamprimer，简称dsp)各有3个嵌套的引物用于tail-pcr的三轮反应。同时设计出7对随机引物(arbitrarydegenerateprimer，简称ad)。保守序列和引物序列见表2。引物送去合成后，即可进行下一步实验。
表2streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因保守序列及用于tail-pcr的引物
(2)tail-pcr克隆上游基因
使用takara的pcramplificationkit试剂盒，以基因组dna为模板，按照如下反应体系配制pcr反应液：
然后按照以下条件进行第一轮tail-pcr反应：
第二轮tail-pcr反应体系同第一轮，但是将第一轮反应的pcr产物用ddh2o稀释100倍后作为模板dna，usp1换为usp2，反应条件如下：
第三轮tail-pcr反应体系同第一轮，但是将第二轮反应的pcr产物用ddh2o稀释100倍后作为模板dna，usp2换为usp3，反应条件同第二轮反应的一样。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮pcr产物进行检测。
通过3个嵌套的上游特异性引物和随机引物ad3进行tail-pcr，克隆出streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因保守序列的上游基因，其pcr产物电泳图如图10所示。从图10中可以看出，经过3轮pcr，此时出现的明显条带只有一条，大小约为600bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列上游基因。通过pcr产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因保守序列上游基因测序结果如下(728bp)：其核苷酸序列如seqidno：3所示。
(3)tail-pcr克隆下游基因
反应体系、反应条件同上游基因的克隆，相应的上游特异性引物换为下游特异性引物。反应结束后，采用1％琼脂糖凝胶电泳对第三轮pcr产物进行检测。
通过3个嵌套的下游特异性引物和随机引物ad3进行tail-pcr，克隆出streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因保守序列的下游基因，其pcr产物电泳图如图11所示。从图11中可以看出，经过3轮pcr，此时出现的明显条带只有一条，大小约为750bp，符合目标基因大小要求，初步确定为保守序列下游基因。通过pcr产物回收、连接、转化并测序。
经过测序，streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因保守序列下游基因测序结果如下(711bp)：其核苷酸序列如seqidno：4所示。
7、获得streptomycessp.wmn-3木聚糖酶基因全长序列
根据tail-pcr克隆得到的保守序列上下游基因的测序结果进行拼接，得到streptomycessp.wmn-3木聚糖酶完整的酶基因序列。其核苷酸序列如seqidno：5所示。
碱性木聚糖酶基因序列为一个完整的开放阅读框(orf)，该开放阅读框以起始密码子atg开始而以终止密码子taa结束，共包括1476个核苷酸。其中，前75个核苷酸为信号肽编码序列。
碱性木聚糖酶基因编码的氨基酸序列如seqidno：6所示。
经dnassistversion2.2软件分析得到，碱性木聚糖酶基因开放阅读框编码491个氨基酸，其中，前25个氨基酸为基因编码的信号肽，其在成熟酶蛋白分泌时在gly25位点被切除。因此，成熟的酶蛋白，共计466个氨基酸，其理论分子量(mwt)为50.23kd。
根据序列分析结果结合酶蛋白在分子量及酶学特性等方面的差异判断，碱性木聚糖酶基因wmn-3为一新发现的内切β-1,4-木聚糖酶基因。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>深圳大学
<120>一种嗜碱链霉菌及其产生的碱性木聚糖酶和应用
<160>21
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1540
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>streptomycessp.wmn-3菌株的16srdna序列
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cag243
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<223>碱性木聚糖酶wmn-3基因保守序列上游基因的核苷酸序列
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<210>6
<211>491
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<223>碱性木聚糖酶wmn-3基因编码的蛋白质的氨基酸序列
<400>6
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argaspalaalagluargserglyargthrpheglyvalalatyrala
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