本发明公开了一种新型水产养殖用复合菌剂发酵、扩培方法及其应用，属于饲料添加剂、水产养殖水体水质改善和微生物技术领域。
背景技术：
中国是目前世界最大的水产品养殖国，也是世界上唯一养殖产量超过捕捞产量的国家。为了避免污染水域环境和确保水产养殖业的健康可持续发展，我国水产业将从数量型向质量效益型转变，大规模、集约化的养殖模式逐渐代替了原有粗放型养殖模式，高密度养殖过程中饵料、空间竞争以及残饵、粪便的积累直接导致养殖水体水质恶化、严重富营养化，养殖水体中氨氮和亚硝酸盐等超标，对水体动物产生毒害作用。其次导致养殖环境中有害微生物大量滋生，使养殖动物免疫力下降，并最终导致养殖病害频繁爆发，进而导致水产品品质下降等问题，病害问题已严重困扰着广大养殖者并阻碍了水产养殖业健康可持续发展。同时工业废水、生活污水的排放也使养殖水域环境质量日益下降，氨氮含量过高是水体污染和富营养化的主要因素之一，如何改善养殖水质成为水产养殖成败的关键问题之一。
实践证明，利用微生物分解有毒有害物质的生物修复技术是治理大面积污染区域的一种低价有效的方法，接种外源性高效微生物、添加微生物营养盐、提供电子受体、提供共代谢底物以及提高生物可利用性是促进生物修复的几大措施。微生物制剂不仅可以改善养殖水域环境，其具有高效率、低成本、无二次污染的脱氮性能，提高养殖对象的机体免疫力，减少病害的发生，使养殖活动向着良性循环方向发展。近年来，益生菌剂以其无毒害、无残留等优点，受到人们关注，在水产养殖中得到了广泛的应用，包括了饲料添加剂、池塘水质净化剂的应用。
乳酸菌是常用的益生菌，发酵过程中可产生亚硝酸盐还原酶和有机酸。在水产养殖上主要用于饲料添加剂，通过降解碳水化合物生成乳酸和其他有机酸，使养殖动物肠道内的ph值下降，从而抑制有害菌繁殖，提高鱼虾的生长性能和消化酶活性，改善其非特异性免疫力。乳酸菌也可促使养殖水体饵料生物大量繁殖、生长，并且可分解残饵、粪便及水中有机质，改良水质，抑制水体中有害菌的繁殖生长。但若乳酸菌活菌数低，则不易在水环境中成为优势菌群，无法发挥其功效。酵母菌是单细胞真菌，营养成分含量高，广泛用于饲料添加剂，可以在消化道内大量繁殖，使其在与有害菌生存竞争中成为优势种群，有效抑制有害病原菌的生长。因此，酵母菌与多种乳酸菌联用，在水产养殖中的应用具有很好的前景。然而微生物制剂受温度、外界条件影响交大，现有乳酸菌系列菌剂多采用单一温度来发酵，代谢产物种类及数量均有限，保质期短，储存过程中活性不断降低，产品质量难以保障。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种发酵周期短、适宜温度范围广，产品活性稳定，工艺简单、适合养殖户自产、自用新型水产养殖用复合菌剂。本发明的另一个目的是公开了本发明所提供的复合菌剂在养殖水体水质改良中的用途。
本发明使用的菌株是由发明人分离筛选出的4株菌复合而成。复合菌剂由植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌、巴氏比赤酵母和液体培养基制成，菌剂ph≤4.0，活菌数各为6×108-3×1010cfu/ml。其中的四种菌均已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，植物乳杆菌保藏编号为cgmccno.15024，泡菜样品中分离得到，革兰氏阳性杆菌，无芽孢，通过16srdna分析鉴定，与其它公布的植物乳杆菌16srdna序列同源性为99%，鉴定为植物乳杆菌；肠膜明串珠菌，保藏号为cgmccno.15023，泡菜样品中分离得到，革兰氏阳性球菌，不运动，无芽孢，兼性厌氧菌，生长温度范围2℃-37℃，耐酸性极强，通过16srdna分析鉴定，与其它公布的肠膜明串珠菌16srdna序列同源性为99%；乳酸片球菌，保藏号为cgmccno.5959，已在发明专利授权号201210110496.9中应用，呈圆球状，在直角两个平面交替分裂形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，产酸，兼性厌氧。在mrs培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。接触酶阴性，不产细胞色素。所述保藏号为cgmccno.5960的巴氏比赤酵母菌，已在发明专利授权号201210110496.9中应用，具有高温发酵能力，能在60℃的温度下快速分解乳酸、氨基酸、有机物、蛋白质等基质，相比其他酵母菌繁殖能力更强，该菌能够和乳酸菌共存，对促进乳酸菌增值具有很重要的意义。
所述4种微生物的鉴定均参照《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16srdna基因序列在genbank中的检索。
1、权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成：
植物乳杆菌菌剂3-4份；
肠膜明串珠菌菌剂3-4份；
乳酸片球菌菌剂3-4份；
巴氏比赤酵母菌剂2-3份；
其中，菌剂ph≤4.0，活菌数各≧6×108-3×1010cfu/ml。
2、如权利要求1所述水产养殖复合菌剂方法，其特征在于该菌剂的制备方法按以下步骤实
现：（1）将权利要求2中所述的四种菌分别接种于固体培养基上进行活化；（2）挑取四种活化好的菌种的单菌落分别接种于各自的液体培养基上，在温度37℃条件下培养48小时；（3）把（2）中培养好的菌种按权利要求书2中的配比接种到发酵罐中37℃发酵24小时，制成菌体悬液，菌液ph≤4.0，活菌数≧6×108-3×1010cfu/ml，即制备完成复合菌菌剂产品，对菌剂进行质检，合格后灌装，阴凉干燥处保存。其中步骤（1）中固体培养基为每1000ml由蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0g，葡萄糖(c6h12o6·h2o)20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠（ch3coona·3h2o）5.0g，磷酸氢二钾（k2hpo4·3h2o）2.0g，硫酸镁（mgso4·7h2o）0.58g，硫酸锰（mnso4·h2o）0.25g，琼脂18.0g和1000ml蒸馏水组成。步骤（2）中液体培养基每1000ml由蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0g，葡萄糖(c6h12o6·h2o)20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠（ch3coona·3h2o）5.0g，磷酸氢二钾（k2hpo4·3h2o）2.0g，硫酸镁（mgso4·7h2o）0.58g，硫酸锰（mnso4·h2o）0.25g和1000ml蒸馏水组成。
3、制备如权利要求1所述复合扩培菌剂方法，其特征在于该菌剂在淡水中的制备方法按以下步骤实现（以扩培100l为例）：
（1）将100升塑料白桶挪至室外阳光直射处（夏季温度大于25℃，冬季可室内扩培，需加热使扩培温度保持10℃到30℃之间），向桶内加入50l左右的干净水（可以是井水或自来水，自来水需晾晒一段时间防止自来水中的余氯对菌的生长破坏）；（2）将称好的培养基、2公斤红糖、权利要求书1中的5l复合益生菌菌剂产品加入100l白桶内，用干净的棍子搅拌均匀，然后向塑料白桶内注水至满，密封发酵3天至发酵液ph≤5.0即可，如遇温度低于20℃或阴雨天气，ph未达到预期效果，可适当延长一到两天扩培时间。其中步骤（2）中液体培养基每1000ml由蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0g，葡萄糖(c6h12o6·h2o)20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠（ch3coona·3h2o）5.0g，磷酸氢二钾（k2hpo4·3h2o）2.0g，硫酸镁（mgso4·7h2o）0.58g，硫酸锰（mnso4·h2o）0.25g和1000ml蒸馏水组成。
4、利要求1所述的复合菌剂在海水中的扩培，其特征在于：制备如权利要求1所述复合扩培菌剂方法，其特征在于该菌剂的制备方法按以下步骤实现（以扩培100l为例）：
（1）将100升塑料白桶挪至室外阳光直射处（夏季温度大于25℃，冬季可室内扩培，需加热使扩培温度保持10℃到30℃之间），向桶内加入50l左右的海水；（2）将称好的培养基、2kg红糖、权利要求书1中的5l复合菌剂产品加入100l白桶内，用干净的棍子搅拌均匀，然后向塑料白桶内注海水至满，密封发酵3天至发酵液ph≤5.0即可，如遇温度低于20℃或阴雨天气，ph未达到预期效果，可适当延长一到两天扩培时间。其中步骤（2）中液体培养基每1000ml由蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵[(nh4)2hc6h5o7]2.0g，葡萄糖(c6h12o6·h2o)20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠（ch3coona·3h2o）5.0g和1000ml蒸馏水组成。
5、要求1所述的复合菌剂使用方法，其特征在于：该菌剂可以拌喂或直接泼洒入养殖水体。
具体使用方法：（1）将权利要求1所述的复合菌剂按饲料重量的1%～3%添加到饲料中（可用干净的水将该复合菌剂稀释后再与饲料混拌均匀），每日添加2次，早晚各一次，菌剂与饲料需提前1-2小时预混，使菌剂完全浸入到待投喂的饲料中，投喂时直接将混拌均匀的饲料投喂即可；（2）将权利要求1所述的复合菌剂按5－10l／亩直接泼洒入养殖池塘，水质较差时如蓝藻严重时可适当增加泼洒量。
附图说明
图1复合菌剂对传统土塘水体ph的影响。
图2复合菌剂对传统土塘水体亚硝酸盐的影响。
图3复合菌剂对水泥池塘水体ph的影响。
图4复合菌剂对水泥池塘水体亚硝酸盐的影响。
具体实施方式
实施例1：水产养殖复合菌剂的生产方法
1、水产养殖复合菌剂方法：（1）将权利要求2中所述的四种菌分别接种于固体培养基上进行活化；（2）挑取四种活化好的菌种的单菌落分别接种于各自的液体培养基上，在温度37℃条件下培养48小时；（3）把（2）中培养好的菌种按权利要求书2中的配比接种到发酵罐中37℃发酵24小时，制成菌体悬液，菌液中活菌数6×109cfu/ml，ph3.8，即制备完成复合菌剂发酵。
2、复合扩培菌剂产品生产方法（以扩培100l为例）：（1）将100升塑料白桶挪至室外阳光直射处，向桶内加入50l左右的干净水（可以是井水、自来或海水，自来水需晾晒一段时间防止自来水中的余氯对菌的生长破坏）；（2）将称好的培养基、2公斤红糖、5l上述复合菌剂产品加入100l白桶内，用干净的棍子搅拌均匀，然后向塑料白桶内注水至满，密封发酵3天至发酵液ph4.04即完成发酵。
实施例2：水产养殖复合菌剂对人工建造的水泥养殖池塘水质的影响
1、某水产养殖基地池塘菌剂应用前基本情况：
选取的5号塘、7号塘，水深1.5-2m，水面大小约为2亩／塘，池塘底部为水泥面，养殖品种为鲈鱼，鱼苗投放量3000尾。到8月1日试验开始时，2个池塘鱼的大小平均在350g－400g之间，饲料投喂量20kg／天／塘，其中饲料蛋白含量约45%，测得的原始亚硝酸盐值分别为1.16mg／l和1.06mg／l，ph值分别为8.79和8.56，蓝藻爆发严重。选取10号池塘为空白，不投放鱼苗的池塘，不泼洒菌剂，不投放饲料，8月1日原始ph检测值为8.80，亚硝酸盐＜0.04mg/l。复合菌剂泼洒过程中正常投喂饲料。
2、菌剂应用方案：
将上述实施例1中扩培完成的菌剂采用泼洒的方式进行，泼洒量为10l/亩。泼洒周期根据天气和水质情况泼洒。监测养殖水体ph和亚硝酸盐的变化，观察时间为8月1日－18日，总泼洒次数4次。泼洒第二天5号塘和7号塘亚硝酸盐开始呈下降趋势，至第18天亚硝酸盐从1.16mg/l和1.06mg/l分别下降至0.159mg/l和0.24mg／l，蓝藻情况从泼洒菌剂第3天开始蓝藻呈絮状漂浮，到第8天蓝藻全部消失。作为未做任何处理的10号池塘，呈现ph持续升高的趋势，第18天，池塘水ph9.63，大面积蓝藻漂浮。
3、应用效果
结果表明本发明复合菌剂对人工建造的水泥养殖池塘水体蓝藻抑制效果显
著，对外界环境变化抵抗能力强，对调节水体ph和亚硝酸盐也有明显的效果（见图1和图2）。并且复合菌剂在泼洒使用过程中，池塘鱼类生长正常，无不良反应，水体中的杂菌数量也得到了明显的抑制，为池塘养殖创造了一个安全、健康、无毒、无害的养殖环境。
实施例3：水产养殖复合菌剂对传统土塘养殖池塘水质的影响
1、某水产养殖基地池塘菌剂应用前基本情况：
分别选取北8号塘、北10号塘、南2号塘三个塘作为试验塘，池塘情况大致如下：北8号塘，水面积10亩，水深2米，鱼的大小平均在200-250g左右，数量15000尾；北10号塘，水面积12亩，水深2米，鱼的大小300g左右，数量16000尾；南2好塘，水面积6亩，水深2米，数量13000尾，大小300g左右。鱼的品种全部为白鱼，饲料投放量为鱼总重量的2%／天，饲料中的蛋白质含量约为40%。北8号塘、北10号塘、南2号塘三个塘测得的原始亚硝酸盐值分别为0.243mg／l、0.59mg／l和2.42mg／l，ph值分别为8.87、8.28和7.84，蓝藻爆发严重。
2、菌剂应用方案
将上述实施例1中扩培完成的菌剂采用泼洒的方式进行，泼洒量为5l/亩。泼洒周期根据天气和水质情况泼洒。监测养殖水体ph和亚硝酸盐的变化，试验周期2017.7.21-2017.8.18。
3、应用效果
结果表明本发明复合菌剂对传统土塘养殖水体蓝藻抑制效果显著，对外界环
境变化抵抗能力强，对调节水体ph和亚硝酸盐也有明显的效果（见图3和图4）。并且复合菌剂在泼洒使用过程中，池塘鱼类生长正常，无不良反应，为池塘养殖创造了一个安全、健康、无毒、无害的养殖环境。